De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt
September 17th, 2011
Een methode om translationeel actief, intact synaptoneurosomes (SNS) voor te bereiden van de hersenen van muizen cortex wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt waardoor voor de snelle bereiding van actieve SNS.
Het algemene doel van deze procedure is om translationeel actieve synaptische naar neuro zones uit de muizenhersenschors voor te bereiden, met behulp van een discontinue peral sucrose dichtheidsgradiënt. Dit wordt bereikt door eerst de muizenschorsen te verzamelen en te homogeniseren, en vervolgens het homogenaat te centrifugeren. Hierna wordt het centrifugaat homogenaat of sup natant toegepast op de voorbereidde per co sucrose gradiënten.
De laatste stap is om de synaptosoomfractie te centrifugeren en te verzamelen. Uiteindelijk tonen western blot-analyse en S 35 methionine-incorporatie-experimenten aan dat de synaptosoomfractie synaptisch verrijkt en translationeel actief is. De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals centrifugatie en filtratie zijn dat ten eerste mechanisch letsel wordt vermeden door gebruik te maken van dichtheidsgradiënten, en ten tweede per call een lage toxiciteit heeft voor cellen in hun bestanddelen.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen met dit protocol omdat timing een sleutelrol speelt. Zodra de cortexsen zijn geoogst, moet de procedure snel worden voltooid. Om de procedure te starten, bereid de 3, 10, 15 en 23%-gradiëntlagen voor door de respectieve hoeveelheden SIP toe te voegen zoals beschreven in het bijbehorende manuscript aan GM buffer en goed te mengen.
Giet gradiëntlagen door twee milliliters van elk van de 23 15, 10 en 3%-isosmotische perol oplossingen te pipetten in de Beckman centrifugebuizen met doppen. Gebruik een P 1000 pipet om ervoor te zorgen dat het grensvlak tussen de lagen duidelijk herkenbaar is zonder menging van de lagen. Bewaar de gradiënten bij vier graden Celsius gedurende minimaal 20 minuten voor gebruik.
Voordat u met deze procedure begint, bereidt u andere noodzakelijke oplossingen voor zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Euthanasie de muis op de leeftijd van P 13 tot P 21 en bereid deze voor op dissectie door de achterkant van de nek en het hoofd te besproeien met 70%ethanol. Gebruik vervolgens een paar scherpe schaar om door het ruggenmerg aan de basis van de schedel te snijden.
Vervolgens verwijdert u de huid van de bovenkant van de schedel. Snijd de schedel lateraal tussen het pariëtale bot en het interpariëtale bot, of tussen de hersenhelften en de cortexgebieden. Snijd daarna de schedel van de basis naar de neus langs de sagittale naad.
Bij deze stap verwijdert u voorzichtig het zachte pariëtale bot door elke hemisfeer naar de zijkant te trekken. Steek vervolgens de spatel in de hersenen boven het cerebellum om de cortex eruit te scheppen. Plaats deze in ijskoud GM-buffer en herhaal de procedures opnieuw om meer cortexsen te verzamelen.
Spoel nu de cortexsen in ijskoud GM-buffer. Breng vervolgens twee cortexsen over naar een glazen homogenisator met vijf milliliter koude GM-buffer. Homogeniseer de cortexsen voorzichtig met vijf tot 10 bewegingen van stamper A, de losse stamper, gevolgd door vijf tot 10 bewegingen van stamper B, de type stamper.
Het aantal bewegingen varieert afhankelijk van de individuele homogenisator. Breng het homogenaat over naar een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer het bij 1000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een Allegra zes KR centrifuge om cellulaire deeltjes en kernen te pelleten. Leg twee milliliter van de supernatant voor elke per of sucrose gradiënt met één gradiënt voor elke hele cortex en dop de buisjes. Centrifugeer ze vervolgens in een vaste hoek rotor bij 32.500 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius in een Beckman J 2 21 centrifuge.
Gebruik geschikte adapters wanneer voltooid, de gradiënt zou een sterke SN band moeten geven, pipet af en gooi de oplossing boven de SN band weg. Gebruik een glazen pasta pipet om de SN band af te pipetten op de 15 tot 23%-interface, een gradiënt geeft over het algemeen ongeveer 0,9 tot 1,1 milliliter sns. Breng het vervolgens over naar een conische buis en bewaar het op ijs.
Vervolgens past u de zoutconcentratie van de SNS aan door één tiende van het volume 10 keer stimulatiebuffer toe te voegen. Optioneel voegt u 1000 keer calciumchloride toe om een eindconcentratie van 12 ano molair te geven. Voeg vervolgens een millimolair TTX-voorraad toe om een eindconcentratie van één micromolair te geven om niet-specifieke excitatie te onderdrukken.
De volgende stap is om de SNS te gebruiken in de toepasselijke downstream-toepassing, zoals eiwittranslatiestudies. Voor andere toepassingen kan SN-lysaat worden opgeruimd of geconcentreerd met behulp van de Pierce SDS-paginamonstervoorbereidingskit. De eiwitconcentratie van de SNS kan worden bepaald met behulp van de micro BCA-eiwitanalysekit.
Hier is een voorbeeld van zes banden of fracties. Toen de muizenschors werd gehomogeniseerd en gescheiden op discontinu perol sucrose gradiënten, bevonden de verrijkte SNS zich in band vijf op de 23 tot 15%-interface, deze band werd verwijderd en onderzocht door middel van elektronenmicroscopie. Een voorbeeld van intacte synaptische blaasjes en de behoud van pre-synaptische en post-synaptische elementen worden hier in de western blot getoond.
