Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples
May 4th, 2012
In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.
Dit videoartikel beschrijft een procedure voor het verkrijgen van glycosylatieprofielen van 20 verschillende glycoproteïnen in een serummonster van een patiënt met hepatocellulair carcinoom met behulp van een chemisch geblokkeerde antilichaammicroarray. Eerst worden specifieke antilichamen voor glycoproteïnen direct op microarrayslides gedrukt en worden antilichaamglycanen geblokkeerd om lecticbinding te voorkomen. Wanneer monsters van patiëntenserum worden aangebracht, worden glycoproteïnen uit het monster gevangen door de antilichamen. Biotinyleerde glycanbindingseiwitten worden vervolgens toegevoegd om de glycanen te detecteren en di geconjugeerde neu travain wordt toegevoegd om de biotinyleerde lectinen te labelen.
De microarrayslide wordt vervolgens gescand om fluorescentieanalyse van de resulterende gegevens te detecteren, wat de glycosylatieprofielen van de monsters van de eiwitten onthult. Deze techniek heeft verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden zoals HPLC. Deze methode maakt de detectie van individuele glycoproteïnen in hun natuurlijke status mogelijk.
Het is sneller en gemakkelijker om glycosylatie-alteraties voor meerdere eiwitten tegelijk te screenen. Goed, we hebben gevonden dat biomarkers van ziekten, met name van kanker en leverkanker, waarnaar we het meest zorgvuldig hebben gekeken, vaak geglycosyleerd zijn. En het vermogen om specifieke glycovormen te detecteren, verbetert de prestaties van biomarkers aanzienlijk in hun gevoeligheid en specificiteit.
Deze maatregel kan dus inzichten bieden in glycosylatie-alteraties op meerdere serumeiwitten bij HCC. Het kan ook worden toegepast op de pathologiestudie en de ontdekking van biomarkers bij andere kankers en ziekten zoals pancreaskanker, diabetes en de ziekte van Alzheimer. De procedure wordt gedemonstreerd door Chen Lu, een technicus uit mijn laboratorium.
Begin dit protocol door de antilichaammicroarray eerst voor te bereiden in microcentrifugebuisjes van 0,8 milliliter op ijs. Verdun alle antilichamen die voor microarray-afdrukken zullen worden gebruikt tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter in minimaal 40 milliliter PBS. Hier worden 26 verschillende antilichamen als positieve controle gebruikt. Bereid ook dezelfde hoeveelheid van 0,5 milligram per milliliter biotinyleren BSA in PBS. Gebruik een pipetter om 40 milliliter van elk antilichaam in de 384-wells bronplaat op ijs te doseren.
Bepaal vervolgens in de microarray-besturingssoftware elke antilichaamlocatie. Laad vervolgens de plaat op de microarray als bron. Laad vervolgens 20 path microarrayslides op de microarray als doel.
Stel de microarray in om 48 identieke subarrays af te drukken waarin 27 antilichamen en controle-eiwitten in drievoudig in een negen bij negen patroon worden gespot. Start de microarray om de antilichaammicroarrayslides af te drukken. Verzamel de antilichaammicroarrayslides en bewaar ze in een slidecassette met droogmiddel.
Versluit de cassette in een plastic zak om eiwitdenaturatie en vocht op de slides tijdens opslag te voorkomen. Bewaar de verzegelde microarrayslides bij vier graden Celsius totdat ze worden gebruikt. Het moeilijkste en belangrijkste aspect van deze procedure is de chemische blokkeerstap.
Om succes te garanderen, is het van cruciaal belang dat voldoende hoeveelheid antilichaam op de microarray wordt afgedrukt. Bereid altijd vers natrium IDE en agrozuur hydrocyt onmiddellijk voor het experiment. En zorg ervoor dat de oxidatieprocedure bij vier graden wordt uitgevoerd, licht vermijdend.
