Name: De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer synaptoneurosomentechniek voor neurowetenschappelijk onderzoek met muiscortex. Deze methode met Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt minimaliseert mechanische schade en behoudt translationele activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag BK augustus bedanken van de Universiteit van Wisconsin-Madison Electron Microscope faciliteit voor de elektronenmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01-DA026067 en P30-HD03352 (tot JSM).

1. Voorbereidingen 1-4 <ol><li> Bereid 500 ml gradiënt medium (GM) buffer door het mengen van 50 ml van een 2,5 M sucrose slurry, 2,5 ml van een 1 M Tris-HCl, pH 7,5 voorraad, en 0,1 ml van een 0,5 m EDTA, pH 8,0 voorraad met milli- Q water om het volume. Filter steriliseren van de oplossing, hoeveelheid en opslaan van bevroren. </li><li> Bereid een 1000x voorraad tetrodotoxine (TTX) door het maken van een een mM oplossing in milli-Q H 2 O. Aliquots van TTX kan worden opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Bereid 10x Stimulatie Buffer door het maken van een oplossing van 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, en 800 mM NaCl in milli-Q water. Voorraad kan worden opgeslagen bij 4 ° C. </li><li> Pre-cool centrifuges tot 4 ° C. </li><li> Bereid een voorraad oplossing van Isosmotic Percoll (SIP) door toevoeging van negen volumes van Percoll (18 ml) tot een volume van 2,5 M sucrose (2 ml) in milli-Q water en meng goed. </li><li> De voorbereiding van de drie, 10, 15, en 23% helling lagen door het toevoegen van de respectievelijke bedragen van SIP naar GM buffer en het mengen van elk: </li></ol><img alt="Tabel 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 0"><ol start="7"><li> Giet helling lagen door pipetteren 2 ml van elk van de 23, 15, 10, en 3% isosmotic Percoll oplossingen in de Beckman centrifuge buizen met doppen met een P1000 Gilson Pipetman. De interface tussen de lagen moet duidelijk waarneembaar, zonder vermenging van de lagen. Bewaar de hellingen bij 4 ° C gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik. De gradiënten kunnen worden opgeslagen voor tot 24 uur, hoewel dezelfde dag gebruik wordt aanbevolen. [Onervaren laboratorium personeel kan de praktijk voorbereiden gradiënten door het toevoegen van blauwe kleurstof om de isomotic Percoll oplossingen voor visualisatie van de laag interfaces.] </li></ol> 2. Muis dissectie een <ol><li> Zorg ervoor dat alle muizen veeteelt en euthanasie worden uitgevoerd in overeenstemming met NIH en de Universiteit richtlijnen. Euthanaseren pups (leeftijd P13 tot P21) door kooldioxide stikken of door een goedgekeurde methode van in het dier protocol. </li><li> Speld de muis om een ​​dissectie raad van bestuur en spuit de achterkant van de nek en hoofd met ethanol. Met behulp van een scherpe schaar snijden door het ruggenmerg aan de basis van de schedel, verwijder de huid van de bovenkant van de schedel, zijdelings snijden de schedel tussen de pariëtale bot en de interparietal bot of tussen de hersenen en de cortex regio's. Knip dan de schedel van de basis naar de neus (langs de sagittale hechting), verwijder voorzichtig de zachte pariëtale bot door te trekken elk halfrond aan de zijkant en verwijder de cortex met een spatel. Plaats de spatel in de hersenen boven het cerebellum en dan schep de cortex en plaats het in ijskoude GM buffer. Ga direct naar de homogenisering stap. Laat niet de cortex zitten in ijskoude buffer voor zeer lang, omdat dit nadelige gevolgen zal de vorming van SNS beïnvloeden. </li></ol> 3. Voorbereiding van homogenaat en SNS 1-4 <ol><li> Spoel de cortex in de ijskoude GM buffer en overdracht twee cortex om een ​​glas Dounce homogenisator met 5 ml koud GM buffer. </li><li> Voorzichtig gehomogeniseerd de cortex met 5-10 slagen van de losse stamper (pestle "A"), gevolgd met 5-10 slagen van de krappe stamper (pestle "B"). Slagen moet snel, maar langzaam genoeg niet om luchtbellen te veroorzaken. Een foto van de homogenaat na homogenisering is in Schema 1. Het aantal slagen zal variëren afhankelijk van de individuele homogenisator en bijbehorende stampers. Wanneer u klaar bent de hellingen moet een sterke band SN te geven, zo niet, pas het aantal slagen. </li><li> Breng de homogenaat om een ​​15 ml conische en centrifugeer bij 1000xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een swingende emmer rotor (Allegra 6KR centrifuge) om pellet cellulaire puin en kernen. Een foto van de gesponnen homogenaat wordt in Schema 1. </li><li> Laag 2 ml van de bovenstaande per Percoll-sucrose gradiënt, cap de buizen, en centrifugeer bij 32.500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C in een vaste hoek rotor (Beekman J2-21 centrifuge, JA-17 rotor) met behulp van geschikte adapters ( Zie Reagentia en apparatuur tabel). </li><li> Pipet uit en gooi de oplossing boven de SN band met een glazen Pasteur pipet. Pipet uit de SN band op de 15/23%-interface, transfer naar een conische en op te slaan op het ijs. Elke verloop of een cortex zal produceren 0.9-1.1 mL van SN. </li><li> Pas de zoutconcentratie van het SNS door de toevoeging van een tiende volume van 10x stimulatie buffer, voeg 1000x CaCl 2 tot een uiteindelijke concentratie van 12 nM, en 1 mM TTX voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM toe te voegen aan niet-specifieke excitatie te onderdrukken. (Toevoeging van CaCl 2 is optioneel indien het zal interfereren met downstream SN toepassingen). </li><li> Bepaal de eiwitconcentratie van de SNS met behulp van de Micro BCA Protein Assay Kit. (De Bradford proteïne test is niet aan te raden vanwege de gevolgtrekking uit de Percoll.) </li><li> SNS kan direct en snel worden gebruikt voor de eiwit-vertalingTIE studies. Voor andere toepassingen SN lysaat kan worden opgeruimd of geconcentreerd met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Wanneer de muis cortex werd gehomogeniseerd en gescheiden op discontinue Percoll-sucrose gradiënten (Schema 1), 6 bands of fracties werden gezien (figuur 1). Het was eerder al aangetoond voor rat cerebrale cortex 3,5 dat de bestanddelen van het hoge moleculair gewicht banden werden membraan en myeline gebroken en dat het ingehulde materiaal mitochondriën of organellen (tabel 1). De 23% / 15%-interface (Band 5) bevatte de verrijkte SNS. De band van de 23% / 15%-interface, met intact SNS, werd verwijderd en onderzocht met behulp van elektronenmicroscopie (EM), zoals eerder beschreven. 2,6 EM de aanwezigheid van intacte synaptische blaasjes en het behoud van de presynaptische en postsynaptische elementen (figuur zien 2). Isolatie van pre-en postsynaptische compartimenten is belangrijk voor de behandeling van signalering en eiwitsynthese, die voorkomt in beide compartimenten. 7-13 De Percoll-sucrose gradiënt is een ruwe zuivering, zodat we zagen kleine cellulaire, nucleaire en organel besmetting in de SN-fractie, maar de de totale scheiding was goed. Wanneer onderzocht door Western blot, de Percoll fracties die het verwachte eiwit markers met een toename van de synaptische zuiverheid in de SN band (figuur 3, tabel 2). Synaptische en neuronale markers werden gehandhaafd in de verrijkte SN band (Band 5), maar de overvloed van andere markers werd aanzienlijk verminderd. Met name de aanwezigheid van GFAP, een marker voor astrocyten en neoplastische cellen van gliale oorsprong, en Lamin-B1, een nucleaire marker, waren te verwaarlozen, terwijl structurele en synaptische markers werden gehandhaafd of verbeterd. Daarnaast was er het behoud van markers voor organellen, zoals de mitochondria en het Golgi, die een rol spelen in de eiwitsynthese. Typische rendementen voor de SN band waren 250-500 ng van eiwit per microliter, zoals bepaald door BCA eiwit-test. De activiteit van de SNS werd bepaald door het bedrag van de novo eiwitsynthese te presenteren als gecontroleerd door [35S]-Met incorporatie (figuur 4). 2 Basal translationeel activiteit werd verhoogd 1,56 voudig indien SNS werden gestimuleerd met 50 uM glutamate/10 uM glycine (Glu) of 5,12 folden als geactiveerd met de Pin1 remmer juglone. Pin1 remming is bekend dat leiden tot een verhoogde proteïnesynthese. 2 Om te bevestigen dat de verhoging van [35S]-Met opname was te wijten aan de novo eiwitsynthese, voegden we 40 uM anisomycin, een eiwitsynthese remmer, en zag een duidelijke afname in oprichting in de aanwezigheid en afwezigheid van Glu in vergelijking met basale niveaus. Tevens, op de toevoeging van 2% Triton-X 100, die de integriteit van de SNS verstoort, was basale vertaling daalde met 75%. 2 Ook bij het ​​onderzoek van de banden (B4-B6) die de meeste synaptische marker verrijking zien, De SNS-of Band 5 had de grootste activiteit voor de novo eiwitsynthese (figuur 5). Zo is het discontinue Percoll-sucrose gradiënten snel een zeer actief en verrijkt SN band die kan worden gebruikt om eiwit vertaling te bestuderen. De discontinue Percoll-sucrose gradiënt procedure is voordeliger dan andere methoden, omdat mechanische schade is veroorzaakt door zwaardere omstandigheden. In vergelijking met de filtratie-methode, waarbij gewist corticale homogenaat wordt door een reeks filters die afnemen in grootte, 3,14-15 de Percoll methode meer SNS vormen met een grotere activiteit. Zoals te zien in Figuur 6, wanneer een hoeveelheid van SNS opgesteld door de filtratie methode was gepasseerd een Percoll-sucrose gradiënt zijn er veel minder SNS op de 15/23%-interface en een grotere hoeveelheid van gebroken vliezen. Wanneer de novo eiwitsynthese werd gemeten via een S35-met oprichting, de SNS opgesteld door de filtratie methode waren veel minder actief (figuur 7). Voor een maximale translationele activiteiten gebruiken we muizen die tussen de leeftijd van P14 en P18. SN kunnen worden bereid uit volwassen muizen, maar zagen we aanzienlijk toegenomen translationele activiteit met SN bereid uit juvenile muizen (figuur 8). <img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> Tabel 1. Bestanddelen van de bands uit de discontinue Percoll-gradiënt fractioneringen van gehomogeniseerde muis cortex. 