Een toename van synaptische markers en een afname van onzuiverheden in de SN band van een discontinue per sucrose gradiënt bevestigen dat de toename van S 35 methionine-incorporatie bij toevoeging van glutamaat te wijten is aan de novo eiwitsynthese. 40 micromolair anesa mycine, een eiwitsynthese-remmer, werd toegevoegd. Deze figuur toont de duidelijke afname van S 35 methionine-incorporatie in aanwezigheid van anso mycine met of zonder glutamaat aanwezig in vergelijking met de basale niveaus.
Dus de discontinue peral sucrose gradiënten produceren snel zeer actieve en relatief pure SNS die kunnen worden gebruikt om eiwittranslatie te bestuderen. Deze figuur toont aan dat band vijf uit de discontinue per core sucrose gradiënt de hoogste niveaus van de novo eiwitsynthese bevat. De SNS bereid door gehomogeniseerd cortex door een reeks filters met afnemende poriëngrootte te laten lopen en vervolgens te centrifugeren over een discontinue per core sucrose grad
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het bereiden van translationeel actieve synaptoneurosomen (SN's) uit de cortex van de muizenhersenen met behulp van een discontinu Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt. De techniek maakt een snelle bereiding mogelijk terwijl mechanische schade en toxiciteit worden geminimaliseerd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Synaptoneurosomen zijn essentieel voor het bestuderen van synaptische functie.
- Traditionele methoden kunnen mechanische schade aan monsters veroorzaken.
- Dichtheidsgradiënten kunnen de toxiciteit voor cellen verminderen.
- Het begrijpen van translationele activiteit in synapsen is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van actieve synaptoneurosomen.
- Om de kwaliteit van synaptosoomvoorbereidingen voor onderzoek te verbeteren.
- Om verdere studies naar synaptische functies en mechanismen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Homogenisatie van muizenhersencortex.
- Centrifugatie van het homogenaat om componenten te scheiden.
- Toepassing van het supernatant op Percoll-sucrose gradiënten.
- Laatste centrifugatie om de synaptosoomfractie te verzamelen.
Belangrijkste resultaten
- Western blot-analyse bevestigde synaptische verrijking van de fractie.
- S35 methionine-incorporatie-experimenten demonstreerden translationele activiteit.
- De methode vermindert effectief mechanische schade in vergelijking met traditionele technieken.
- De lage toxiciteit van Percoll verbetert de celviabiliteit in preparaten.
Conclusies
- De beschreven methode is efficiënt voor het bereiden van actieve synaptoneurosomen.
- Het biedt een betrouwbare tool voor het bestuderen van synaptische mechanismen.
- Toekomstig onderzoek kan op deze techniek voor verschillende toepassingen voortbouwen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Synaptoneurosome isolation enables mechanistic de-risking of synaptic targets by preserving native pre- and postsynaptic protein complexes. This method supports target validation in neuroscience drug discovery by providing translationally active preparations that reflect physiological neurotransmitter handling. The Percoll-sucrose gradient approach reduces artifacts from mechanical damage and cytotoxicity, improving data reliability for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by maintaining synaptic vesicle uptake, storage, and release machinery.
- Operational Value: Enables functional target validation through assessment of neurotransmitter dynamics in resealed terminals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying de novo protein synthesis via S35 methionine incorporation as a translational activity readout.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assays measuring synaptic protein translation or drug effects on vesicle cycling.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible SN yields (0.9–1.1 mL per cortex) with minimal batch variability due to controlled gradient layering.
- Assay Readiness: Provides scalability for compound screening platforms requiring intact synaptic terminals with preserved pre- and postsynaptic markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant synaptic protein complexes from discovery through preclinical validation of CNS-targeted modulators.
- Mechanistic De-risking: Confirms on-target mechanism by correlating glutamate-stimulated S35 methionine incorporation with synaptic vesicle cycling.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on translational activity levels, which are higher in juvenile (P13–P21) mouse cortices and reduced by protein synthesis inhibitors like anisomycin.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, where synaptic functional assays inform compound prioritization before preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating synaptically enriched fractions validated via western blot for synaptic markers and reduced impurity profiles.
- Screening: Delivers assay-ready SNs with quantitative outputs such as S35 methionine incorporation rates, enabling comparison of compound effects on protein synthesis.
- Analytics: Generates translational activity measurements that help teams compare synaptic functional states across conditions or genetic models.
- Translational Research: Connects to preclinical work by preserving synaptic vesicle cycling machinery relevant to biomarker alignment in neurodegenerative or neuropsychiatric indications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cortical SN preparation platform applicable across multiple projects studying synaptic protein translation or drug-induced modulation of vesicle dynamics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in synaptic target engagement through preserved neurotransmitter uptake, storage, and release capabilities.
- Operational Value: Standardization via isotonic Percoll-sucrose gradients that avoid cytotoxic media and reduce centrifugation steps, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by quantifying translational activity as a functional synaptic readout, reducing late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent effects on SN protein synthesis, supporting capital efficiency in target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, homogenization technique, and density gradient preparation to avoid cortical damage and ensure sharp layer interfaces.
- Dependent on centrifugation infrastructure (swinging bucket and fixed angle rotors) and temperature control (4°C) throughout processing to maintain SN integrity.
- Necessitates cross-team standardization of homogenization stroke counts and gradient layer volumes to minimize inter-user variability in SN yield and activity.
- Adaptation considerations include adjusting P13–P21 mouse age for developmental synaptic profiles and optimizing TTX concentration (1 µM) to suppress non-specific neuronal excitation in downstream assays.
- Practical limitations include the need for rapid processing post-dissection to prevent activity loss and the requirement for validation via S35 methionine incorporation or western blot to confirm synaptic enrichment.
