Name: Meten Intracellulaire Ca 2 + Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Leer intracellulaire calciumfluctuaties meten in menselijk sperma met fluorometrie, flowcytometrie en single cell imaging. Deze gevoelige methode volgt spatio-temporele veranderingen tijdens capacitatie en progesteronstimulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Jose Luis De la Vega, Erika Melchy en Dr Takuya Nishigaki voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-Mexico) (99.333 en 128.566 naar CT); Dirección General de Asuntos del Persoonlijke Academico / Universidad Nacional Autónoma de Mexico (IN202212-3 naar CT).

<ol><li>Bouschet, T., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+as+an+extracellular+signalling+molecule%3A+perspectives+on+the+Calcium+Sensing+Receptor+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain.</a> Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).</li>
<li>Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+in+the+development%2C+maturation%2C+and+function+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa.</a> Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+soluble+adenylyl+cyclase+are+infertile+because+of+a+severe+sperm-motility+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).</li>
<li>Avenarius, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+male+infertility+caused+by+mutations+in+the+CATSPER1+channel+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein.</a> American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).</li>
<li>Carlson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+native+CatSper+channels+reveals+a+required+role+in+maintenance+of+sperm+hyperactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation.</a> PLoS ONE. 4, e6844(2009).</li>
<li>Brokaw, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+flagellar+response+during+the+chemotaxis+of+bracken+spermatozoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids.</a> J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121, 1139-1150 (1995).</li>
<li>Svahn, H. A., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+or+large+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Single cells or large populations.</a> Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).</li>
<li>Strunker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Male+Fertility+by+Spermatozoan+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels.</a> Annu. Rev. Physiol. , (2011).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).</li>
<li>Kilic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+progesterone%3A+a+new+tool+for+studying+rapid+nongenomic+actions+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BSA-induced+Ca2%2B+influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119(2009).</li>
<li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+sperm+capacitation%3A+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li>
<li>Baldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+accumulation+and+responsiveness+to+progesterone+in+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa.</a> J. Androl. 12, 323-330 (1991).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Intracellulaire signalering is essentieel voor de meeste cellulaire activiteiten, Ca 2 + is een alomtegenwoordige boodschapper die zoogdiercellen begeleidt gedurende hun gehele levensduur, van het begin bij de bevruchting, tot het einde van hun levenscyclus. In reactie op verschillende stimuli, [Ca 2 +] i toeneemt, oscilleert en neemt spatio-temporele codering, worden bijgevolg diverse processen geactiveerd, gemoduleerd of beëindigd door Ca 2 +-gecodeerde berichten. Intracellulaire Ca <s...

