Name: Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer een LC-MS-methode voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse van sphingomyelinesoorten in biologische monsters. Deze techniek maakt precieze karakterisering van lipiden in HeLa-cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan (KAKENHI) naar K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) en een subsidie voor de studie van hardnekkige ziekte Project van het ministerie van Gezondheid, arbeid en welzijn (K.Y. #201510032A). Wij danken de Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript.

Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Draag handschoenen om te minimaliseren van monster besmetting door huid-afgeleide SM. Dit protocol werd toegepast op HeLa cellen gekweekt in Eagle's minimale essentiële medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1.000 U/L penicilline en streptomycine van 100 mg/L.
1. bereiding van de monsters van de lipide
Opmerking: Het is belangrijk dat alle glaswerk waaronder reageerbuisjes met Teflon beklede schroefdoppen wasmiddel-vrij zijn.
<ol><li>Extractie van totale lipide breuk van cel homogenaat met behulp van de Bligh & Dyer methode7<ol>
<li>Verwijderen van de cultuur (of geconditioneerd) media van de 10-cm weefselkweek schotel en spoel tweemaal met 6 mL ijskoud PBS.</li>
		<li>Voeg 1 mL ijskoud PBS in de weefselkweek 10-cm schotel P1000 Pipetteer. Oogst van de cellen met cel schrapers en verzamelen in 2.0-mL gesiliconiseerd plastic buizen.</li>
		<li>Na het centrifugeren (1000 × g, 5 min, 4 ° C), verwijder het supernatant door een pipet P1000.</li>
		<li>Voeg vervolgens 1 mL van methanol. Vortex buizen kort en bewerk ultrasone trillingen ten bij 200 W gedurende 5 min. in een bad-type ultrasoonapparaat. Opmerking: De waterstand in een bad-type ultrasoonapparaat zodanig aanpassen dat de cel pellet is efficiënt gehomogeniseerd.</li>
		<li>Breng de cel homogenaat in methanol Pipetteer in proefbuizen (13 mm x 100 mm) met Teflon beklede schroefdeksels.</li>
		<li>Voeg vervolgens 1 mL van methanol, 1 mL chloroform, 0,8 mL dubbel gedestilleerd water en 50 µL van 10 µmol/liter voor interne standaard d18:1 /(D31)-16:0 SM in elke proefbuis.</li>
		<li>Vortex reageerbuisjes krachtig gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: op dit punt, een enkele fase (chloroform/methanol/water = 1/2/0.8 (v/v/v)) wordt gevormd.</li>
		<li>Voeg vervolgens 1 mL chloroform en 1,0 mL dubbel gedestilleerd water.</li>
		<li>Vortex buizen krachtig bij 2500 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: op dit punt, de waterige fase van de (bovenste) en organische (lagere) fase zijn gescheiden.</li>
		<li>Na het centrifugeren (2,150 × g, 5 min, 25 ° C), verzamelen en breng de lagere fase in wegwerp glazen buizen (lagere beginfase). Opmerking: Verzamelen de lagere fase met behulp van een pipet van Pasteur en een pipet beveiligingsfilter. Breng de tip van de pipet in de lagere fase, knijp de kleine lamp naast de klep van de "E" om de bovenste fase en Interfaciale pluis binnen het uiteinde van de pipet te leveren, en vervolgens de lagere fase sifon in de pipet.</li>
		<li>Voeg 2 mL chloroform in de reageerbuisjes, en vortex de buizen krachtig bij 2500 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te voldoende mengen met de bovenste fase en Interfaciale pluis.</li>
		<li>Na het centrifugeren (2,150 × g, 5 min, 25 ° C), verzamelen en breng de gemodificeerde lagere fase in de wegwerp glazen buizen met de lagere beginfase zoals beschreven in stap 1.1.10.</li>
		<li>Plaats de glazen buizen onder een stroom van stikstof en volledig verwijderen van de organische oplosmiddelen in de verzamelde lagere fase.</li>
