De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt
17 september 2011
Een methode om translationeel actief, intact synaptoneurosomes (SNS) voor te bereiden van de hersenen van muizen cortex wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt waardoor voor de snelle bereiding van actieve SNS.
Het algemene doel van deze procedure is om translationeel actieve synaptische naar neuro zones uit de muizenhersenschors voor te bereiden, met behulp van een discontinue peral sucrose dichtheidsgradiënt. Dit wordt bereikt door eerst de muizenschorsen te verzamelen en te homogeniseren, en vervolgens het homogenaat te centrifugeren. Hierna wordt het centrifugaat homogenaat of sup natant toegepast op de voorbereidde per co sucrose gradiënten.
De laatste stap is om de synaptosoomfractie te centrifugeren en te verzamelen. Uiteindelijk tonen western blot-analyse en S 35 methionine-incorporatie-experimenten aan dat de synaptosoomfractie synaptisch verrijkt en translationeel actief is. De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals centrifugatie en filtratie zijn dat ten eerste mechanisch letsel wordt vermeden door gebruik te maken van dichtheidsgradiënten, en ten tweede per call een lage toxiciteit heeft voor cellen in hun bestanddelen.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen met dit protocol omdat timing een sleutelrol speelt. Zodra de cortexsen zijn geoogst, moet de procedure snel worden voltooid. Om de procedure te starten, bereid de 3, 10, 15 en 23%-gradiëntlagen voor door de respectieve hoeveelheden SIP toe te voegen zoals beschreven in het bijbehorende manuscript aan GM buffer en goed te mengen.
Giet gradiëntlagen door twee milliliters van elk van de 23 15, 10 en 3%-isosmotische perol oplossingen te pipetten in de Beckman centrifugebuizen met doppen. Gebruik een P 1000 pipet om ervoor te zorgen dat het grensvlak tussen de lagen duidelijk herkenbaar is zonder menging van de lagen. Bewaar de gradiënten bij vier graden Celsius gedurende minimaal 20 minuten voor gebruik.
Voordat u met deze procedure begint, bereidt u andere noodzakelijke oplossingen voor zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Euthanasie de muis op de leeftijd van P 13 tot P 21 en bereid deze voor op dissectie door de achterkant van de nek en het hoofd te besproeien met 70%ethanol. Gebruik vervolgens een paar scherpe schaar om door het ruggenmerg aan de basis van de schedel te snijden.
Vervolgens verwijdert u de huid van de bovenkant van de schedel. Snijd de schedel lateraal tussen het pariëtale bot en het interpariëtale bot, of tussen de hersenhelften en de cortexgebieden. Snijd daarna de schedel van de basis naar de neus langs de sagittale naad.
Bij deze stap verwijdert u voorzichtig het zachte pariëtale bot door elke hemisfeer naar de zijkant te trekken. Steek vervolgens de spatel in de hersenen boven het cerebellum om de cortex eruit te scheppen. Plaats deze in ijskoud GM-buffer en herhaal de procedures opnieuw om meer cortexsen te verzamelen.
Spoel nu de cortexsen in ijskoud GM-buffer. Breng vervolgens twee cortexsen over naar een glazen homogenisator met vijf milliliter koude GM-buffer. Homogeniseer de cortexsen voorzichtig met vijf tot 10 bewegingen van stamper A, de losse stamper, gevolgd door vijf tot 10 bewegingen van stamper B, de type stamper.
Het aantal bewegingen varieert afhankelijk van de individuele homogenisator. Breng het homogenaat over naar een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer het bij 1000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een Allegra zes KR centrifuge om cellulaire deeltjes en kernen te pelleten. Leg twee milliliter van de supernatant voor elke per of sucrose gradiënt met één gradiënt voor elke hele cortex en dop de buisjes. Centrifugeer ze vervolgens in een vaste hoek rotor bij 32.500 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius in een Beckman J 2 21 centrifuge.
Gebruik geschikte adapters wanneer voltooid, de gradiënt zou een sterke SN band moeten geven, pipet af en gooi de oplossing boven de SN band weg. Gebruik een glazen pasta pipet om de SN band af te pipetten op de 15 tot 23%-interface, een gradiënt geeft over het algemeen ongeveer 0,9 tot 1,1 milliliter sns. Breng het vervolgens over naar een conische buis en bewaar het op ijs.