Ca 2 + is een universele tweede boodschapper van signaaltransductie in eukaryote cellen. Intracellulaire Ca 2 + (Ca 2 + i) neemt deel aan de regulatie van vele fundamentele fysiologische processen zowel prikkelbaar en niet-exciteerbare cellen. Het belang en de universaliteit van Ca 2 + als tweede boodschapper tijdens signaaltransductie gebeurtenissen wordt afgeleid uit zijn tijdruimtelijke veelzijdigheid in de overdracht van informatie binnen de cel. Terwijl Ca2 + kan niet worden gesynthetiseerd of afgebroken in de cel, de intracellulaire concentratie ([Ca2 +] i) blijven binnen zeer enge grenzen door verschillende cellulaire mechanismen die continu buffer, sekwestreren, hokjes en / of verzamelen Ca2 +. Veranderingen in de concentratie van deze ionen kan op zeer gelokaliseerde gebieden binnen de cel 1 en ontcijferen dergelijke schommelingen essentieel voor het verkrijgen van een deEPER begrip van (1) hun rol in de signalering mechanisme, (2) hun fysiologische betekenis, en (3) de algemene mechanismen van cell signaling. Ca 2 +-gemedieerde signaaloverdracht is van bijzonder belang in spermafysiologie 2. De beweeglijkheid van sperma is een van de belangrijkste functies voor bevruchting succes en in feite kunnen verschillende motiliteit gebreken steriliteit 3-5 veroorzaken. Het belang van Ca2 + in flagellaire beweging sinds lang bekend 6, maar is het mechanisme van hoe Ca2 + controleert de specifieke vorm van flagellaire buigen niet volledig begrepen. Voordat fuseren met het ei, moet spermatozoa capacitation, een complex proces afhankelijk sperma residence in het vrouwelijke darmkanaal ondergaan. Tijdens capacitation, worden de zaadcellen membraan lipide architectuur en organisatie aangepast, voornamelijk als gevolg van cholesterol verwijdering uit de plasmamembraan. Bovendien zijn een aantal eiwitten tyrosine-fosforylated 7. Belangrijker is dat uit capacitation er een toename in de intracellulaire pH (pH i) en [Ca 2 +] i, en de membraanpotentiaal hyperpolariseert bij sommige species 2. Capacitatie vindt alleen plaats in een subpopulatie van spermatozoa (20-40%), en het betrokken zijn bij al deze cellulaire veranderingen mechanismen zijn verre van duidelijk. Algemeen wordt aangenomen dat slechts een subpopulatie van capacitated zaadcellen ondergaan acrosoomreactie (AR) bij blootstelling aan fysiologische spoelen. De AR is een Ca2 +-gereguleerde geval gehouden meststof voor alle soorten bezitten een acrosome (gespecialiseerd organel met buitenste en binnenste membranen). Tijdens dit proces worden de buitenste membraan acrosomale zekeringen met plasmamembraan van het sperma, het vrijgeven van hydrolytische enzymen die het mogelijk maken de zaadcel naar de glyco-eiwit-matrix rond het ei (zona pellucida, of ZP) penetreren. De AR onthult een nieuwe fusogenic zaadcel oppervlak dat samenwerkt methet ei plasmamembraan voor de uiteindelijke fusie van beide gameten. Er zijn verschillende cellulaire liganden die induceren AR, progesteron een van de meest bestudeerde onder hen. In dit werk presenteren we vier verschillende technieken met gebruik van een Ca2 +-gevoelige fluorescente kleurstof te meten [Ca 2 +] i veranderingen in menselijk sperma veroorzaakt door progesteron (behalve flowcytometrie, waarin wij meten de [Ca 2 + ] i verhoging geïnduceerd tijdens de in vitro capacitation proces). In dit geval gebruikten we Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), een membraan-doorlatende kleurstof met een Kd = 325 nM. In vitro bewaakt we fluorescentie verandert als een functie van tijd met drie van de methoden, en met de vierde techniek die we gemeten fluorescentie waarde op een bepaald tijdstip. Deze verschillende benaderingen vullen elkaar aan, omdat helemaal bieden zij de ruimtelijke en temporele resolutieolution op zowel de enkele cel en cel-populatie niveau. Cel Bevolking of Bulk Experimenten Bulk technieken worden veel gebruikt niet alleen omdat de instrumenten die zij nodig zijn direct beschikbaar, maar ook omdat ze eenvoudig, goed ingeburgerd, en zorgen voor de middeling van de gegevens van metingen op miljoenen cellen in een enkel experiment. Techniek # 1. Conventionele fluorometrie Deze techniek bewaakt veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, de experimenten worden uitgevoerd in glazen cuvetten met monsterhoeveelheden van 200 tot 1.000 III. Goede menging van de toegevoegde reagentia vereist magnetisch roeren, en derhalve de temporele resolutie verkregen in de orde van seconden. De normale mobiele concentratiebereik van de geanalyseerde monsters 10 5 -10 8 cellen / ml. Techniek # 2. Gestopt Flow fluorometrie Tzijn techniek volgt ook veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, maar de reagentia worden snel gemengd (met druk) in een opname cuvet met een zeer klein monstervolume (variërend 25-100 pl). Daarom homogenisering van reagentia onmiddellijk, waardoor een hoge temporele resolutie in de orde van milliseconden. Analyse van de verkregen fluorescentie vs tijd sporen geschikt voor het bepalen van reactiesnelheden, ophelderen van de complexiteit van het reactiemechanisme, verkrijgen van informatie over kortstondige reactietussenproducten, etc. De gemeenschappelijke cel concentratiebereik van de geanalyseerde monsters 10 5 -10 7 cellen / ml. Single Cell Experimenten Bulk experimenten rapporteren het gemiddelde gedrag van een groot aantal cellen, maar kan een populatie vertonen vaak heterogeen kenmerken die het hoofd gezien gedurende deze soort metingen. Enkele cel technieken worden dus gebruikt om e te vullene informatie verkregen met celpopulatie experimenten. Techniek # 3. Flowcytometrie Ondanks het belang van de gegevens verkregen uit een cel metingen is het belangrijk om een ​​groot aantal cellen te analyseren om de onjuiste extrapolatie van celspecifieke eigenschappen om een ​​gehele populatie te voorkomen. Daarom worden high-throughput technieken voorkeur en de meest populaire methode is flowcytometrie, waarbij 10.000 cellen per conditie conventioneel geanalyseerd. Deze methode maakt multi-parametrische analyse van heterogene bevolking als het categoriseert cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing (FSC)), granulariteit (zijwaartse verstrooiing (SSC)) en fluorescentie-intensiteit (specifieke etiketteringsvoorschriften met een antilichaam, levensvatbaarheid marker, enz.) , waardoor het verstrekken van informatie over de distributie van de parameters &#39;voor een groep cellen. Flowcytometrie biedt direct plaats tijdsafhankelijke informatie 8. Voorwaartse en zijwaartse verstrooiing waarden are ook nuttig voor het selecteren van een poort die cellen omvat maar discrimineert celresten, stof, enz. Voor fluorescentiemetingen, negatieve en positieve controles fluorescentie moet worden opgenomen. Als meer dan een fluorescentie kanaal wordt gebruikt, moet een proces dat bekend staat als compensatie worden uitgevoerd (voor details zie <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensatie zorgt voor spectrale overlap discriminatie tussen fluoroforen. Flowcytometrie kan ook discriminatie van dode cellen, gewoonlijk door middel van propidium jodide kleuring. Techniek # 4. Single Cell Imaging Microscopie is een andere veel voorkomende methode om enkele cel gedrag te bestuderen, het is goed geschikt voor tijdsafhankelijke studies en het biedt ook ruimtelijke resolutie. Een belangrijk nadeel is dat de hoge-doorvoer analyse is nog in de kinderschoenen momenteel <sup&gt; 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Makler Counting Chamber</td><td>SEFI Medical Instruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 vials/50 &mu;g elk</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Sodium L-lactate (aprox. 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L- 7022</td><td>Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)</td></tr><tr><td>Propidium Iodide </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Component B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-Octylfenoxypolyethoxyethanol)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>X-100</td><td>2,4 mM oplossing in water </td></tr><tr><td>Round coverslip </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>25 mm diameter</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Cell Chamber, voor microscopie</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