		<li>Reconstrueren van de monsters met 500 µL van methanol of ethanol, filtraat met een 0.02-µm filter, en op te slaan in glazen flesjes bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van de monsters voor de bouw van de kalibratiekromme en valideren van de methode<ol>
<li>Voeg 50 µL van 0.1, 0.5, 1, 5, 10 of 50 µmol/liter standaard compound (d18:1 /(D9)-18:1 SM) in reageerbuisjes met schroefdoppen Teflon-bekleed.</li>
		<li>Voeg cel homogenaat in elke proefbuis en meng 1 mL methanol. Nota: Het bedrag van de cel homogenaat als een matrix is afhankelijk van elk experiment. Als de SM soort in de monsters die zijn afgeleid van cellen in een schaal 10-cm cultuur routinematig worden geanalyseerd, moet het bedrag van de cel homogenaat in elke proefbuis dicht bij die van cellen in een cultuur van 10-cm schotel.</li>
		<li>Pak de Fractie van de totale lipide zoals beschreven in stappen 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Kwaliteitscontrole (QC) monsters voor de validatie van de methode, zoals lood in stappen 1.2.1-1.2.3 bereiden. Bereiden van drie QC-monsters met verschillende concentraties van standaard compound (d18:1 /(D9)-18:1 SM): een binnen 3 x de ondergrens van de standaard curve (QC-laag, QC-L), een in de buurt van het centrum (QC-midden, QC-M), en één in de buurt van de bovenste grens van de standaard curve (QC-hoog, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM analyse door LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Voorbereiding van de mobiele fase<ol>
<li>Meng de oplosmiddelen (acetonitril/methanol/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) voor de waterige fase en isopropanol voor de organische fase) in glazen flessen met Teflon beklede schroefdoppen en bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 5 min. in een bad-type ultrasoonapparaat.</li>
		<li>Toevoegen van mierenzuur (eindconcentratie 26.4 mmol/L) en NH4OH (14.9 mmol/L) in elke mobiele fase.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwalitatieve analyse van SM door LC-ESI-MS3<ol>
<li>De krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) systeem activeren, inlaat buizen gestoken door de glazen flessen waarin mobiele fasen en zuiveren de HPLC-lijnen. Een C18 HPLC-kolom (1,5 mm i.d. × 100 mm lengte, deeltje grootte 3.0 µm) een koppeling naar het HPLC-systeem, houden de temperatuur in de kolom oven bij 50 ° C en de conditie van de kolom met de mobiele waterfase bij 100 µL/min. de monsters gestoken een monster rek in de autosampl eh.</li>
		<li>Instellen van de parameters van de triple vierpolige en vierpolige lineaire ion trap massaspectrometrie systeem p.a. MS3 zoals vermeld in tabel 1 en tabel 2 , alsmede de voorloper van de eerste en tweede ionen van de SM-soorten van belang.<ol>
<li>Dubbelklik op het pictogram software voor data-acquisitie, dubbel klik op de 'hardwareconfiguratie', 'LC + QTRAP4500 + klep' te selecteren en klik op 'Profiel activeren'.</li>
			<li>Maak een nieuwe submap door te klikken op 'Nieuwe deelproject' en 'OK'.</li>
			<li>Klik op het tabblad 'bestand', selecteer 'Nieuw' en selecteer 'Overname methode' en 'OK'. Klik op het pictogram 'Massa Spec' en 'MS' tab. Selecteer Scan type als 'MS/MS/MS (MS3)', scannen tarief als 10.000 Da/s, polariteit als 'Negatief' en 'Duur' als de hele tijd te worden geanalyseerd (min). Stel de m/z van de 'Start (Da)' en 'Stop (Da)' als het bereik dat moet worden gescand. Stel de m/z van de voorloper van de 1ste en 2de ionen van het streefcijfer SM soorten van belang. Opmerking: Als u wilt analyseren meerdere SM-soorten, Markeer de '-MS3' pictogram, klik met de rechtermuisknop, selecteer 'Kopiëren dit experiment' en zet dan de m/z van de 1ste en 2de voorloper ionen van andere soorten SM.</li>
