Beoordeling van de GFP expressie en levensvatbaarheid Met behulp van de Tali Image-Based Cytometer
17 november 2011
Dit protocol wordt beschreven hoe u levensvatbaarheid van de cellen en de fluorescentie expressie assays met behulp van de Tali Image-Based Cytometer.
Deze video demonstreert een procedure voor het bepalen van celviabiliteit in cellen die GFP uitdrukken met behulp van de tally afbeeldingsgebaseerde cytometer. GFP-getransduceerde cellen worden gekleurd met behulp van de tally-viabiliteitskit dode cel rood, die alle dode cellen rood kleurt met propidiumjodide, de cellen worden gepipetteerd in een tally-cellulaire analyseslide en geladen in de cytometer, die brightfield en rood en groen fluorescentiebeelden verwerft en analyseert. Vervolgens worden histogrammen gegenereerd om celtelling, celgrootte, PI-fluorescentie-intensiteit en GFP-fluorescentie-intensiteit weer te geven in vergelijking met traditionele flowcytometrie.
Tali kan vergelijkbare gegevens over celviabiliteit en expressie leveren. Deze afbeeldingsgebaseerde cytologie biedt echter aanvullende visuele informatie over de onderzochte celpopulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie is dat de tally afbeeldingsgebaseerde cytometer zowel kwantitatieve als visuele informatie tegelijkertijd levert over uw celmonster.
Bovendien is het tally-instrument eenvoudiger te gebruiken, goedkoper en heeft het een kleinere voetafdruk dan een flowcytometer of een fluorescentiemicroscoop. Dit stelt onderzoekers in staat om snel kwantitatieve analyses zoals viabiliteit in GFP-uitdrukkende cellen uit te voeren op de werktafel. In deze procedure werden U2 OS-cellen met een concentratie van één keer 10 tot zes cellen per milliliter getransduceerd met een nucleair gericht cell light GFP-viraal construct om dode cellen te onderhouden met propidiumjodide overdracht 100 microliter van de celsuspensie in een nieuwe microcentrifugebuis.
Merk op dat een concentratie van één keer 10 tot de vijfde tot één keer 10 tot de zevende cellen per milliliter wordt aanbevolen voor de test, hoewel de concentratie niet exact hoeft te zijn. Voeg vervolgens één microliter tally dode cel rood reagens toe. Vorm vervolgens kort om te mengen, incubeer het kleuringsreagens en de celmix bij kamertemperatuur in het donker gedurende één tot vijf minuten.
Na de incubatie, ga direct door met analyse op de tally afbeeldingsgebaseerde cytometer. De tally gebruikt wegwerpbare plastic cellulaire analyseslides die specifiek voor het instrument zijn ontworpen. Zorg er altijd voor dat u de slide aan de randen vasthoudt om de slide te laden.
Pipet 25 microliter monster langzaam in een van de halve maanvormige monstersladegebieden. Hier worden ongekleurde niet-transduceerde controlecellen in kamer A geladen en de gekleurde GFP-uitdrukkende cellen worden in kamer B geladen. Om een viabiliteitstest uit te voeren in GFP-uitdrukkende cellen, raak G-F-P-R-F-P aan op het startscherm van de cytometer. De testopties verschijnen dan aan de rechterkant, selecteer GFP plus viabiliteit.
Het instrument zal vervolgens vragen of de monsterserie moet worden genoemd om de monsterserie te benoemen. Druk op nu benoemen. Typ vervolgens met behulp van het touchscreen de naam van de monsterserie en druk op opslaan. De tally-cytometer gaat automatisch naar het meetscherm.
Vervolgens, om de achtergrondfluorescentie te meten, druk op het achtergrondtabblad in de onderste rechterhelft van het meetscherm zoals hier te zien is. De standaardinstelling geeft aan dat negen celvelden worden afgebeeld. Nu de controlemonster weg van het instrument staat, steekt u de slide in de laadpoort totdat deze stopt.