meten intracellulaire ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; veranderingen in human sperm behulp vier technieken: conventionele fluorometrie, gestopt flow fluorometrie, flowcytometrie en single cell imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa zijn mannelijke voortplantingscellen speciaal ontworpen om te bereiken, herkennen en fuseren met het ei. Om deze taken uit te voeren, moet zaadcellen bereid zijn een voortdurend veranderende omgeving geconfronteerd en diverse fysieke barrières te overwinnen. Omdat het in wezen transcriptioneel en translationeel stille, deze beweeglijke cellen vertrouwen diep op diverse signalerende mechanismen om zich te oriënteren en zwemmen in een gerichte manier, en te kampen met uitdagende omgevingsomstandigheden tijdens hun reis naar de eicel te vinden. Vooral Ca 2 +-gemedieerde signalering is cruciaal voor meerdere sperma functies: activering van motiliteit, capacitation (een complex proces dat sperma de acrosoomreactie bereidt) en acrosoomreactie (exocytotische een gebeurtenis die sperma-ei fusie maakt). Het gebruik van fluorescente kleurstoffen intracellulaire fluctuaties van deze ionen volgen is opmerkelijk belang vanwege hun gemak van toepassing, gevoeligheid en veelzijdigheid van deteel. Met behulp van een enkele dye-loading protocol gebruiken we vier verschillende fluorometrische technieken om toezicht te houden sperma Ca 2 + dynamiek. Elke techniek geeft duidelijke informatie die het mogelijk maakt ruimtelijke en / of temporele resolutie, het genereren van data zowel op enkele cel en cel-populatie niveau.