			<li>Selecteer het tabblad 'Geavanceerd MS', en elke parameter als volgt instellen: scanmodus als 'Profiel', stap-grootte als 0.12 (Da), resolutie Q1 en Q3 'Unit' en 'Verlichte', respectievelijk intensiteit drempel zo instelling tijd 0, 50 (ms), pauze tussen massa bereiken als 1,5 ms, selecteert u ' dynamische Vul de tijd ', Q3 toetredingsdrempel als 8 V, en excitatie tijd als 25 ms.</li>
			<li>Klik op de knop 'Parameters bewerken' in het tabblad 'MS' en selecteer 'bron/Gas' tab. Stel de parameters van de gordijn gas, botsing gas, ionspray spanning, temperatuur, ion bron gas1 en de gas2 zoals vermeld in tabel 1. Selecteer de tab 'Samengestelde' Stel de parameters van de declustering mogelijkheden, ingang potentieel botsing energie, excitatie energie en botsing energie verspreiden zoals vermeld in tabel 2.</li>
			<li>Markeer 'Geïntegreerde Valco klep' en selecteer 'Positie naam voor stap 0' als A en 'B' instellen als positie voor totaal 5.0 min tijd. Ook het instellen van 'A' als standpunt voor totaal 70,0 min tijd.</li>
			<li>Markeer 'Shimadzu LC systeem'. Selecteer het tabblad 'Pump' en stel pompen modus als binaire stroom, totale stroom als 0,28 mL/min en maximum van druk grenzen als 20,0 MPa. Selecteer het tabblad 'Autosampler' en het spoeldouche volume instellen als 200 µL naald lijn als 52 mm, spoelen als 35 µL/s snelheid, snelheid als 5.0 µL/s bemonstering, purge tijd 25.0 min, spoel duik tijd als 5 s, en spoelen modus als 'Voor en na aspiratie'.<ol>
<li>Daarnaast de koeler unit inschakelen, stellen de koelere temperatuur als 4 ° C en de controle flacon naald lijn 52 mm. Selecteer het tabblad 'Oven' inschakelen van de oven en bepalen de oventemperatuur en maximale temperatuur 50 ° C en 85 ° C, respectievelijk.</li>
				<li>Selecteer het tabblad 'Controller' en vink het vakje 'Inschakelen'. Selecteer het tabblad 'Programma' en stel de oplosmiddelen verlopen als volgt: oplosmiddelen A / B bij een verhouding van 100/0 voor 5 min, program lineaire aanpassingen tot en met 80/20 meer dan 4 min, tot en met 35/65 meer dan 50 min, en tot 25/75 meer dan 1 min. daarna , houd ze op 25/75 voor 10 min, dan lineair op 100/0 meer dan 4 min. Sla de methode.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Maak batchbestand<ol>
<li>Dubbelklik op het pictogram 'Bouwen overname Batch', klikt u op ' Voeg toe ', 'Voeg monsters', stel het aantal nieuwe monsters, en klik op 'OK'.</li>
			<li>Klik op de knop ' Method Editor' en selecteer de methode moet worden gebruikt. Indien meerdere methoden worden gebruikt in een batch-bestand, schakel het selectievakje 'Gebruiken meerdere methodes' en selecteer de methode van de overname voor elk monster. Naam van ' monster ', het juiste nummer voor 'Vial positie' ingesteld en zetten de hoeveelheid geïnjecteerde volume. Sla de batch-bestand.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verkrijgen van het product van de3 MS ion spectra van de SM-soorten van belang door LC-ESI-MS3 analyse<ol>
<li>Selecteer het tabblad 'Verzenden' in batch-bestand, Markeer de regel monsters worden geanalyseerd, en klik op de knop 'Verzenden'.</li>
			<li>Klik op de '' weergave Quene' pictogram, pictogram 'Uitgebalanceerd', selecteer de methode van de overname worden gebruikt, het instellen van Time 1 min, en klik op 'OK'.</li>
			<li>Deactiveren 'Reserve Instrument voor Tuning' door te klikken op het bijbehorende pictogram. Vervolgens batch-reeks uitvoeren door te klikken op het pictogram "Start monster".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elke MS3 product ion spectra van de SM toewijzen door het vergelijken van de massa te rekenen verhouding (m/z) van het product ion spectra en de exacte massa van de sphingoid LCB en N-acyl deel daarvan van belang. Bepalen van het aantal koolstofatomen en dubbele obligaties in de sphingoid LCB en N-acyl deel daarvan volgens de bijbehorende product-ionen.<ol>
