Meten Intracellulaire Ca ^{2 +} Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Het algemene doel van deze procedure is om intracellulaire calciumfluctuaties in menselijke spermacellen te meten met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Dit wordt bereikt door eerst de spermamonsters voor te bereiden met de swim-up-methode en indien nodig capacitatie te bevorderen. De tweede stap is om de spermacellen te laden met een calcium-fluorescente kleurstof.

Vervolgens, met behulp van conventionele fluorometrie, stopped flow-fluorometrie, flowcytometrie of enkelcelbeeldvorming, voer het experiment uit en registreer de calciummetingen. Uiteindelijk worden de resultaten geanalyseerd om veranderingen in intracellulaire calciumconcentraties te bepalen die worden veroorzaakt door progesteron of tijdens het capacitatieproces. Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals die welke radioactiviteit gebruiken, is dat dit een zeer gevoelige procedure is.

Het is veilig en gemakkelijk uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van calciumsignalering in SPR, zoals de identificatie van verbindingen die intracellulair calcium induceren, met hoge ruimtelijke en temporele resolutie en de identificatie van verschillende cellulaire subpopulaties in een zaadmonster. De implicaties van het gebruik van bijvoorbeeld de flowcytometrie-techniek strekken zich uit tot de diagnose van vruchtbaarheidsproblemen door de analyse van de fysiologische toestand van mannelijke gameten.

Hoewel deze methode inzichten kan bieden in de studie van calciummobilisatie van menselijke spermacellen, kan deze ook worden toegepast op andere typen cellen zoals mannelijke gameten van andere soorten of verschillende typen cellen zoals neuronen of spiercellen. Over het algemeen zullen personen die deze methode gebruiken, worstelen omdat het hanteren van sperma niet gemakkelijk is en het is belangrijk om passende omstandigheden te handhaven om levensvatbare en motorische cellen te verkrijgen tijdens het experiment. We hebben het gebruik van deze technieken geïmplementeerd door strategieën uit verschillende velden te combineren.

Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, aangezien voorbereiding en hantering van het monster, evenals het toevoegen van de verbindingen moeilijk te leren zijn omdat spermacellen tijdens de procedure kunnen worden beschadigd en artefacten in de reacties kunnen worden verkregen tijdens de toevoeging van de verbindingen. Om het spermamonster voor te bereiden, moet één milliliter van het Hams F 10-medium voorzichtig bovenop elk 500 microliter vloeibaar sperma worden gedruppeld. Eloqua, raak de wand van de buis aan met de punt van de micropipet en giet voorzichtig het medium boven het monster.

Het is cruciaal om dit langzaam te doen om te voorkomen dat de monsters en mediumlagen worden gemengd. Het medium wordt aangevuld met twee millimolair calciumchloride en vijf milligram per milliliter BSA. Om capacitatie in vitro te bevorderen, leun de buisjes voorzichtig tot ongeveer een hoek van 30 graden.

Dit zal het oppervlak tussen de twee vloeistoffen vergroten, waardoor de verplaatsing of swim-up van spermacellen uit het monster naar het medium tijdens incubatie wordt verbeterd. Plaats vervolgens de gekantelde testbuisjes gedurende één uur in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. 95% lucht na één uur.

Gebruik een micropipet om voorzichtig de bovenste 700 microliter van het Hams F 10-medium dat nu motiele spermatozoa bevat, uit elke buis te verwijderen. Verzamel alle verzamelde monsters in één schone glazen buis, waarbij bubbeltjesvorming wordt vermeden. Plaats 10 microliter van het gepoolde monster op het optische platte glas van een macular tellingskamerbasis en plaats het dekglas.

Zorg ervoor dat u bubbeltjesvorming in de kamer vermijdt, omdat dit zou resulteren in een onnauwkeurige celtelling. Observeer onder een samengesteld microscoop uitgerust met een 20 x objectief. Het dekglas van de macular tellingskamer heeft een groot vierkant dat bestaat uit 100 kleinere vierkantjes.

Tel de cellen in een willekeurige strook van 10 vierkantjes. Dit aantal vertegenwoordigt de celconcentratie in miljoenen cellen per milliliter. Herhaal de telling in twee extra stroken van 10 vierkantjes en bereken het gemiddelde van de drie tellingen om cellen met een fluorescente kleurstof te laden.

Combineer in een fugebuis van 1,5 milliliter, het vereiste volume van spermasuspensie met voldoende één millimolair flu oh 3:00 AM-stamkleurstofoplossing om een ​​eindconcentratie van twee micromolair flu oh 3:00 AM te verkrijgen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en bescherm tegen licht. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 750 G. De vorming van een wolk in plaats van een pellet duidt erop dat de cellen in goede conditie zijn, aspireer en gooi het supernatant weg en suspendeer het pellet in het juiste volume menselijk sperma-medium of HSM. Om dit experiment te beginnen, combineer in een glazen buis met een platte bodem, 570 microliter HSM en 30 microliter spermacelsuspensie die eerder is geladen met flu oh 3:00 AM en gesuspendeerd in HSM om een ​​keer 10 tot de achtste cellen per milliliter te verkrijgen.

Plaats een magnetische roerder in de glazen buis en steek de buis in de leeskamer van de spectrofotometer die voorverwarmd is tot 37 graden Celsius. Het monster moet gedurende de gehele acquisitietijd worden geroerd. Start het experiment met behulp van de oli-software en ga door met het verzamelen van fluorescentiewaarden met een frequentie van 0,5 hertz gedurende 300 seconden.

Na het verzamelen van basale fluorescentie gedurende 30 seconden, gebruik een Hamilton Micro-spuit om het juiste volume van het testverbinding in dit geval voor micromolair progesteron bij 100 seconden te injecteren. Bij 20 micromolair ion mycin als positieve controle om de maximale fluorescentiewaarde te verkrijgen. In dit experiment worden intracellulaire calciumveranderingen met hoge temporele resolutie gemeten.

Met behulp van een SFM 20 gestopt flow-mixer gekoppeld aan een rabied kinetics optisch systeem, vul één van de instrumentenspuiten met één milliliter van flu. 3:00 AM geladen spermacellen en de tweede spuit met één milliliter van de te testen verbinding. 20 micromolair progesteron opgelost in HSM.

In dit voorbeeld is het van cruciaal belang om bubbeltjesvorming te voorkomen tijdens het trekken