<img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van het experimentele protocol voor sperma monstervoorbereiding door de opzwem-methode. De belangrijkste stappen voor het scheiden van beweeglijk sperma of de aanpassing van de concentratie geïllustreerd. De laatste incubatie stap wordt alleen uitgevoerd wanneer capacitation vereist. ...

Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamieken zijn erg belangrijk in spermafysiologie en Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Gevoelige fluorescente kleurstoffen vormen een veelzijdige tool om ze te bestuderen. Bevolking experimenten (fluorometrie en stopte doorstroming fluorometrie) en single cell experimenten (flowcytometrie en single cell imaging) worden gebruikt voor het volgen tijdruimtelijke [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Veranderingen in de menselijke zaadcellen.

Meten Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van intracellulaire calciumfluctuaties in menselijke spermacellen met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Dit wordt bereikt door eerst het spermapreparaat voor te bereiden via de swim-up methode en, indien nodig, de capacitatie te bevorderen. De tweede stap is het laden van de spermacellen met een calciumfluorescerende kleurstof.Voer vervolgens het experiment uit en registreer de calciummetingen met behulp van conventionele fluorometrie, stopped-flow fluorometrie, flowcytometrie of single-cell imaging. Uiteindelijk worden de resultaten geanalyseerd om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentraties te bepalen die worden getriggerd door progesteron of tijdens het capacitatieproces. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die waarbij gebruik wordt gemaakt van radioactiviteit, is dat dit een zeer gevoelige procedure is.Het is veilig en eenvoudig uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van SPR-calciumsignalering, zoals de identificatie van verbindingen die intracellulaire calciumtoenames induceren met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie, en de identificatie van verschillende cellulaire subpopulaties in een semenmonster. De implicaties van het gebruik van bijvoorbeeld de flowcytometrie-techniek strekken zich uit tot de diagnose van fertiliteitsproblemen door analyse van de fysiologische toestand van mannelijke gameten.Hoewel deze methode inzicht kan bieden bij de studie van calciummobilisatie in menselijke zaadcellen, kan deze ook worden toegepast op andere celtypen, zoals mannelijke gameten van andere soorten of verschillende typen cellen zoals neuronen of spiercellen. Over het algemeen zullen personen die deze methode gebruiken voor uitdagingen staan, aangezien het hanteren van zaadcellen niet eenvoudig is en het essentieel is om de juiste condities te handhaven om levensvatbare en motiele cellen gedurende het experiment te verkrijgen. Wij hebben de toepassing van deze technieken geïmplementeerd door strategieën uit verschillende vakgebieden te combineren.Een visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, aangezien de voorbereiding en hantering van het monster, evenals de toevoeging van de verbindingen, moeilijk aan te leren zijn omdat spermacellen tijdens de procedure kunnen beschadigen en er artefacten in de responsen kunnen optreden tijdens de toevoeging van de verbindingen. Om het spermaproef monster voor te bereiden, moet één milliliter hams F 10 medium zorgvuldig bovenop elke 500 microliter vloeibaar semen worden gelaagd. Raak met de tip van de micropipet de wand van de buis aan en breng het medium voorzichtig boven het monster over.Het is essentieel om dit langzaam te doen om te voorkomen dat de monster- en mediumlagen zich mengen. Het medium is aangevuld met twee millimol calciumchloride en vijf milligram per milliliter BSA. Om capacitatie in vitro te bevorderen, moeten de buisjes voorzichtig onder een hoek van ongeveer 30 graden worden geplaatst.Dit zal het oppervlak tussen de twee vloeistoffen vergroten, waardoor de verplaatsing of het wegzwemmen van spermacellen van het monster naar het medium tijdens de incubatie wordt bevorderd. Plaats vervolgens de schuine reageerbuisjes in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂ en 95% lucht gedurende één uur.Gebruik een micropipet om voorzichtig de bovenste 700 µL van het hams F 10-medium, dat nu motiele spermatozoön bevat, uit elke buis te verwijderen. Voeg alle verzamelde monsters samen in één enkele schone glazen buis en voorkom daarbij belvorming. Breng 10 µL van het samengevoegde monster aan op het optisch vlakke glas van de basis van een Macula-telkamer en plaats het dekglas.