<li>Bevestig dat de juiste deelproject map is geselecteerd, klik tweemaal klikken het pictogram 'Open bestand' en selecteer de monsters te analyseren. Sleep de piek in het chromatogram voor elk doel SM soorten en vervolgens tweevoudig tikken. De verkregen MS3 product ion spectra binnen het versleepte gebied zal worden gepresenteerd.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantitatieve analyse van de SM door LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Stel de mobiele fasen en de HPLC-kolom zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2.1.</li>
		<li>Instellen van de parameters van de triple vierpolige en vierpolige lineaire ion trap massaspectrometrie systeem voor meerdere reactie monitoring (MRM) analyse, zoals vermeld in tabel 1 en tabel 2.<ol>
<li>Het gedrag van de procedures zoals beschreven in stap 2.2.2.1 en 2.2.2.2.</li>
			<li>Klik op het tabblad 'bestand', selecteer 'Nieuw' en selecteer 'Overname methode' en 'OK'. Klik op het pictogram 'Massa Spec' en 'MS' tab. Selecteer Scan type als 'MRM', polariteit 'Positief'. 'Duur' instellen als de hele tijd te analyseren. Stel de m/z van [M + H]+ en 184 als 'Q1 massa (Da)' en 'Q3 massa (Da)' van het streefcijfer SM soorten van belang, respectievelijk. 'Tijd' als 10 ms en 'ID' als de naam van het doel SM soorten ingesteld.</li>
			<li>Selecteer het tabblad 'Geavanceerd MS', en elke parameter als volgt instellen: zowel van de resolutie Q1 en Q3 als 'Eenheid', intensiteit drempel als 0, instellen van de tijd als 0 (ms), en pauzeren tussen massa bereiken als 5 ms.</li>
			<li>Klik op de knop 'Parameters bewerken' in het tabblad 'MS' en selecteer de ' Bron/Gas' tab. Zet de parameter van gordijn gas, botsing gas, ionspray spanning, temperatuur, ion bron gas1 en gas2 zoals vermeld in tabel 1. Selecteer vervolgens de 'Samengestelde' tab. zetten de parameters van het declustering potentieel, ingang potentieel, botsing energie en botsing cel afrit potentieel zoals vermeld in tabel 2.</li>
			<li>Stel de klep zoals beschreven in stap 2.2.2.6.</li>
			<li>De LC-voorwaarde zoals beschreven in stap 2.2.2.7 instellen Sla de methode.</li>
		</ol>
</li>
		<li>De batch-bestand zoals beschreven in stap 2.2.3 maken</li>
		<li>Het verkrijgen van de gegevens van de MRM van elke soort van SM langs LC-ESI-MS/MS analyse zoals beschreven in stap 2.2.4.</li>
		<li>Verwerken van de gegevens van de MRM met behulp van de software voor gegevensintegratie en verkrijgen van de gegevens van piekoppervlakte voor de uitgepakte ion chromatogram van elke soort van SM.<ol>
<li>Dubbelklik op het pictogram software voor gegevensintegratie in kwantitatieve analyse, klik op het tabblad 'Bewerken' en selecteer gebruiker integratie in gebreke blijft. Gaussiaanse glad breedte als 1,0 punt instellen, en klik op 'OK'. Klik op het tabblad 'Bewerken' en selecteer 'Nieuwe resultaten tafel'. Selecteer het monster te worden geïntegreerd, klikt u op een knop met de pijl en klik op 'Next'. Selecteer 'Maak nieuwe methode', zet de naam van de methode en klik op 'Next'. Klik op 'Next' en vink het vakje van de d18:1 /(D31)-16:0 SM as IS, klik op 'Next' en klik op 'Voltooien'.</li>
			<li>Klik op 'Toont de piek herziening' en bevestig dat de chromatografische pieken naar behoren worden erkend. Opgemerkt moet worden dat de retentietijd van d18:1 /(D31)-16:0 SM is meestal kleiner door ~ 0,3 min ten opzichte van één van de 34-1-SM (bestaat meestal van d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kwantificeren van elke soort van SM volgens de verhouding van de piek van elke soort die SM zullen de d18:1 /(D31)-16:0 SM interne standaard.<ol>
