Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography: A Robust Method for Quantitation of Fluorescently Labeled and Derivatized Sialic Acids Isolated from Mouse Liver
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Technieken
0 weergaven • 3:31 min • July 8th, 2025
Sialic acids, such as N-acetylneuraminic acid and N-glycolylneuraminic acid, are negatively charged carbohydrate moieties found at distal ends of oligosaccharide chains on mammalian cell surface.
To quantify relative amounts of these sialic acids in mouse liver tissue using reversed-phase high-performance liquid chromatography or RP-HPLC, first, treat the isolated sialic acid mixture with derivatization agent. The derivatization agent interacts with the functional groups of sialic acids, generating stable, fluorescent sialic acid derivatives.
Assemble an RP-HPLC column, connected to a fluorescence detector. The column comprises porous silica-based stationary phase bonded to non-polar, hydrophobic, alkyl chain ligands to facilitate selective interactions with sialic acid derivatives during chromatographic run.
Equilibrate the column using aqueous polar mobile phase containing low concentrations of acetonitrile, a less polar organic solvent, for optimal column conditioning.
Load the derivatized sialic acid mixture into the column.
N-acetylneuraminic acid, containing a hydrophobic N-acetyl group, adsorbs more strongly to the hydrophobic ligands of the stationary phase than N-glycolylneuraminic acid with a hydrophilic N-glycolyl group.
Analyze the samples, using a standard HPLC system connected to an online fluorescence detector. Use a reversed-phase C-18 column with a 250-millimeter length and 4.6-millimeter diameter for the analysis.
After preparing solvent A and solvent B, and setting up the HPLC run as detailed in the text protocol, inject 50 microliters of the sample into the HPLC system.
Monitor eluents, using the fluorescence detector excitation wavelength of 373 nanometers, and an emission wavelength of 448 nanometers.
Finally, calculate the relative amount of Neu5Gc as described in the text protocol.
Overzicht
Deze studie richt zich op de kwantificering van sialinezuren in leverweefsel van muizen met behulp van reversed-phase hogedrukvloeistofchromatografie (RP-HPLC). De methode omvat de derivatisering van sialinezuren om stabiele, fluorescerende derivaten te genereren voor analyse.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Analytische chemie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Siaalzuren zijn negatief geladen koolhydraten die op celoppervlakken voorkomen.
- Ze spelen een belangrijke rol bij cellulaire interacties en signalering.
- Kwantificering van deze verbindingen is essentieel voor het begrijpen van hun biologische functies.
- RP-HPLC is een krachtige techniek voor het scheiden en analyseren van complexe mengsels.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het kwantificeren van sialinezuren in leverweefsel van muizen.
- Het vergelijken van de adsorptiekenmerken van verschillende sialinzuren.
- Het verhogen van de detectiesensitiviteit met behulp van fluorescentie.
Gebruikte methoden
- Isolatie van sialinezuren uit leverweefsel van muizen.
- Behandeling met een derivatiseringsmiddel om fluorescerende derivaten te produceren.
- Gebruik van een reversed-phase C-18 kolom voor chromatografische scheiding.
- Monitoring van fluorescentie bij specifieke excitatie- en emissiegolflengten.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle derivatisering van sialzuren leidend tot versterkte fluorescentie.
- Aangetoonde verschillen in adsorptie tussen N-acetylneuraminezuur en N-glycolylneuraminezuur.
- Kwantitatieve analyse van sialzuren gerealiseerd met behulp van RP-HPLC.
- Methode gevalideerd voor gebruik in biologische monsters.
Conclusies
- De RP-HPLC-methode is effectief voor het kwantificeren van sialzuren in leverweefsel.
- Fluorescente derivatisering verbetert de detectiesensitiviteit aanzienlijk.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere biologische monsters voor de analyse van sialzuren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Kwantitatieve analyse van sialinzuren ondersteunt target-validatie in de glycobiologie en de ontdekking van biomarkers. Deze RP-HPLC-methode maakt nauwkeurige meting van Neu5Ac- en Neu5Gc-spiegels mogelijk, wat zorgt voor mechanische risicoreductie voor therapeutische hypothesen met betrekking tot het metabolisme van sialinzuren. De benadering verhoogt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door reproduceerbare, fluorescentiegebaseerde kwantificering te leveren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot biosyntheseroutes van siaalzuur te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve resultaten voor functionele targetvalidatie in ziekte-relevante systemen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid door meetbare veranderingen in Neu5Gc-niveaus na genetische perturbatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert stabiele, fluorescerende derivaten die geschikt zijn voor gestandaardiseerde assay-formaten.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via consistente derivatisering en chromatografische scheiding.
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele voor screeningscampagnes van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelateerde systemen door sialinezuren in leverweefsel van muizen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Faciliteert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie met gestandaardiseerde resultaten.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang via kwantificering op biomarkerniveau.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische screening, door kwantitatieve, op fluorescentie gebaseerde metingen van sialinezuur te bieden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways in het sialinezuurmetabolisme.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via reproduceerbare derivatisering en chromatografische scheiding.
- Analytics: Biedt kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen bij 373 nm excitatie en 448 nm emissie voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit via meetbare sialinezuurspiegels in biologische monsters.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor sialinezuuranalyse in meerdere weefseltypes en modellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in target-validatie door nauwkeurige Neu5Ac/Neu5Gc-kwantificering.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde derivatisering en RP-HPLC-condities.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanische ambiguïteit bij glycobiologie-targets.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van kwantitatieve sialinezuurbiomarkers.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in koolhydraatchemie en fluorescentiedetectie.
- Een RP-HPLC-systeem met C-18-kolom en fluorescentiedetector is vereist.
- Vereist standaardisatie van derivatiseringsprotocollen tussen teams.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen voor verschillende sialinezuurbronnen.
- Beperkt door de noodzaak van geoptimaliseerde mobiele fasecondities voor hydrofobe interactie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Een op maat HPLC Zuivering Protocol dat zijn vruchten High-zuiverheid Amyloïd Beta 42 en Amyloid Beta 40 Peptiden, in staat oligomeervorming
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Lectin HPLC-methode voor het selectief-geglycosyleerde Peptiden Enrich van complexe biologische monsters
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bepaling van Sialic Acids in Lever en Melk Monsters van Wild-type en
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026