Vervolgens past u de zoutconcentratie van de SNS aan door één tiende van het volume 10 keer stimulatiebuffer toe te voegen. Optioneel voegt u 1000 keer calciumchloride toe om een eindconcentratie van 12 ano molair te geven. Voeg vervolgens een millimolair TTX-voorraad toe om een eindconcentratie van één micromolair te geven om niet-specifieke excitatie te onderdrukken.
De volgende stap is om de SNS te gebruiken in de toepasselijke downstream-toepassing, zoals eiwittranslatiestudies. Voor andere toepassingen kan SN-lysaat worden opgeruimd of geconcentreerd met behulp van de Pierce SDS-paginamonstervoorbereidingskit. De eiwitconcentratie van de SNS kan worden bepaald met behulp van de micro BCA-eiwitanalysekit.
Hier is een voorbeeld van zes banden of fracties. Toen de muizenschors werd gehomogeniseerd en gescheiden op discontinu perol sucrose gradiënten, bevonden de verrijkte SNS zich in band vijf op de 23 tot 15%-interface, deze band werd verwijderd en onderzocht door middel van elektronenmicroscopie. Een voorbeeld van intacte synaptische blaasjes en de behoud van pre-synaptische en post-synaptische elementen worden hier in de western blot getoond.
Een toename van synaptische markers en een afname van onzuiverheden in de SN band van een discontinue per sucrose gradiënt bevestigen dat de toename van S 35 methionine-incorporatie bij toevoeging van glutamaat te wijten is aan de novo eiwitsynthese. 40 micromolair anesa mycine, een eiwitsynthese-remmer, werd toegevoegd. Deze figuur toont de duidelijke afname van S 35 methionine-incorporatie in aanwezigheid van anso mycine met of zonder glutamaat aanwezig in vergelijking met de basale niveaus.
Dus de discontinue peral sucrose gradiënten produceren snel zeer actieve en relatief pure SNS die kunnen worden gebruikt om eiwittranslatie te bestuderen. Deze figuur toont aan dat band vijf uit de discontinue per core sucrose gradiënt de hoogste niveaus van de novo eiwitsynthese bevat. De SNS bereid door gehomogeniseerd cortex door een reeks filters met afnemende poriëngrootte te laten lopen en vervolgens te centrifugeren over een discontinue per core sucrose grad
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het prepareren van translationeel actieve synaptoneurosomen (SNs) uit de hersenschors van muizen met behulp van een discontinu Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt. De techniek maakt een snelle preparatie mogelijk waarbij mechanische schade en toxiciteit tot een minimum worden beperkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Synaptoneurosomen zijn essentieel voor het bestuderen van de synaptische functie.
- Traditionele methoden kunnen mechanische schade aan de monsters veroorzaken.
- Dichtheidsgradiënten kunnen de toxiciteit voor cellen verminderen.
- Inzicht in de translationele activiteit in synapsen is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het isoleren van actieve synaptoneurosomen.
- Het verbeteren van de kwaliteit van synaptosoompreparaten voor onderzoek.
- Het faciliteren van verdere studies naar synaptische functies en mechanismen.
Gebruikte methoden
- Homogenisatie van hersenschorsen van muizen.
- Centrifugatie van het homogenaat om componenten te scheiden.
- Aanbrengen van het supernatant op Percoll-sucrosegradiënten.
- Eindcentrifugatie om de synaptosomenfractie te verzamelen.
Belangrijkste resultaten
- Western blot-analyse bevestigde de synaptische verrijking van de fractie.
- Experimenten met de incorporatie van S35-methionine toonden translationele activiteit aan.
- De methode vermindert mechanische schade effectief in vergelijking met traditionele technieken.
- De lage toxiciteit van Percoll verbetert de celviabiliteit in preparaten.
Conclusies
- De beschreven methode is efficiënt voor het prepareren van actieve synaptoneurosomen.