<li>Klik op het tabblad 'Bestand', selecteer 'Exporteren', selecteer 'Resultaten tafel', bevestigen als 'MultiQuant', 'Alle kolommen exporteren' kolommen, rijen als 'Export alle rijen behalve die expliciet verborgen', en klik vervolgens op 'OK'.</li>
			<li>Open het geëxporteerde bestand in de Excel-software. Normaliseren van het gebied van het doel SM soorten door het gebied van IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Vervolgens vermenigvuldigt u met het theoretische bedrag van de IS in de ingespoten steekproef voor het berekenen van de hoeveelheid doel SM soort(en) in het ingespoten monster.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bouw van de standaard curve<ol>
<li>Verkrijgen van de gegevens van de MRM van d18:1 /(D9)-18:1 SM en d18:1 /(D31)-16:0 SM in de monsters voor de bouw van de standaard curve door LC-ESI-MS/MS-analyse, zoals beschreven in stap 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Verkrijgen van de gegevens van de piekoppervlakte van d18:1 /(D9)-18:1 SM en d18:1 /(D31)-16:0 SM zoals beschreven in stap 2.3.5.</li>
		<li>Berekent het bedrag van d18:1 /(D9)-18:1 SM in de ingespoten steekproef als beschreven in stap 2.3.6.</li>
		<li>De trendlijn construeren door de x-as en de y-as als de nominale bedrag en de berekende hoeveelheid d18:1 /(D9)-18:1 SM en het verkrijgen van de formule van de trendlijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Het valideren van de kwantitatieve methode met behulp van Excel software<ol>
<li>Voor de validatie van de methode, het kwantificeren van het bedrag van de d18:1 /(D9)-18:1 SM en d18:1 /(D31)-16:0 SM in de QC monsters door het analyseren van elke QC proef ten minste driemaal in 1 dag, en ten minste 3 dagen herhalen, zoals beschreven in stap 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Verkrijgen van de piek gebied gegevens en het berekenen van de hoeveelheid d18:1 /(D9)-18:1 SM in de ingespoten steekproef als beschreven in stap 2.3.5 en 2.3.6.</li>
		<li>Volgens de ijkcurve die is verkregen, berekent het bedrag van d18:1 /(D9)-18:1 SM in de ingespoten steekproef.</li>
		<li>Evaluatie van precisie<ol>
<li>Berekenen van het gemiddelde en de standaardafwijking van de hoeveelheid d18:1 /(D9)-18:1 SM verkregen in 2.5.3 stap op de dataset voor de intra-day en inter dag met behulp van Excel software.</li>
			<li>De gemiddelde verkregen in stap 2.5.4.1 gedeeld door de standaardafwijking, en uitgedrukt als %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Evaluatie van nauwkeurigheid<ol>
<li>De nauwkeurigheid van elke gegevens als volgt berekenen: [(Het berekende bedrag verkregen in stap 2.5.3.) / (Nominale bedrag) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Bereken het gemiddelde van de absolute waarde van de nauwkeurigheid van de dataset van de intra- en inter dag.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li>
<li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li>
<li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+degradation+pathways%2C+functions%2C+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li>
<li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipidomics%3A+high-throughput%2C+structure-specific%2C+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li>
<li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li>
<li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/10.1139/o59-099#.WlOY-N-nHIU">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS%2FMS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability%2C+data+quality%2C+and+assay+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+dissociation%3A+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li>
<li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li>
<li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li>
<li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen conflict van belang hebben.