3,5 <img alt="Tabel 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 2"> Tabel 2. Samenvatting van de westerse bout de analyse van discontinue Percoll-sucrose gradiënt band bestanddelen. Relatieve eiwitconcentraties voor elk van de band fracties geïsoleerd met behulp van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt werden bepaald door Western blot. Geen eiwit aanwezig is (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), of&gt; 0,8 (+++) maal groter waren dan eiwit aanwezig is in de supernatant (S, gecentrifugeerd cortex homogenaat), vertegenwoordiger van n = 3. <img alt="Schema 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Schema 1"> Schema 1: Schema van een SN preparaat met behulp van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt Mouse hersenen cortex werden ontleed, gehomogeniseerd, en gecentrifugeerd op lage snelheid niet-gehomogeniseerd weefsel, cellen, hele organellen zoals de kernen en membranen te verwijderen.. De discontinue gradiënt moet duidelijk gedefinieerde lagen. De foto inzet toont een voorbeeld van de lagen, die zijn geverfd blauw alleen voor illustratieve doeleinden, om de lagen te visualiseren. Het supernatant is gelaagd op de top van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt en gecentrifugeerd bij gemiddelde snelheid. De SN band wordt dan opgehaald van de helling en is klaar voor gebruik. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Homogenaat fractionering op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt. Muis cortex werd gehomogeniseerd en gescheiden op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt die aanleiding geeft tot zes bands of fracties. Het gezuiverde, actieve SNS (*) zijn gevonden in Band 5. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. SN voorbereidingen geven een heterogene mix van SNS dat de presynaptische en postsynaptische elementen te behouden. Een electronen microscoop foto van een SN preparaat bereid uit C57BL / 6 muizen (leeftijd P13 tot P21) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven en toont SNS met gekonfijte presynaptische en postsynaptische elementen 2. , 6 rode pijlen wijzen naar post-synaptische dichtheden. Schaal bar is 1 micrometer. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Western blot analyses van SN de voorbereidingen bleek dat synaptische en neurale markers werden behouden in het gezuiverde SNS (Band 5), maar de overvloed van andere markers werd aanzienlijk verminderd. Immunoblots van het supernatans (S, gecentrifugeerd corticale homogenaat) en Bands 1-6 van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt werd gesondeerd voor β-actine (structurele, laden controle), GFAP (astrocytaire), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplasmatische en nucleaire), Lamin-B1 (nucleaire), Prohibitin (mitochondriale), PSD95 (postsynaptische dichtheid ), SNAP25 (synaptic), synaptofysine (synaptic) en β3-tubuline (neuron-specifieke). De bands werden gevisualiseerd met behulp van een Storm 860 Phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. SNS zijn actief en vertonen de novo eiwitsynthese via [35S]-Met de oprichting. SNS waren pre-evenwicht gebracht tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan is de Sns waren onbehandeld of voorbehandelde gedurende 15 minuten met 40 uM anisomycin of 1 uM juglone bij 37 ° C gevolgd door toevoeging van [35S]-Met, 20 ul Express Pro Label S35 Gemakkelijk Tag Mix, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Band 5 van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt bevat de hoogste niveaus van de novo eiwitsynthese. Banden 4, 5 en 6 en de supernatant (S, gecentrifugeerd corticale homogenaat) waren vooraf geëquilibreerd tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan, [35S]-Met, Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag, werd toegevoegd, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. SNS bereid uit een filtratie methode bevat meer gebroken vliezen en minder dan hele SNS SNS bereid uit de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode. SNS werden voorbereid door het passeren gehomogeniseerd cortex door een reeks van filters met afnemende poriegrootte zoals eerder beschreven. 3,14-15 Een deel van de SNS opgesteld door de filtratie methode werd gecentrifugeerd op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt en in vergelijking met een gelijkwaardig bedrag van materiaal met behulp van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. SNS bereid uit een filtratie methode bevat minder de novo eiwitsynthese activiteit dan SNS weer bereidm de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode. SNS werden voorbereid door het passeren gehomogeniseerd cortex door een reeks van filters met afnemende poriegrootte zoals eerder beschreven, 3,14-15 en door de discontinue Percoll-sucrose gradiënt methoden. SNS van beide preparaten waren pre-evenwicht gebracht tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan, [35S]-Met, Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag, werd toegevoegd, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8. SNS van jongere muizen (P14) hebben een grotere translationeel activiteit dan oudere muizen (P85). SNS werden bereid uit verschillende oude muizen met behulp van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode, preequilibrated bij 37 ° C gedurende 10 min, behandeld of onbehandeld met Glu in het aanwezigheid van [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Eenvoudige Tag) gedurende 30 min, snap ingevroren en later schoongemaakt met de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. De SNS werden vervolgens draaien op een 12% SDS-polyacrylamide gel, gedroogd en afgebeeld op een Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM. SNS vanaf P14 muizen werden minstens 3-maal meer actief dan P85 muizen.

