Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

Het algemene doel van deze procedure is om de hoeveelheid en de structuur van elk Sfingomyeline-soort in biologische monsters nauwkeurig te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het lipideveld met betrekking tot lipidebiologie en lipiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een verscheidenheid aan Sfingomyeline-soorten in biologische monsters kunnen karakteriseren door middel van een chromatografie massaspectrometrie systeem. Om te beginnen, verwijdert u het kweekmedium uit een 10 centimeter weefselkweekschaal met HeLa-cellen en spoelt u de cellen twee keer met zes milliliter ijskoud PBS.

Voeg vervolgens een milliliter van de ijskoude PBS toe aan de 10 centimeter weefselkweekschaal en gebruik een cellscraper om de cellen te verzamelen. Zodra ze van het oppervlak van de schaal zijn verwijderd, brengt u de cellen over in twee milliliter siliconen plastic buisjes. Na centrifugatie verwijdert u het supernatant en voegt u een milliliter methanol toe aan elk celpelletieke.

Vortex vervolgens kort de buisjes. Plaats de monsters vervolgens in een badtype sonicator en soniceer gedurende vijf minuten op 200 watt. Wanneer u klaar bent, brengt u het volledige cellhomogenaat over in testbuisjes voorzien van Teflon gevoerde schroefdoppen.

Voeg nu een milliliter methanol, een milliliter chloroform, 0,8 milliliter dubbel gedestilleerd water in 50 microliter van 10 micromolair van een interne standaard toe aan elke testbuis. Sluit de buisjes en vortex ze krachtig gedurende vijf minuten op 2.500 tpm bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens nog eens een milliliter chloroform en een milliliter dubbel gedestilleerd water toe aan elke buis.

Vortex opnieuw de buisjes krachtig gedurende vijf minuten op 2.500 tpm bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de monsters om de waterige en organische fasen volledig te scheiden. Breng de onderste fase over in wegwerpbare glazen buisjes.

Voeg twee milliliter chloroform toe aan de testbuisjes. Vortex vervolgens de buisjes krachtig gedurende vijf minuten op 2.500 tpm bij kamertemperatuur om voldoende te mengen met de bovenste fase en interfasale fluff. Na een tweede centrifugatie, brengt u de gemodificeerde onderste fase samen met de initiële onderste fase over in de wegwerpbare glazen buisjes.

Plaats nu de glazen buisjes onder een stikstofstroom gedurende ongeveer 60 minuten en verwijdert u de organische oplosmiddelen in de verzamelde onderste fase volledig. Reconstitueer ten slotte de monsters met 500 microliter methanol of ethanol. Filter het resulterende mengsel met een 0,02 micron filter in glazen vials.

Bewaar vervolgens het monster bij min 20 graden Celsius. Voer seriële verdunningen van de standaardverbinding uit en voeg 50 microliter van elke concentratie toe aan afzonderlijke testbuisjes. Bereid vervolgens drie kwaliteitscontrole monsters door een hoeveelheid toe te voegen die binnen drie keer de onderste grens van de standaardcurve ligt voor het eerste monster, een hoeveelheid in de buurt van het midden van de curve voor het tweede monster en een hoeveelheid in de buurt van de bovenste grens van de standaardcurve voor het derde monster.

Voeg vervolgens het cellhomogenaat in één milliliter methanol toe aan elk testbuisje en extraheer de totale lipidefractie uit elk monster met behulp van de zojuist getoonde methode. Om te beginnen, bereidt u de mobiele fase. Meng acetonitril, methanol en dubbel gedestilleerd water samen in een verhouding van twee tot twee tot één voor de waterige fase.

Gebruik isopropanol voor de organische fase in glazen flessen met Teflon gevoerde schroefdoppen. Soniceer vervolgens beide mobiele fasen gedurende vijf minuten in een badtype sonicator. Voeg vervolgens voor zuur toe tot een eindconcentratie van 26,4 millimolair en ammoniumhydroxide op 14,9 millimolair in elke mobiele fase.

Voor kwalitatieve analyse, activeert u het hoogwaardige vloeistofchromatografiesysteem. Plaats inlaatbuisjes in de glazen flessen die de mobiele fasen bevatten en spoel de HPLC-lijnen. Verbind vervolgens een C18 HPLC-kolom met het HPLC-systeem.

Houd de temperatuur in de kolomoven op 50 graden Celsius en conditioneer de kolom met de waterige mobiele fase bij 100 microliter per minuut. Plaats tijdens de run de monsters in een monsterrek van de automatische monsternemer. Stel de parameters van het triple quadruple en quadruple lineaire ionenval massaspectrometriesysteem in voor een driedubbele massaspectrometrieanalyse zoals vermeld in tabel één en tabel twee van het bijgevoegde tekstprotocol.

Stel ook de parameters in voor de eerste en tweede precursor ionen van de SM-soorten van belang zoals beschreven in meer detail in het bijgevoegde tekstprotocol. Maak een batchbestand en dien het batchbestand in om de gegevens van MS drie product ionenspectra van elke Sfingomyeline-soort te verkrijgen door middel van vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrische analyse. Verkrijg de driefasige MS product ionenspectra van de Sfingomyeline-soorten van belang door middel van vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrieanalyse.

Ken vervolgens elke MS drie product ionenspectra van de Sfingomyeline toe door de massa-ladingsverhouding van de product ionenspectra te vergelijken met de exacte massa van de sphingoïde lange-ketenbase en n-acyl-groep van belang. Analyseer de Sfingomyeline kwantittief met behulp van vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrieanalyse zoals beschreven in het bijgevoegde tekstprotocol. Verwerk vervolgens de meerdere reactiebewakingsgegevens met behulp van de software voor data-integratie om de gegevens van de piekgebied voor de geëxtraheerde ionenchromatogram van elke Sfingomyeline-soort te verkrijgen.

Kwantificeer elke Sfingomyeline-soort en construeer de standaardcurves zoals beschreven in het bijgevoegde tekstprotocol. Het spectrum van zowel chemisch gesynthetiseerd Sfingomyeline als Sfingomyeline in lipidemonsters geëxtraheerd uit HeLa-cellen worden hier getoond. Opmerkelijk is dat de spectrumintensiteit van demethyleerd sphingosylfosforylcholine groter is dan die van de SM n-acyl-groep in beide monsters.