In de huidige kwalitatieve methode, verkregen we MS3 product ionen een SPC en een N-acyl deel daarvan. Het is essentieel voor het correct toewijzen van zowel een SPC en een N-acyl deel daarvan. Te dien einde moet opgemerkt worden dat andere phosphorylcholine-bevattende moleculen kunnen ook worden gedetecteerd als MS3 product ionen. Diacyl-dunlaag (PC) en plasmalogen-PC zijn overvloedig aanwezig in cellen van zoogdieren, en hun hydrophobicity is vergelijkbaar met die van SM. Daarom,...

Sphingomyelinase (SM) is een gemeenschappelijk sfingolipiden bij zoogdiercellen. SM is gesynthetiseerde intracellulair1 en heden als een voorloper voor andere sfingolipiden zoals een sphingosine-1-fosfaat en een ceramide, die hebben een cruciale rol in immuun cel mensenhandel en huid barrière homeostase, respectievelijk2, 3. De nauwkeurige analyse van de SM-metabolisme is dus belangrijk voor het ophelderen van de functies van het fysiologische en pathologische van sfingolipiden.
SM is samengesteld uit een ceramide en een phosphorylcholine die is gekoppeld aan de 1-hydroxy groep van het ceramide, dat verder uit een sphingosine en een N bestaat-acyl deel daarvan. Een verscheidenheid in de koolstof- en dubbele binding getallen in zowel de sphingosine en N-acyl deel daarvan resulteert in het aantal ceramide (en SM) soorten. Recente vooruitgang in LC-ESI-MS/MS heeft kwantitatieve en kwalitatieve analyse van SM4,5. In de kwalitatieve analyse, werd het aantal koolstof en dubbele bindingen van een sphingoid LCB van SM geïdentificeerd door product ion spectra van LCB toe te wijzen. Echter structuurgegevens van de N-acyl deel daarvan was niet direct verkregen omdat de bijbehorende product-ionen zijn niet gemeld, en dan ook N-acyl wordt werden afgeleid door differentiële analyse tussen voorloper ionen en product ionen overeenkomt met LCB in zowel positieve als negatieve ion modi4,5. In dit rapport presenteren we een methode voor het detecteren van de product-ionen van LCB zowel N-acyl groep gelijktijdig in MS3 modus met behulp van triple vierpolige en vierpolige lineaire ion trap massaspectrometrie, dat de precieze structuur vergemakkelijkt speculatie van elke SM soorten6.
De ion onderdrukking (of toebehoren) effecten, veroorzaakt door de matrix in biologische monsters belemmeren de nauwkeurige kwantificering in LC-ESI-MS-analyse, en daarom is het wenselijk voor de bouw van de kalibratiekrommen voor alle analyten van belang in de identieke matrix van het biologische monster. Deze strategie is echter niet haalbaar omdat het bijna onmogelijk om te bereiden alle SM soorten in biologische monsters, met name in de uitgebreide analyse is. Dus, het is praktisch om te bouwen van een kalibratiekromme en de kwantitatieve bereik met behulp van een representatieve soorten van de SM in de biologische monsters spiked bepalen. Wij twee ionenpaar-geëtiketteerden SM soorten gebruikt voor de constructie van een ijkcurve; een werd gebruikt voor een interne standaard en de andere voor een samengestelde norm. We een kleine hoeveelheid ionenpaar-geëtiketteerden SM soorten gedetecteerd als een standaard compound spiked in biologische monsters en verkregen met succes een kalibratiekromme en de kwantitatieve bereik6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm weefselkweekschaal</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Celschraper</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Gesiliconiseerde 2,0 mL buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Reageerbuis</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Schroefdop met teflonvoering</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Kikkerglas</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &micro;m 1,5 mm I.D. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>Guard cartridge wordt in cartridgehouder geplaatst en gekoppeld aan C18-kolom</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Cartridgehouder</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropyl Alcohol)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Ammoniakwater</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (badtype)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer voor glazen reageerbuis</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1,4 mL glazen flesje</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Stellen worden opgeslagen in 1,4 mL glazen flesje verzegeld met schroefdop en 8 mm septum bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>8 mm septum</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>Wanneer monsters worden geanalyseerd, worden schroefdoppen vervangen door schroefdoppen met gesplitst septum</td></tr><tr><td>Schroefdop voor 1,4 mm glazen flesje</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Schroefdop met gesplitst septum</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0,22 &micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Triple quadrupole en quadrupole lineaire ionenval massaspectrometrie</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>De software voor gegevensverwerving en analyse van productionenspectra</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>De software voor gegevensintegratie in kwantitatieve analyse</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-systeem</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Glasfles</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sphingomyeline</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosylfosforylcholine</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline en streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&rsquo;s minimum essentieel medium</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door lc-ms met behulp van twee stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Presenteren we een methode voor het analyseren van sphingomyelinase (SM) kwalitatief en kwantitatief door vloeibare chromatografie-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). SM is een gemeenschappelijk sfingolipiden samengesteld uit een phosphorylcholine en een ceramide als de hydrofiele en hydrofobe component, respectievelijk. Een aantal soorten SM in zoogdiercellen wegens een verscheidenheid in de sphingoid lange keten base (LCB) aanwezig zijn en een N-acyl deel in het ceramide. In dit verslag, tonen we een methode voor het schatten van het aantal koolstof en dubbele bindingen in een LCB en een N-acyl groep op basis van hun overeenkomstige product-ionen in MS/MS/MS (MS3) experimenten. Daarnaast presenteren wij een kwantitatieve analysemethode voor SM met behulp van twee stabiele ionenpaar gelabelde SM soorten, dat vergemakkelijkt het meetbereik in SM kwantificatie bepalen. De huidige methode zal zitten nuttig in karakterisering van een verscheidenheid van SM soorten in biologische monsters en industriële producten zoals cosmetica.