<ol><li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li>
<li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li>
<li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction%3A+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex%3A+cyclic+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-generating+systems%2C+receptors%2C+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li>
<li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li>
<li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+translation%3A+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic%2C+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li>
<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li>
<li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translational+control+in+dendrites+and+its+role+in+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity.</a> J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).</li>
<li>Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+rat+brain+postsynaptic+density%3A+implications+of+the+diverse+protein+functional+groups+for+the+integration+of+synaptic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology.</a> J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).</li>
<li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li>
<li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B242+from+isolated+intact+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li>
<li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing%2C+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Magnes+Res%22%5BJournal%5D)">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li>
<li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neuronal+excitability%2C+synaptic+plasticity%2C+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharm%22%5BJournal%5D)">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li>
<li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li>
<li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li>
<li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li>
<li>Hajós, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li>
<li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptosome+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li>
<li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized%3A+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li>
<li>Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPertoft%2C+H+%22Methods+of+Cell+Separation%22">Methods of Cell Separation</a>. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).</li>
<li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+%26gamma%3B-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">High affinity uptake of L-glutamate and &gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li>
<li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li>
<li>Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De discontinue Percoll-sucrose gradiënt bereiding hierin beschreven is een snelle, betrouwbare methode om actief SNS, die gebruikt kunnen worden in een verscheidenheid van synaptische transmissie experimenten te isoleren. Dit verloop methode, die is gebaseerd op de methode ontwikkeld door Dunkley et al.., 3,4 is een subcellulaire hersenen fractionering procedure, die zowel pre-en postsynaptische membraan-afgeleide blaasjes die geassocieerd zijn met elkaar isoleert. Zonder verdere zuivering van deze SNS zijn c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Micro BCA Protein Assay Kit </td><td> Doorboren </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Visser </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2-gas </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Visser </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Visser </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Visser </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit </td><td> Doorboren </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Visser </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Visser </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxine </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Uitrusting </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Dissectie-instrumenten </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce homogenisator, 7 ml (wordt geleverd met twee glazen stampers met het label &quot;A&quot; en &quot;B&quot;) </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR Centrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3,8 Rotor, Swinging emmer rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 Centrifuge </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman buizen met doppen </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Wit ommuurde adapters </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Blauw ommuurde adapters </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, vaste-hoek rotor </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel van antilichamen gebruikt worden voor western blots: <table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het antilichaam </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Gastheersoort </th><th> Verdunningsfactor </th></tr><tr><td> β-actine </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> muis </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65343 </td><td> muis </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-134509 </td><td> konijn </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-7298 </td><td> muis </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-6261 </td><td> geit </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28259 </td><td> konijn </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> muis </td><td> 5 ug / ul </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666-100 </td><td> konijn </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Synaptofysine </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> muis </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-tubuline </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80016 </td><td> muis </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

