Name: Meten Intracellulaire Ca 2 + Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Leer intracellulaire calciumfluctuaties meten in menselijk sperma met fluorometrie, flowcytometrie en single cell imaging. Deze gevoelige methode volgt spatio-temporele veranderingen tijdens capacitatie en progesteronstimulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Jose Luis De la Vega, Erika Melchy en Dr Takuya Nishigaki voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-Mexico) (99.333 en 128.566 naar CT); Dirección General de Asuntos del Persoonlijke Academico / Universidad Nacional Autónoma de Mexico (IN202212-3 naar CT).

<ol><li>Bouschet, T., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+as+an+extracellular+signalling+molecule%3A+perspectives+on+the+Calcium+Sensing+Receptor+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain.</a> Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).</li>
<li>Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+in+the+development%2C+maturation%2C+and+function+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa.</a> Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+soluble+adenylyl+cyclase+are+infertile+because+of+a+severe+sperm-motility+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).</li>
<li>Avenarius, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+male+infertility+caused+by+mutations+in+the+CATSPER1+channel+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein.</a> American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).</li>
<li>Carlson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+native+CatSper+channels+reveals+a+required+role+in+maintenance+of+sperm+hyperactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation.</a> PLoS ONE. 4, e6844(2009).</li>
<li>Brokaw, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+flagellar+response+during+the+chemotaxis+of+bracken+spermatozoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids.</a> J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121, 1139-1150 (1995).</li>
<li>Svahn, H. A., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+or+large+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Single cells or large populations.</a> Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).</li>
<li>Strunker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Male+Fertility+by+Spermatozoan+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels.</a> Annu. Rev. Physiol. , (2011).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).</li>
<li>Kilic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+progesterone%3A+a+new+tool+for+studying+rapid+nongenomic+actions+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BSA-induced+Ca2%2B+influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119(2009).</li>
<li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+sperm+capacitation%3A+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li>
<li>Baldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+accumulation+and+responsiveness+to+progesterone+in+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa.</a> J. Androl. 12, 323-330 (1991).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Intracellulaire signalering is essentieel voor de meeste cellulaire activiteiten, Ca 2 + is een alomtegenwoordige boodschapper die zoogdiercellen begeleidt gedurende hun gehele levensduur, van het begin bij de bevruchting, tot het einde van hun levenscyclus. In reactie op verschillende stimuli, [Ca 2 +] i toeneemt, oscilleert en neemt spatio-temporele codering, worden bijgevolg diverse processen geactiveerd, gemoduleerd of beëindigd door Ca 2 +-gecodeerde berichten. Intracellulaire Ca <s...