Oefen geen kracht uit op het achtergrondscherm, druk op om een nieuw ongekleurd celcontrolemonster in te voegen. De slide wordt automatisch in het instrument getrokken en een live afbeelding van de cellen wordt op het scherm weergegeven. Gebruik de focusknop om de cellen in het juiste zichtvlak te brengen terwijl u focust.
Schuif de rode zoomknop naar vier x of 16 x. Om de celpopulatie beter te bekijken, moeten de cellen uniform donker zijn met een heldere halo eromheen. Zoals hier getoond, kunnen cellen onderschat worden wanneer de overgang tussen de achtergrond en de randen van de cellen wazig is, zodat de celgrenzen niet goed gedefinieerd zijn.
Cellen kunnen overschatte worden wanneer ze heldere centra en donkere randen hebben. Zodra de cellen scherp staan, raak aan, druk op om ongekleurd celcontrole uit te voeren. Om de achtergrondfluorescentie te meten, zal de cytometer automatisch afbeeldingen vastleggen en miniaturen van elk gezichtsveld weergeven.
De voortgangsbalk geeft een doorlopende update van de analyse. Nadat de afbeeldingsvastlegging voltooid is, werpt de cytometer automatisch de slide uit en biedt de gegevens van de analyse van de vastgelegde afbeeldingen. Opgeslagen gegevens worden weergegeven in het vervolgkeuzemenu van het achtergrondtabblad.
Het achtergrondcontrolemonster krijgt dezelfde naam als die gegeven aan het experiment. Om de PI-gekleurde GFP-getransduceerde steekproef uit te voeren, verwijdert u de slide uit het instrument, draait u deze om en plaatst u deze opnieuw met de getransduceerde steekproef weg van het instrument. Druk op het steekproeftabblad en raak aan, druk op om een nieuwe steekproef in te voegen.
Wanneer de afbeelding op het scherm verschijnt, gebruikt u de focusknop om de cellen scherp te stellen. Zoals eerder, raak aan, druk op om steekproef uit te voeren. Nadat de afbeeldingsvastlegging voltooid is, verschijnen de gegevens van de analyse onder het steekproeftabblad en werpt de cytometer de slide automatisch uit.
Verwijder de tally cellulaire analyseslide. Als biogevaarlijk afval kunnen deze slides niet worden hergebruikt. Nadat de steekproef is uitgevoerd, kunnen drempels op de steekproef worden toegepast.
Om specifieke celpopulaties hier te analyseren, passen we de drempels aan om het percentage levende en dode cellen te bepalen. In GFP-uitdrukkende cellen onder het steekproeftabblad, worden het aantal en het percentage cellen dat GFP-uitdrukkende levende en dode cellen dat GFP-uitdrukkende totale viabiliteit weergeven, weergegeven. Gemiddelde celgrootte, aantal getelde cellen en celconcentratie worden weergegeven.
Bovendien worden histogramplots die celgrootte, groene fluorescentie en rode fluorescentie weergeven, weergegeven onderaan het scherm.
Overzicht
Dit protocol beschrijft hoe je celviabiliteit en fluorescentie-expressie-assays uitvoert met behulp van de Tali Image-Based Cytometer. De methode stelt onderzoekers in staat om celpopulaties te analyseren met zowel kwantitatieve als visuele gegevens.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Cytometrie
Achtergrond
- De Tali Image-Based Cytometer biedt een alternatief voor traditionele flowcytometrie.
- Het maakt gelijktijdige verwerving van kwantitatieve en visuele gegevens mogelijk.
- De methode is gebruiksvriendelijk en kosteneffectief.
- Het is geschikt voor het analyseren van GFP-expresserende cellen.
Doel van het onderzoek
- Om de celviabiliteit in GFP-expresserende cellen te beoordelen.
- Om de voordelen van beeldgebaseerde cytometrie ten opzichte van traditionele methoden aan te tonen.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het gebruik van de Tali Image-Based Cytometer.