de voorbereiding van synaptoneurosomes van mouse cortex met behulp van een discontinue percoll-sucrose dichtheidsgradiënt

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNS) zijn verkregen na homogenisering en fractionering van muizenhersenen cortex. Ze worden opnieuw verzegeld blaasjes of geïsoleerd terminals die los te maken van axon terminals als de corticale weefsel wordt gehomogeniseerd. De SNS behoudt pre-en postsynaptische eigenschappen, waardoor ze nuttig zijn in de studie van de synaptische transmissie. Zij behouden de moleculaire machines gebruikt in de neuronale signalering en zijn in staat van opname, opslag en afgifte van neurotransmitters. De productie en isolatie van actieve SNS kan problemen opleveren met behulp van media, zoals Ficoll, die kunnen worden cytotoxische en vereisen uitgebreid centrifugeren door de hoge dichtheid, en filtratie en centrifugeren methoden, die kan in lage activiteit resultaat als gevolg van mechanische schade van de SNS. Echter, het gebruik van discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënten aan SNS isoleren biedt een snelle methode om een ​​goede opbrengst van translationeel actief SNS produceren. De Percoll-sucrose gradiënt methode is snel en zacht als zij in dienst isotone omstandigheden, heeft minder en kortere centrifugeren spins en vermijdt centrifugeren stappen die pellet SNS en mechanische schade.

Een methode om translationeel actief, intact synaptoneurosomes (SNS) voor te bereiden van de hersenen van muizen cortex wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt waardoor voor de snelle bereiding van actieve SNS.