- Het biedt een betrouwbaar instrument voor het bestuderen van synaptische mechanismen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze techniek voor diverse toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
De isolatie van synaptoneurosomem maakt het mogelijk om mechanische risico's van synaptische targets te verminderen door het behoud van natuurlijke pre- en postsynaptische proteïnecomplexen. Deze methode ondersteunt targetvalidatie bij de ontdekking van neurowetenschappelijke geneesmiddelen door translationeel actieve preparaten te leveren die de fysiologische verwerking van neurotransmitters weerspiegelen. De Percoll-sucrose gradiëntmethode vermindert artefacten door mechanische schade en cytotoxiciteit, wat de betrouwbaarheid van de gegevens voor leadidentificatiecampagnes verbetert.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het behoud van het mechanisme voor opname, opslag en afgifte van synaptische blaasjes.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door de beoordeling van neurotransmitterdynamiek in hergesloten terminals.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door de novo eiwitsynthese te kwantificeren via S35 methionine-incorporatie als readout voor translationele activiteit.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-assays voor het meten van de translatie van synaptische eiwitten of drugseffecten op vesicle cycling.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare SN-opbrengsten (0,9–1,1 mL per cortex) met minimale batchvariabiliteit dankzij gecontroleerde gradiëntlaagvorming.
- Assay-gereedheid: Biedt schaalbaarheid voor compound-screeningplatforms die intacte synaptische terminals vereisen met behouden pre- en postsynaptische markers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Behoudt ziekterelateerde synaptische proteïnecomplexen van de ontdekkingsfase tot de preklinische validatie van CNS-gerichte modulatoren.
- Mechanistische risicoreductie: Bevestigt het on-target mechanisme door glutamaat-gestimuleerde S35 methionine-incorporatie te correleren met de cyclus van synaptische blaasjes.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt go/no-go beslissingen mogelijk op basis van translationele activiteitsniveaus, die hoger zijn in de cortex van jonge muizen (P13–P21) en worden verlaagd door eiwitsynthese-remmers zoals anisomycine.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van target-hypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, waarbij synaptische functionele assays bijdragen aan de prioritering van verbindingen voorafgaand aan preklinische werkzaamheidsstudies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door het isoleren van synaptisch verrijkte fracties, gevalideerd via western blot voor synaptische markers en gereduceerde onzuiverheidsprofielen.
- Screening: Levert assay-klare SNs met kwantitatieve output, zoals S35 methionine-incorporatiesnelheden, waardoor vergelijking van compound-effecten op eiwitsynthese mogelijk wordt.
- Analytics: Genereert metingen van translationele activiteit die teams helpen om synaptische functionele toestanden tussen verschillende condities of genetische modellen te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinisch werk door het behoud van het mechanisme van synaptische blaasjescycli, wat relevant is voor de afstemming van biomarkers bij neurodegeneratieve of neuropsychiatrische indicaties.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor corticale SN-preparatie dat toepasbaar is op meerdere projecten die synaptische eiwitvertaling of door geneesmiddelen geïnduceerde modulatie van blaasjesdynamiek bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in de binding aan het synaptische doelwit door behoud van de capaciteiten voor opname, opslag en afgifte van neurotransmitters.
- Operationele waarde: Standaardisatie via isotone Percoll-sucrosegradiënten die cytotoxische media vermijden en centrifugatiestappen verminderen, wat de reproduceerbaarheid verhoogt.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door translationele activiteit te kwantificeren als een functionele synaptische readout, waardoor het biologische risico in een laat stadium bij CZS-programma's wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van dosisafhankelijke effecten op de eiwitsynthese in de substantia nigra, ter ondersteuning van kapitaalefficiëntie bij doelwitvalidatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefseldissectie, homogenisatietechnieken en de bereiding van dichtheidsgradiënten om corticale schade te voorkomen en scherpe grensvlakken tussen de lagen te waarborgen.
- Afhankelijk van centrifugatie-infrastructuur (swinging-bucket en fixed-angle rotors) en temperatuurbeheersing (4°C) tijdens de gehele verwerking om de integriteit van de SN te behouden.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk wat betreft het aantal homogenisatieslagen en de volumes van de gradiëntlagen om inter-gebruikersvariabiliteit in de SN-opbrengst en -activiteit te minimaliseren.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het aanpassen van de leeftijd van de muis (P13–P21) voor ontwikkelingsspecifieke synaptische profielen en het optimaliseren van de TTX-concentratie (1 µM) om aspecifieke neuronale excitatie in downstream-assays te onderdrukken.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor snelle verwerking na dissectie om verlies van activiteit te voorkomen en de vereiste voor validatie via S35 methionine-incorporatie of western blot om synaptische verrijking te bevestigen.