Ca 2 + is een universele tweede boodschapper van signaaltransductie in eukaryote cellen. Intracellulaire Ca 2 + (Ca 2 + i) neemt deel aan de regulatie van vele fundamentele fysiologische processen zowel prikkelbaar en niet-exciteerbare cellen. Het belang en de universaliteit van Ca 2 + als tweede boodschapper tijdens signaaltransductie gebeurtenissen wordt afgeleid uit zijn tijdruimtelijke veelzijdigheid in de overdracht van informatie binnen de cel. Terwijl Ca2 + kan niet worden gesynthetiseerd of afgebroken in de cel, de intracellulaire concentratie ([Ca2 +] i) blijven binnen zeer enge grenzen door verschillende cellulaire mechanismen die continu buffer, sekwestreren, hokjes en / of verzamelen Ca2 +. Veranderingen in de concentratie van deze ionen kan op zeer gelokaliseerde gebieden binnen de cel 1 en ontcijferen dergelijke schommelingen essentieel voor het verkrijgen van een deEPER begrip van (1) hun rol in de signalering mechanisme, (2) hun fysiologische betekenis, en (3) de algemene mechanismen van cell signaling. Ca 2 +-gemedieerde signaaloverdracht is van bijzonder belang in spermafysiologie 2. De beweeglijkheid van sperma is een van de belangrijkste functies voor bevruchting succes en in feite kunnen verschillende motiliteit gebreken steriliteit 3-5 veroorzaken. Het belang van Ca2 + in flagellaire beweging sinds lang bekend 6, maar is het mechanisme van hoe Ca2 + controleert de specifieke vorm van flagellaire buigen niet volledig begrepen. Voordat fuseren met het ei, moet spermatozoa capacitation, een complex proces afhankelijk sperma residence in het vrouwelijke darmkanaal ondergaan. Tijdens capacitation, worden de zaadcellen membraan lipide architectuur en organisatie aangepast, voornamelijk als gevolg van cholesterol verwijdering uit de plasmamembraan. Bovendien zijn een aantal eiwitten tyrosine-fosforylated 7. Belangrijker is dat uit capacitation er een toename in de intracellulaire pH (pH i) en [Ca 2 +] i, en de membraanpotentiaal hyperpolariseert bij sommige species 2. Capacitatie vindt alleen plaats in een subpopulatie van spermatozoa (20-40%), en het betrokken zijn bij al deze cellulaire veranderingen mechanismen zijn verre van duidelijk. Algemeen wordt aangenomen dat slechts een subpopulatie van capacitated zaadcellen ondergaan acrosoomreactie (AR) bij blootstelling aan fysiologische spoelen. De AR is een Ca2 +-gereguleerde geval gehouden meststof voor alle soorten bezitten een acrosome (gespecialiseerd organel met buitenste en binnenste membranen). Tijdens dit proces worden de buitenste membraan acrosomale zekeringen met plasmamembraan van het sperma, het vrijgeven van hydrolytische enzymen die het mogelijk maken de zaadcel naar de glyco-eiwit-matrix rond het ei (zona pellucida, of ZP) penetreren. De AR onthult een nieuwe fusogenic zaadcel oppervlak dat samenwerkt methet ei plasmamembraan voor de uiteindelijke fusie van beide gameten. Er zijn verschillende cellulaire liganden die induceren AR, progesteron een van de meest bestudeerde onder hen. In dit werk presenteren we vier verschillende technieken met gebruik van een Ca2 +-gevoelige fluorescente kleurstof te meten [Ca 2 +] i veranderingen in menselijk sperma veroorzaakt door progesteron (behalve flowcytometrie, waarin wij meten de [Ca 2 + ] i verhoging geïnduceerd tijdens de in vitro capacitation proces). In dit geval gebruikten we Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), een membraan-doorlatende kleurstof met een Kd = 325 nM. In vitro bewaakt we fluorescentie verandert als een functie van tijd met drie van de methoden, en met de vierde techniek die we gemeten fluorescentie waarde op een bepaald tijdstip. Deze verschillende benaderingen vullen elkaar aan, omdat helemaal bieden zij de ruimtelijke en temporele resolutieolution op zowel de enkele cel en cel-populatie niveau. Cel Bevolking of Bulk Experimenten Bulk technieken worden veel gebruikt niet alleen omdat de instrumenten die zij nodig zijn direct beschikbaar, maar ook omdat ze eenvoudig, goed ingeburgerd, en zorgen voor de middeling van de gegevens van metingen op miljoenen cellen in een enkel experiment. Techniek # 1. Conventionele fluorometrie Deze techniek bewaakt veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, de experimenten worden uitgevoerd in glazen cuvetten met monsterhoeveelheden van 200 tot 1.000 III. Goede menging van de toegevoegde reagentia vereist magnetisch roeren, en derhalve de temporele resolutie verkregen in de orde van seconden. De normale mobiele concentratiebereik van de geanalyseerde monsters 10 5 -10 8 cellen / ml. Techniek # 2. Gestopt Flow fluorometrie Tzijn techniek volgt ook veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, maar de reagentia worden snel gemengd (met druk) in een opname cuvet met een zeer klein monstervolume (variërend 25-100 pl). Daarom homogenisering van reagentia onmiddellijk, waardoor een hoge temporele resolutie in de orde van milliseconden. Analyse van de verkregen fluorescentie vs tijd sporen geschikt voor het bepalen van reactiesnelheden, ophelderen van de complexiteit van het reactiemechanisme, verkrijgen van informatie over kortstondige reactietussenproducten, etc. De gemeenschappelijke cel concentratiebereik van de geanalyseerde monsters 10 5 -10 7 cellen / ml. Single Cell Experimenten Bulk experimenten rapporteren het gemiddelde gedrag van een groot aantal cellen, maar kan een populatie vertonen vaak heterogeen kenmerken die het hoofd gezien gedurende deze soort metingen. Enkele cel technieken worden dus gebruikt om e te vullene informatie verkregen met celpopulatie experimenten. Techniek # 3. Flowcytometrie Ondanks het belang van de gegevens verkregen uit een cel metingen is het belangrijk om een ​​groot aantal cellen te analyseren om de onjuiste extrapolatie van celspecifieke eigenschappen om een ​​gehele populatie te voorkomen. Daarom worden high-throughput technieken voorkeur en de meest populaire methode is flowcytometrie, waarbij 10.000 cellen per conditie conventioneel geanalyseerd. Deze methode maakt multi-parametrische analyse van heterogene bevolking als het categoriseert cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing (FSC)), granulariteit (zijwaartse verstrooiing (SSC)) en fluorescentie-intensiteit (specifieke etiketteringsvoorschriften met een antilichaam, levensvatbaarheid marker, enz.) , waardoor het verstrekken van informatie over de distributie van de parameters &#39;voor een groep cellen. Flowcytometrie biedt direct plaats tijdsafhankelijke informatie 8. Voorwaartse en zijwaartse verstrooiing waarden are ook nuttig voor het selecteren van een poort die cellen omvat maar discrimineert celresten, stof, enz. Voor fluorescentiemetingen, negatieve en positieve controles fluorescentie moet worden opgenomen. Als meer dan een fluorescentie kanaal wordt gebruikt, moet een proces dat bekend staat als compensatie worden uitgevoerd (voor details zie <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensatie zorgt voor spectrale overlap discriminatie tussen fluoroforen. Flowcytometrie kan ook discriminatie van dode cellen, gewoonlijk door middel van propidium jodide kleuring. Techniek # 4. Single Cell Imaging Microscopie is een andere veel voorkomende methode om enkele cel gedrag te bestuderen, het is goed geschikt voor tijdsafhankelijke studies en het biedt ook ruimtelijke resolutie. Een belangrijk nadeel is dat de hoge-doorvoer analyse is nog in de kinderschoenen momenteel <sup&gt; 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Makler Counting Chamber</td><td>SEFI Medical Instruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 vials/50 &mu;g elk</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Sodium L-lactate (aprox. 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L- 7022</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Propidium Iodide </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Component B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-Octylfenoxypolyethoxyethanol)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>X-100</td><td>2,4 mM oplossing in water </td></tr><tr><td>Round coverslip </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>25 mm diameter</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Cell Chamber, voor microscopie</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