De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt

Synaptoneurosommen (SN's) worden verkregen na homogenisatie en fractionering van de cortex van de muizenhersenen. Het zijn verzegelde blaasjes of geïsoleerde terminals die ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van translationeel actieve synaptische neurozones uit de cortex van de muizenhersenen, gebruikmakend van een discontinue sucrose-dichtheidsgradiënt. Dit wordt bereikt door eerst de muizencortices te verzamelen en te homogeniseren, om vervolgens het homogenizaat te centrifugeren. Daarna wordt het gecentrifugeerde homogenizaat, of supernatant, aangebracht op de voorbereide sucrose-gradiënten.De laatste stap is het centrifugeren en verzamelen van de synaptosomenfractie. Uiteindelijk tonen western blot-analyse en experimenten met S 35 methionine-incorporatie aan dat de synaptosomenfractie synaptisch verrijkt is en translationeel actief is. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals centrifugatie en filtratie zijn enerzijds dat mechanische beschadiging wordt vermeden door het gebruik van dichtheidsgradiënten, en anderzijds dat percoll een lage toxiciteit heeft voor cellen en hun bestanddelen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met dit protocol, omdat de timing een sleutelrol speelt. Zodra de cortices zijn geoogst, moet de procedure snel worden vo

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video toont een procedure voor het genereren van neuronale culturen uit de late embryo en de vroege postnatale muis cortex. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemie, biochemie, elektrofysiologie, calcium en natrium beeldvorming en een platform te bieden voor de neuronale ontwikkeling van transgene dieren die een postnatale dodelijke genmutatie dragen bestuderen.

De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen

This video demonstrates the procedure for isolating brain cells and infiltrated immune cells from ischemic mouse brain tissues by enzymatic digestion, followed by the removal of cell debris and myelin by density gradient centrifugation, to study inflammation responses in stroke research.

Obtaining Cell Suspensions from Ischemic Mouse Brain Tissues

Source: Lunelli, L., et. al. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp.(2016).This video demonstrates the imaging of polysomes using atomic force microscopy. A nickel-ions-coated mica sheet anchors RNA with attached ribosomes. The sample is washed, dried, and mounted onto the microscope stage. The cantilever tip scans the sample surface, recording laser deflections to map the topology. Software is used to correct distortions and visualize high-resolution polysome...

 Imaging Polysomes Isolated from a Mouse Brain Using Atomic Force Microscopy

Dit artikel beschrijft de verrijking van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie op een discontinue sucrose gradiënt. De verdere uitwerking van postsynaptische dichtheid eiwit wordt ook beschreven. Eiwitpreparaten zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.

Voorbereiding van Synaptic plasmamembraan en Postsynaptische Density eiwitten met behulp van een discontinue sucrosegradiënt

Hoewel de structuur van ribosomen uitgebreid is gekarakteriseerd, is de organisatie van polysomen nog onvoldoende bestudeerd. Om dit kennisgebrek te overwinnen, presenteren we hier een gedetailleerd voorbereidingsprotocol voor nauwkeurige beeldvorming van polysomen van zoogdieren door atomaire krachtmicroscopie (AFM) in lucht en vloeistof.

Turen naar Brain polysomen met Atomic Force Microscopy

De identificatie van moleculen en routes die synaptische plasticiteit en geheugen beheersen, is nog steeds een grote uitdaging in de neurowetenschappen. Hier wordt een workflow beschreven die zich richt op de relatieve kwantificering van synaptische eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij de moleculaire reorganisatie van synapsen tijdens het leren en het consolideren van geheugen in een auditief leerparadijm.

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

We presenteren een protocol voor de extractie van Murine cerebrale pericytes. Gebaseerd op een antibioticum-vrije verrijkings georiënteerde pericyte extractie, is dit protocol een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies die een hoge zuiverheid en hoge opbrengst bieden, waardoor het aantal gebruikte proefdieren afneemt.

Een hoge Uitvoermethode om cerebrale Pericytes van de muis te isoleren

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

Dit protocol presenteert een robuuste, gedetailleerde methode om zeer zuivere synaptosomen, synaptische blaasjes en andere synaptische fracties uit het muizenbrein te verkrijgen. Deze methode maakt de evaluatie van synaptische processen mogelijk, inclusief de biochemische analyse van eiwitlokalisatie en -functie met compartimentale resolutie.

Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Leer synaptoneurosomentechniek voor neurowetenschappelijk onderzoek met muiscortex. Deze methode met Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt minimaliseert mechanische schade en behoudt translationele activiteit.

De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt

Meer video's verkennen