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kamer ontstaan, aangezien dit zou leiden tot een onjuiste celtelling. Observeer onder een samengestelde microscoop uitgerust met een 20 x objectief. Het dekglas van de macular telkamer bevat een groot vierkant dat is opgebouwd uit 100 kleinere vierkantjes.Tel de cellen in een willekeurige strook van 10 vakjes. Dit getal vertegenwoordigt de celconcentratie in miljoenen cellen per milliliter. Herhaal de telling in twee aanvullende stroken van 10 vakjes en bereken het gemiddelde van de drie tellingen om de cellen te laden met een fluorescente kleurstof.Combineer in een 1,5 milliliter centrifugebuis het benodigde volume spermasuspensie met voldoende één millimolair FluoH-3AM-stoomoplossing om een uiteindelijke concentratie van twee micromolair FluoH-3AM te verkrijgen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en bescherm tegen licht. Centrifugeer de buis bij 750 ×g gedurende vijf minuten. De vorming van een wolk in plaats van een pellet geeft aan dat de cellen in goede conditie zijn; aspireer en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in het juiste volume menselijk spermamedium of HSM. Combineer voor de start van dit experiment in een glazen buis met een platte bodem 570 µL HSM en 30 µL spermacelsuspensie die vooraf is geladen met FluoH-3AM en geresuspendeerd in HSM om een concentratie van 1 × 10⁸ cellen per milliliter te verkrijgen.Plaats een magnetische roerstaaf in de glazen buis en insert de buis in de meetkamer van de spectrometer die is voorverwarmd tot 37 °C. Het monster moet gedurende de gehele acquisitietijd worden geroerd. Start het experiment met de oli-software en verzamel fluorescentiewaarden met een frequentie van 0,5 hertz gedurende 300 seconden.Nadat de basale fluorescentie gedurende 30 seconden is vastgelegd, wordt een Hamilton-microspuit gebruikt om het juiste volume van de testverbinding te injecteren, in dit geval voor micromolaire progesteron bij 100 seconden. Gebruik 20 micromolair ionomycine als positieve controle om de maximale fluorescentiewaarde te verkrijgen. In dit experiment worden intracellulaire calciumveranderingen gemeten met een hoge temporele resolutie.Vul, met gebruik van een SFM 20 stopped-flow mengapparaat gekoppeld aan een rabid kinetics optisch systeem, één van de spuiten van het instrument met één milliliter geladen zaadcellen van flu. 3:00 AM en de tweede spuit met één milliliter van de te testen verbinding: 20 micromolaire progesteron opgelost in HSM.In dit voorbeeld is het essentieel om belvorming te vermijden bij het opzuigen van de vloeistoffen in de spuiten. Til beide instrumentzuigers op tot ze de tip van de spuitplungers raken. Stel de totale bemonstertijd in dit geval in op 50 seconden en de frequentie op 10 milliseconden om celbeschadiging te minimaliseren; stel de stroomsnelheid in op de minimale waarde die een meetbare responstrigger oplevert.Na het mengen van de reagentia wordt het verloop van de ruwe fluorescentie ten opzichte van de tijd op het computerscherm weergegeven. Herhaal deze procedure door progesteron te vervangen door HSM als negatieve controle en 10 µM ionomycin als positieve controle voorafgaand aan de flowcytometrie. Bereid de experimentele monsters voor door per cytometerbuis 500 µL cel-suspensie te plaatsen voor elke te testen conditie.Stel een experiment in met behulp van de software van het apparaat. Maak eerst een nieuwe map, een experimenteel specimen en het aantal buisjes aan. Selecteer vervolgens de juiste cytometerinstellingen voor flu O 3:00 AM. Gebruik de filters voor fluoresceïne-isothiocyanaat en propidiumjodide.Analyseer de ongekleurde controlebuisjes één en twee in de cytometer. Verzamel gegevens over