Gebruikte methoden
- Transductie van U2 OS-cellen met GFP.
- Kleuren met Tali Dead Cell Red-reagens.
- Beladen van monsters in Tali-cellulaire analyse-slides.
- Gebruik van de Tali Image-Based Cytometer voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Kwantitatieve gegevens over celviabiliteit en GFP-expressie.
- Visuele weergave van celpopulaties.
- Histogrammen die celgrootte en fluorescentie-intensiteit weergeven.
- Vergelijking van resultaten met traditionele flowcytometrie.
Conclusies
- De Tali Image-Based Cytometer is effectief voor het beoordelen van celviabiliteit.
- Het biedt aanvullende visuele inzichten in celpopulaties.
- De methode is toegankelijk voor gebruik op het laboratoriumblad in onderzoeksomgevingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The Tali Image-Based Cytometer bridges the gap between flow cytometry and fluorescence microscopy by delivering simultaneous quantitative and visual data for cell viability and GFP expression assays. This dual-output capability supports early discovery workflows where phenotypic confirmation and mechanistic de-risking require both population-level metrics and single-cell visualization. Its benchtop footprint, lower cost, and simplified operation enable decentralized use across discovery biology and assay development teams, reducing reliance on core facilities and accelerating go/no-go decisions in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating GFP expression with viability status in live-cell populations.
- Operational Value: Provides visual confirmation of transfection efficiency and protein localization alongside quantitative viability readouts.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing total GFP expression from expression in viable cells, reducing false-positive leads.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized histograms for cell size, PI fluorescence, and GFP intensity, enabling threshold-based gating for reproducible population analysis.
- Scalability: Processes thousands of cells per sample with consistent imaging and algorithmic analysis, supporting medium-throughput screening campaigns.
- Workflow Integration: Outputs are compatible with downstream analytics for hit selection and lead optimization in phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains assay consistency from discovery validation to preclinical models by providing comparable viability and expression data to flow cytometry.
- Mechanistic De-risking: Visual layering of brightfield, GFP, and PI signals confirms co-localization of transgene expression and cell death, clarifying mechanism of action.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the fraction of live, transgene-expressing cells in heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
The Tali cytometer fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, where simultaneous viability and reporter gene assessment informs compound effects on cellular health and target engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GFP reporter activity to cell survival, clarifying on-target versus off-target effects.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence and viability outputs with visual validation, enhancing assay reproducibility and hit confirmation.
- Analytics: Provides histogram-based readouts for cell size, GFP intensity, and PI intensity, enabling statistical comparison across conditions and replicates.
- Translational Research: Ensures data continuity with preclinical workflows by mirroring flow cytometry outputs while adding visual context for mechanistic interpretation.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared benchtop platform for multiple assays (viability, GFP/RFP expression, apoptosis), maximizing instrument utilization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through correlated visual and quantitative data.
- Operational Value: Standardizes assay execution via disposable slides and automated image analysis, improving reproducibility and reducing user variability.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by enabling rapid benchtop iteration without flow cytometry scheduling constraints.
- Portfolio Impact: Supports risk-based prioritization by quantifying live, transgene-positive cells, improving the quality of advancement candidates.
Implementation Considerations
- Requires basic training in fluorescence microscopy principles and threshold gating for fluorescence and scatter parameters.
- Depends on the Tali Image-Based Cytometer, Tali Cellular Analysis Slides, and Tali Viability Kit - Dead Cell Red reagent for PI-based viability detection.
- Necessitates standardization of staining protocols, incubation times, and focus procedures across users and sites for consistent results.
- Adaptation to other model systems may require optimization of cell concentration and staining conditions due to variations in size and autofluorescence.
- Practical limitations include inability to perform multi-parameter immunophenotyping beyond three channels and incompatibility with adherent cell assays without dissociation.