Haal de microarrayslides uit de koelkast en breng ze 30 minuten in evenwicht naar kamertemperatuur. Verwijder een slide uit de opslagdoos. Dompel de slide kort in een wasbekken met PBS met 0,1%tween 20.
Dompel vervolgens de slide gedurende 10 minuten in 15 millimolar natriumacetaatbuffer met 0,1%tween. Bereid vervolgens vers 150 millimolar natriumperiodate in 15 millimolar natriumacetaatbuffer en breng het over naar een slidewasbekken. Bewaar in de koelkast, licht vermijdend tot gebruik. Verwijder de slide uit de natriumacetaatbuffer en doe het in het bekken met vers natriumpuriaat met de antilichaamzijde naar boven gericht.
Dek het bekken af met aluminiumfolie om licht te voorkomen. Plaats vervolgens de slidebekken op vier graden Celsius met zacht schudden gedurende twee uur. Verwijder de slide uit het bekken en spoel hem kort drie keer gedurende vijf minuten in natriumacetaatbuffer.
Incubeer de slide in 300 milliliter vers bereide 10 millimolar hydro glutamische zuurblokkeringsoplossing in een incubatiekamer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met zacht schudden. Verwijder de slides uit de kamer en was ze met PBS met 0,1%tween gedurende drie minuten. Incubeer vervolgens in een slidewasbekken de microarrayslide gedurende een uur bij kamertemperatuur met zacht schudden in 300 milliliter 1%BSA in PBS met 0,5%tween.
Spoel de slides in PBS met 0,1%tween drie keer gedurende drie minuten. Plaats de slide op een sliderek en draai hem bij 1.200 keer G gedurende twee minuten om de microarrayslide te drogen. Om elke subar array te scheiden, wordt een wasraster op de slide afgedrukt.
Nadat de wasafdrukker gedurende vijf minuten op 70 graden Celsius is voorverwarmd, laadt u de geblokkeerde microarrayslide in de wasafdrukker met de antilichaamzijde naar de was gericht. Trek voorzichtig aan de hendel om was gelijkmatig op de slide af te drukken. Deze methode kan worden gebruikt om glycoprofileringsassays uit te voeren voor een enkel monster of om een enkel glyco-epitoop in meerdere monsters te meten.
Hier zullen we glycoprofileringsassays demonstreren. Begin door 40 microliter serum te verdunnen in 360 microliter PBS met 0,1%tween 0,1%bridge 35 en 100 microgram per milliliter, elk van muis, rat, konijn, geit en ezel IgG. Dit volume is voldoende om zes microliter verdunde serumoplossing op elke subar aan te brengen.
Breng voorzichtig zes microliter van het verdunde monster of controle aan op elke subar van de slide. Incubeer de slide in een bevochtigde cassette met natte papieren handdoeken bij kamertemperatuur gedurende een uur. Spoel de slide met PBS met 0,1%tween drie keer gedurende drie minuten.
Droog vervolgens de slide door hem gedurende twee minuten bij
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een verbeterd protocol voor een multiplexed high-throughput antilichaam microarray met lectin detectie, gericht op glycosylering profilering van specifieke eiwitten. De nieuwe methode biedt betrouwbare reagentia en vermindert aanzienlijk de tijd, kosten en apparatuur behoeften vergeleken met eerdere technieken.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Glycosylering profilering
- Antilichaam microarray technologie
- Biomarker ontdekking
Achtergrond
- Glycosylering is een kritische post-translationele modificatie die de eiwitfunctie beïnvloedt.
- Huidige methoden voor glycosylering profilering kunnen tijdrovend en kostbaar zijn.
- Verbeterde methodologieën zijn nodig voor efficiënte analyse.
- Deze studie gaat deze uitdagingen aan met een nieuwe benadering.
Doel van Studie
- Om een efficiënter protocol voor glycosylering profilering te ontwikkelen.
- Om een multiplexed high-throughput antilichaam microarray te gebruiken.