meten intracellulaire ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; veranderingen in human sperm behulp vier technieken: conventionele fluorometrie, gestopt flow fluorometrie, flowcytometrie en single cell imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa zijn mannelijke voortplantingscellen speciaal ontworpen om te bereiken, herkennen en fuseren met het ei. Om deze taken uit te voeren, moet zaadcellen bereid zijn een voortdurend veranderende omgeving geconfronteerd en diverse fysieke barrières te overwinnen. Omdat het in wezen transcriptioneel en translationeel stille, deze beweeglijke cellen vertrouwen diep op diverse signalerende mechanismen om zich te oriënteren en zwemmen in een gerichte manier, en te kampen met uitdagende omgevingsomstandigheden tijdens hun reis naar de eicel te vinden. Vooral Ca 2 +-gemedieerde signalering is cruciaal voor meerdere sperma functies: activering van motiliteit, capacitation (een complex proces dat sperma de acrosoomreactie bereidt) en acrosoomreactie (exocytotische een gebeurtenis die sperma-ei fusie maakt). Het gebruik van fluorescente kleurstoffen intracellulaire fluctuaties van deze ionen volgen is opmerkelijk belang vanwege hun gemak van toepassing, gevoeligheid en veelzijdigheid van deteel. Met behulp van een enkele dye-loading protocol gebruiken we vier verschillende fluorometrische technieken om toezicht te houden sperma Ca 2 + dynamiek. Elke techniek geeft duidelijke informatie die het mogelijk maakt ruimtelijke en / of temporele resolutie, het genereren van data zowel op enkele cel en cel-populatie niveau.