de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (forward and side scatter) om te verifiëren of de drempelinstellingen correct zijn en om de bijbehorende gate aan te maken om debris van cellen te onderscheiden. Analyseer de experimentele buisjes en verzamel fluorescentiegegevens van 10.000 events per monster.Aan het einde. Exporteer alle gegevens naar de software die beschikbaar is voor analyse. Bereid de ronde dekglasjes voor die nodig zijn voor deze procedure door een druppel van 5 µL poly-L-lysine-oplossing op het centrum van elk dekglasje aan te brengen.Laat dit gedurende ten minste één uur staan; spoel vóór gebruik het behandelde gebied af met water. Dit verwijdert overtollig polylysine, waardoor spermacellen met hun kop aan het dekglas kunnen hechten terwijl hun flagellen nog kunnen bewegen. Plaats het dekglas in de opnamekamer.Plaats 10 µL flu oh 3:00 AM geladen cellen bij een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per mL in het centrum van het dekglas. Bedek de cellen met 200 µL voorverwarmd HSM.Plaats de kamer op de tafel van de microscoop, vooraf verwarmd tot 37 °C, en bekijk de cellen met fasecontrast. Selecteer een gebied waar de celdichtheid geschikt is voor beeldvorming. Te veel cellen maken de analyse lastig door overlappende signalen.De cellen moeten met hun kop stevig aan het dekglas vastzitten, maar wel flagelbeweging vertonen, wat de levensvatbaarheid bevestigt. Start het experiment door de software voor tijdserie-beeldacquisitie te activeren. Gewoonlijk zijn vier beelden per seconde vereist met een belichting van twee milliseconden per beeld.Neem fluorescentiebeelden op in de live-modus. Pas de focus en helderheid aan. Gebruik een micropipet om de testverbinding, in dit geval progesteron, voorzichtig druppelsgewijs toe te voegen en ga verder met de beeldacquisitie zoals vereist.Voer twee opeenvolgende controletoevoegingen uit in dezelfde kamer. 20 µM ionomycin om maximale fluorescentie te verkrijgen en 5 mM mangaanchloride om minimale fluorescentie te verkrijgen. Voer de beeldanalyse offline uit met behulp van IQ-software.Teken de regio's van belang (regions of interest of ROI's) rond elke cel of elk deel van een cel. Selecteer daarnaast een celvrij gebied voor automatische achtergrondcorrectie door de software. Vervolgens wordt voor elke ROI een tijdserie van de fluorescentie-intensiteit verkregen; deze gegevens kunnen worden geëxporteerd naar Microsoft Excel voor verdere analyse.Progesteron is een van de bekende inductoren van de acrosomreactie en veroorzaakt, zoals verwacht, een kortstondige toename van de intracellulaire calciumconcentratie in menselijke sperma, gemeten via conventionele fluorometrie. De rode fluorescentiecurve ten opzichte van de tijd toont de veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie veroorzaakt door de toevoeging van 4 µM progesteron; als negatieve controle werd HSM toegevoegd, wat geen enkele verandering in de intracellulaire calciumconcentraties veroorzaakte, zoals aangegeven door de blauwe fluorescentiecurve. De verandering geïnduceerd door 10 µM ionomycine is voor elke curve weergegeven als positieve controle.Toevoeging van deze calciumionofoor veroorzaakt de maximale toename van de cellulaire calciumconcentratie in RA, die niet terugkeert naar de basale niveaus. Deze staafgrafiek toont de gemiddelde verandering in fluorescentie delta F voor elke conditie, plus of min de standaardfout waarbij N gelijk is aan drie en het asterisk een P-waarde van minder dan 0,001 aangeeft vergeleken met de controle. De door progesteron geïnduceerde toename van de intracellulaire calciumconcentratie werd gemeten met een hogere temporele resolutie via stopped-flow fluorometrie en representatieve resultaten worden hier getoond.Ruwe sporen worden getoond in paneel A; zowel progesteron (weergegeven door de rode lijn) als ionomycines (weergegeven door de blauwe lijn) veroorzaakten een snelle toename van de intracellulaire calciumconcentratie. Het groene spoor is de negatieve controle waarin cellen waren gemengd met HSM. Paneel B toont gecorrigeerde sporen voor de signalen die zijn geïnduceerd met progesteron of met ionomycines, verkregen door het controlesignaal af te trekken van de