Chemisch gesynthetiseerd d18:1 / 24:0 SM (Figuur 1A) en d18:1 / 24:0 SM in lipide monsters HeLa cellen (Figuur 1B) is onttrokken werden geanalyseerd door LC-ESI-MS3 tewerkstellen [M + HCOO]- en [M-CH3]- als eerste en tweede voorloper ionen, respectievelijk. Merk op dat de intensiteit van het spectrum van demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (<...

Hier presenteren we een protocol te kwantificeren en kwalificeren van elke soort van de sphingomyelinase met behulp van meerdere reactie controle en MS/MS/MS mode, respectievelijk.

Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Het algemene doel van deze procedure is om de hoeveelheid en de structuur van elk Sfingomyeline-soort in biologische monsters nauwkeurig te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het lipideveld met betrekking tot lipidebiologie en lipiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een verscheidenheid aan Sfingomyeline-soorten in biologische monsters kunnen karakteriseren door middel van een chromatografie massaspectrometrie systeem. Om te beginnen, verwijdert u het kweekmedium uit een 10 centimeter weefselkweekschaal met HeLa-cellen en spoelt u de cellen twee keer met zes milliliter ijskoud PBS.Voeg vervolgens een milliliter van de ijskoude PBS toe aan de 10 centimeter weefselkweekschaal en gebruik een cellscraper om de cellen te verzamelen. Zodra ze van het oppervlak van de schaal zijn verwijderd, brengt u de cellen over in twee milliliter siliconen plastic buisjes. Na centrifugatie verwijdert u het supernatant en voegt u een milliliter methanol toe aan elk celpelletieke.Vortex vervolgens kort de buisjes. Plaats de monsters vervolgens in een badtype sonicator en soniceer gedurende vijf minuten op 200 watt. Wanneer u klaar be

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

Dit protocol zal de extractie en analyse van vrije en geësterde bioactieve vetzuren uit cellen demonstreren. Vetzuren worden nauwkeurig gekwantificeerd met behulp van stabiele isotoopverdunning, chirale vloeistofchromatografie, electronenvangst-atmosferische chemische ionisatie-meervoudige reactiebewaking massaspectrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

We presenteren een methode voor het gebruik van MALDI massaspectrometrie en reductieve methylatie chemie op veranderingen in de lysine-methylatie te kwantificeren.

Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit

Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Hier laten we geïsoleerde humane bloedplaatjes kan worden gebruikt als een toegankelijke ex vivo model metabole aanpassingen studeren in reactie op de remmer complex I rotenon. Deze benadering maakt gebruik van isotopische tracering en relatieve kwantificatie door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en kan worden toegepast op een verscheidenheid van studieopzetten.

LC-MS analyse van menselijke bloedplaatjes als een platform voor het bestuderen van mitochondriaal Metabolisme

Veel voorspelde (fosfo)lipasen zijn slecht gekarakteriseerd met betrekking tot hun substraatspecificiteit en fysiologische functies. Hier bieden we een protocol om enzymactiviteiten te optimaliseren, naar natuurlijke substraten te zoeken en fysiologische functies voor deze enzymen voor te stellen.

Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten met gevestigde rollen bij menselijke ziekten. Het karakteriseren van veranderingen in weefsels met massaspectrometrie kan rollen in de ziekte-etiologie onthullen of therapeutische doelen identificeren. De OCT-verbinding die wordt gebruikt voor cryopreservatie in biorepositories interfereert echter met massaspectrometrie. We schetsen methoden om sfingolipiden in menselijke weefsels ingebed in OCT te analyseren met LC-ESI-MS / MS.

Voorbereiding van menselijke weefsels ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding voor massaspectrometrie-analyse

Hier wordt een methode gepresenteerd voor het screenen van lipidestructuren door middel van stabiele isotopenlabeling door gebruik te maken van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatie.

De novo lipiden traceren met behulp van stabiele isotopenetikettering LC-TIMS-TOF MS/MS

Leer een LC-MS-methode voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse van sphingomyelinesoorten in biologische monsters. Deze techniek maakt precieze karakterisering van lipiden in HeLa-cellen mogelijk.

Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

Meer video's verkennen