<img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van het experimentele protocol voor sperma monstervoorbereiding door de opzwem-methode. De belangrijkste stappen voor het scheiden van beweeglijk sperma of de aanpassing van de concentratie geïllustreerd. De laatste incubatie stap wordt alleen uitgevoerd wanneer capacitation vereist. ...

Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamieken zijn erg belangrijk in spermafysiologie en Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Gevoelige fluorescente kleurstoffen vormen een veelzijdige tool om ze te bestuderen. Bevolking experimenten (fluorometrie en stopte doorstroming fluorometrie) en single cell experimenten (flowcytometrie en single cell imaging) worden gebruikt voor het volgen tijdruimtelijke [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Veranderingen in de menselijke zaadcellen.

Meten Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van intracellulaire calciumfluctuaties in menselijke spermacellen met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Dit wordt bereikt door eerst het spermapreparaat voor te bereiden via de swim-up methode en, indien nodig, de capacitatie te bevorderen. De tweede stap is het laden van de spermacellen met een calciumfluorescerende kleurstof.Voer vervolgens het experiment uit en registreer de calciummetingen met behulp van conventionele fluorometrie, stopped-flow fluorometrie, flowcytometrie of single-cell imaging. Uiteindelijk worden de resultaten geanalyseerd om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentraties te bepalen die worden getriggerd door progesteron of tijdens het capacitatieproces. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die waarbij gebruik wordt gemaakt van radioactiviteit, is dat dit een zeer gevoelige procedure is.Het is veilig en eenvoudig uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van SPR-calciumsignalering, zoals de identificatie van verbindingen die intracellulaire calciumtoenames induceren met een hoge ruimtelijke en t

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Technieken voor Imaging Ca 2 + Signalering in Human Sperm

Calcium is betrokken bij tal van fysiologische en pathofysiologische signaalwegen. Live cell imaging vereist gespecialiseerde apparatuur en kan tijdrovend zijn. Een snelle, eenvoudige werkwijze met een flow cytometer om relatieve veranderingen in cytosolische calcium in hechtende epitheelcellen gebracht suspensie bepalen geoptimaliseerd.

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Hier presenteren we methodologieën voor evaluatie van spermatozoan membraan integriteit, een cellulaire functie sperma bevruchting bevoegdheid is gekoppeld. We beschrijven drie technieken voor de beoordeling van de fluorimetrische van sperma membranen: gelijktijdige kleuring met specifieke fluorescerende sondes, fluorescentie microscopie en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry. Voorbeelden van het combineren van de methoden worden ook gepresenteerd.

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Hier, twee medium-throughput assays voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma worden beschreven. Deze tests kunnen worden gebruikt om te sluiten snel en eenvoudig grote hoeveelheden compounds voor effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma.

Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

Dit protocol beschrijft hoe elektrische opnames van zaadcellen van zoogdieren in een configuratie van de hele cel kunnen worden uitgevoerd, met als doel de activiteit van het ionkanaal direct vast te leggen. De methode heeft een belangrijke rol gespeeld bij het beschrijven van de elektrofysiologische profielen van verschillende sperma-ionkanalen en heeft geholpen om hun moleculaire identiteit en regulatie te onthullen.

Registratie van elektrische stromen over het plasmamembraan van zaadcellen van zoogdieren

Het huidige protocol biedt een praktische oplossing die het mogelijk maakt om apoptose, mitochondriaal membraanpotentiaal en DNA-schade in menselijk sperma te meten met een enkele cytometer.

Flowcytometrische analyse van biomarkers voor het detecteren van functionele defecten van menselijk sperma

Het AcroSensE-muismodel en de hier beschreven beeldvormingsmethoden voor levende cellen bieden een nieuwe benadering voor het bestuderen van de calciumdynamiek in het subcellulaire compartiment van het sperma-acrosoom en hoe deze tussenstappen reguleren die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.

Real-time beeldvorming van acrosomale calciumdynamiek en exocytose in levend muizensperma

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

Leer intracellulaire calciumfluctuaties meten in menselijk sperma met fluorometrie, flowcytometrie en single cell imaging. Deze gevoelige methode volgt spatio-temporele veranderingen tijdens capacitatie en progesteronstimulatie.

Meten Intracellulaire Ca 2 + Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging (Video) | JoVE Journal

Meten Intracellulaire Ca

Meer video's verkennen