overeenkomstige ruwe signalen.Progesteron veroorzaakte een zeer snelle en voorbijgaande toename van de intracellulaire calciumconcentratie, met een maximale fluorescentiewaarde 2,7 seconden na toevoeging van de inductor. CIN veroorzaakte daarentegen een snelle en aanhoudende toename van de intracellulaire calciumconcentratie gedurende 50 seconden. Het inzetstuk in paneel B toont een vergroot overzicht van de eerste 500 milliseconden voor elke respons.Het uitblijven van een vertraging bij de door progesteron geïnduceerde toename van de intracellulaire calciumconcentratie is consistent met eerdere rapporten waarin wordt gesuggereerd dat progesteron het calciumkanaal CatSper direct activeert zonder tussenliggende signalering. De intracellulaire calciumconcentratie werd tevens gemeten in gecapaciteerde en niet-gecapaciteerde menselijke spermacellen met behulp van flowcytometrie. In deze representatieve forward- en side-scatter plots.Gecapaciteerde cellen zijn blauw en niet-gecapaciteerde cellen zijn rood. De geselecteerde gate wordt aangegeven met de blauwe lijn en alleen de cellen binnen dat gebied werden gebruikt voor verdere analyse. Paneel B toont het fluorescentiehistogram in het Fitzy-kanaal van ongekleurde spermatozoa, en paneel D toont het fluorescentiehistogram in het FZ-kanaal van flu oh 3:00 AM gekleurde spermatozoa zoals waargenomen in Paneel D. De distributie van fluorescentiewaarden voor gecapaciteerde sperma, weergegeven door de blauwe lijn, is verschoven naar hogere waarden vergeleken met niet-gecapaciteerde sperma, weergegeven door de rode lijn.Paneel C toont het fluorescentiehistogram in het PI-kanaal van ongekleurde cellen en paneel E toont het fluorescentiehistogram in het PI-kanaal van dode cellen. De fluorescentiewaarden voor elke individuele cel kunnen worden waargenomen in de tweedimensionale fluorescentie-dotplots die hier worden getoond. Voor ongekleurde cellen en cellen die dubbel zijn gekleurd met flu oh 3:00 AM en pi, wordt het percentage cellen dat in elk kwadrant is geregistreerd aangegeven door het rode getal.Belangrijk is dat het signaal afkomstig van dode cellen kan worden geëlimineerd. Tot slot werd de door progesteron geïnduceerde verandering in de intracellulaire calciumconcentratie in individuele zaadcellen gemeten door middel van imaging; deze representatieve pseudokleurbeelden tonen cellen gevisualiseerd aan het begin en na toevoegingen van progesteron, CIN en mangaanchloride. Toevoeging van progesteron veroorzaakt een toename van de intracellulaire calciumconcentratie, zowel in de kop van de zaadcel als in het lumen; mangaanchloride wordt gebruikt om de fluorescentie te verlagen.Hier worden representatieve genormaliseerde fluorescentiesporen van negen individuele cellen uit het experiment getoond voor fluorescentie door quenching om 3:00 uur. Zoals waargenomen in populatie-experimenten, onthulde analyse op enkelcelniveau respectievelijk een transiënte en een aanhoudende toename voor progesteron en ionmycine. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in drie tot vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de levensvatbaarheid van de cellen te verifiëren en de passende controles na deze procedure uit te voeren. Andere methoden, zoals elektrofysiologie, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de identificatie van specifieke ionkanalen die betrokken zijn bij de calciumstijgingen, door gebruik te maken van geschikte oplossingen en simulatieprotocollen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de celphysiologie om calciumedynamiek in levende cellen te bestuderen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de meest geschikte techniek kiest om intracellulaire calciumstijgingen te meten met behulp van fluorescerende kleurstoffen in elk type cel, afhankelijk van de specifieke vraag die u wilt beantwoorden. Vergeet niet dat het werken met menselijke semenmonsters gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van donoren met een bewezen goede gezondheid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moet altijd gebruik worden gemaakt van latex handschoenen en moeten oplossingen en materialen op de juiste wijze worden afgevoerd.