- Om detectiecapaciteiten te verbeteren met behulp van lectin binding.
Gebruikte Methoden
- Specifieke antilichamen afdrukken op microarray slides.
- Antilichaam glycans blokkeren om lectin binding te voorkomen.
- Toepassen van patiënt serum monsters om glycoproteïnen te vangen.
- Gebruik van biotinyleren glycan binding eiwitten voor detectie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle vangst van glycoproteïnen uit serum monsters.
- Detectie van glycosylering profielen met behulp van fluorescentie analyse.
- Aangetoonde voordelen ten opzichte van bestaande methoden zoals HPLC.
- Mogelijkheid tot analyse van individuele glycoproteïnen in hun native staat.
Conclusies
- Het nieuwe protocol verbetert de efficiëntie van glycosylering profilering aanzienlijk.
- Het biedt een betrouwbaar en kosteneffectief alternatief voor traditionele methoden.
- Deze techniek kan verder onderzoek in glycoproteïne analyse faciliteren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables multiplexed, high-throughput profiling of protein glycosylation in complex biological samples, addressing a critical bottleneck in biomarker discovery and target validation. By reducing time, cost, and equipment requirements, it supports scalable analysis of glycosylation alterations linked to disease progression, particularly in oncology and metabolic disorders. The approach enhances predictive confidence in early-stage R&D by providing quantitative, reproducible glycan profiles that inform mechanistic de-risking and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific glycoprotein glycosylation patterns to disease states such as hepatocellular carcinoma.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through multiplexed capture and detection of 20+ glycoproteins from serum samples using a single microarray platform.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing glycosylation-driven biomarker alterations from changes in protein expression levels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling standardized, quantitative glycan profiling across multiple protein targets.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility and throughput through chemical blocking of antibody glycans, minimizing background noise in lectin-based detection.
- Scalability: Enables platform reuse across sample sets via wax-grid subarray separation, allowing parallel profiling of single glycoepitopes in multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase glycan profiling to preclinical validation by detecting disease-associated glycosylation shifts in HCC serum samples.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in biomarker interpretation by isolating glycan-specific signals from total protein abundance.
- Disease-relevant Application: Extends beyond hepatocellular carcinoma to pancreatic cancer, diabetes, and Alzheimer’s disease, supporting broad therapeutic area relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling glycan profiling after target identification and before lead optimization, particularly when glycosylation is a known modulator of protein function or biomarker performance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping glycosylation changes on specific proteins in complex mixtures.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, blocking, and detection steps that yield consistent fluorescence readouts.
- Analytics: Provides quantitative glycan measurements via biotinylated lectin binding and Dylight 549-Streptavidin detection, enabling inter-sample comparison.
- Translational Research: Links to preclinical continuity by profiling glycosylation alterations in serum samples reflective of disease state.
- Enterprise Reuse: Positions the microarray as a reusable platform for glycosylation screening across projects, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycosylation-biomarker relationships.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through simplified chemical blocking using glutamic acid hydrazide, enabling one-day workflow completion.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by lowering per-sample cost and accelerating go/no-go decisions in biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycosylation signatures with strong disease association early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody microarray handling, fluorescence detection, and glycan-binding protein reagents.
- Depends on access to a microarray printer, fluorescence scanner, and incubation chambers with temperature control.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, lectin selection, and data analysis templates for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-serum sample types such as tissue lysates or cell culture supernatants.
- Includes practical limitations such as antibody stability post-modification and the need for multiple antibody sources to mitigate affinity loss.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:19
Printing the Antibody Microarray
3:58
Chemically Blocking the Antibody Microarray
6:06
Blocking Non-specific Binding with BSA
6:47
Wax Imprinting
7:11
Applying Serum Samples
8:19
Applying Biotinylated Glycan-binding Protein
9:00
Applying Dye-labeled NeutrAvidin and Fluorescence Detection
10:03
Data Extraction and Analysis
12:08
Conclusion