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Technieken voor Imaging Ca 2 + Signalering in Human Sperm

Calcium is betrokken bij tal van fysiologische en pathofysiologische signaalwegen. Live cell imaging vereist gespecialiseerde apparatuur en kan tijdrovend zijn. Een snelle, eenvoudige werkwijze met een flow cytometer om relatieve veranderingen in cytosolische calcium in hechtende epitheelcellen gebracht suspensie bepalen geoptimaliseerd.

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

Hier presenteren we methodologieën voor evaluatie van spermatozoan membraan integriteit, een cellulaire functie sperma bevruchting bevoegdheid is gekoppeld. We beschrijven drie technieken voor de beoordeling van de fluorimetrische van sperma membranen: gelijktijdige kleuring met specifieke fluorescerende sondes, fluorescentie microscopie en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry. Voorbeelden van het combineren van de methoden worden ook gepresenteerd.

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Hier, twee medium-throughput assays voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma worden beschreven. Deze tests kunnen worden gebruikt om te sluiten snel en eenvoudig grote hoeveelheden compounds voor effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma.

Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

Dit protocol beschrijft hoe elektrische opnames van zaadcellen van zoogdieren in een configuratie van de hele cel kunnen worden uitgevoerd, met als doel de activiteit van het ionkanaal direct vast te leggen. De methode heeft een belangrijke rol gespeeld bij het beschrijven van de elektrofysiologische profielen van verschillende sperma-ionkanalen en heeft geholpen om hun moleculaire identiteit en regulatie te onthullen.

Registratie van elektrische stromen over het plasmamembraan van zaadcellen van zoogdieren

Het huidige protocol biedt een praktische oplossing die het mogelijk maakt om apoptose, mitochondriaal membraanpotentiaal en DNA-schade in menselijk sperma te meten met een enkele cytometer.

Flowcytometrische analyse van biomarkers voor het detecteren van functionele defecten van menselijk sperma

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

Bijhouden kleine veranderingen in de progressie en kinetiek van celcyclus stadia worden door gebruik van een combinatie van metabolische labeling van nucleinezuren met BrdU en totaal genomisch DNA kleuring via propidium jodide. Deze methode wordt voorkomen dat van de chemische synchronisatie van fietsen cellen, waarbij de introductie van niet-specifieke DNA-schade die op zijn beurt invloed celcyclus.

Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie

Succesvol gebruik van cell tracking kleurstoffen aan immuun cel functie en proliferatie monitoren omvat verschillende kritische stappen. We beschrijven werkwijzen voor: 1) het verkrijgen helder, uniform en reproduceerbaar label-ing met membraan kleurstoffen, 2) het selecteren fluorochromen en data acquisitie niet, en 3) het kiezen van een model gebaseerd op celproliferatie kleurstof verdunning kwantificeren.

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Leer intracellulaire calciumfluctuaties meten in menselijk sperma met fluorometrie, flowcytometrie en single cell imaging. Deze gevoelige methode volgt spatio-temporele veranderingen tijdens capacitatie en progesteronstimulatie.

Meten Intracellulaire Ca 2 + Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging (Video) | JoVE Journal

Meten Intracellulaire Ca

Meer video's verkennen