Meten Intracellulaire Ca

Het algemene doel van deze procedure is het meten van intracellulaire calciumfluctuaties in menselijke spermacellen met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Dit wordt bereikt door eerst het spermapreparaat voor te bereiden via de swim-up methode en, indien nodig, de capacitatie te bevorderen. De tweede stap is het laden van de spermacellen met een calciumfluorescerende kleurstof.

Voer vervolgens het experiment uit en registreer de calciummetingen met behulp van conventionele fluorometrie, stopped-flow fluorometrie, flowcytometrie of single-cell imaging. Uiteindelijk worden de resultaten geanalyseerd om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentraties te bepalen die worden getriggerd door progesteron of tijdens het capacitatieproces. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die waarbij gebruik wordt gemaakt van radioactiviteit, is dat dit een zeer gevoelige procedure is.

Het is veilig en eenvoudig uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van SPR-calciumsignalering, zoals de identificatie van verbindingen die intracellulaire calciumtoenames induceren met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie, en de identificatie van verschillende cellulaire subpopulaties in een semenmonster. De implicaties van het gebruik van bijvoorbeeld de flowcytometrie-techniek strekken zich uit tot de diagnose van fertiliteitsproblemen door analyse van de fysiologische toestand van mannelijke gameten.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden bij de studie van calciummobilisatie in menselijke zaadcellen, kan deze ook worden toegepast op andere celtypen, zoals mannelijke gameten van andere soorten of verschillende typen cellen zoals neuronen of spiercellen. Over het algemeen zullen personen die deze methode gebruiken voor uitdagingen staan, aangezien het hanteren van zaadcellen niet eenvoudig is en het essentieel is om de juiste condities te handhaven om levensvatbare en motiele cellen gedurende het experiment te verkrijgen. Wij hebben de toepassing van deze technieken geïmplementeerd door strategieën uit verschillende vakgebieden te combineren.

Een visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, aangezien de voorbereiding en hantering van het monster, evenals de toevoeging van de verbindingen, moeilijk aan te leren zijn omdat spermacellen tijdens de procedure kunnen beschadigen en er artefacten in de responsen kunnen optreden tijdens de toevoeging van de verbindingen. Om het spermaproef monster voor te bereiden, moet één milliliter hams F 10 medium zorgvuldig bovenop elke 500 microliter vloeibaar semen worden gelaagd. Raak met de tip van de micropipet de wand van de buis aan en breng het medium voorzichtig boven het monster over.

Het is essentieel om dit langzaam te doen om te voorkomen dat de monster- en mediumlagen zich mengen. Het medium is aangevuld met twee millimol calciumchloride en vijf milligram per milliliter BSA. Om capacitatie in vitro te bevorderen, moeten de buisjes voorzichtig onder een hoek van ongeveer 30 graden worden geplaatst.

Dit zal het oppervlak tussen de twee vloeistoffen vergroten, waardoor de verplaatsing of het wegzwemmen van spermacellen van het monster naar het medium tijdens de incubatie wordt bevorderd. Plaats vervolgens de schuine reageerbuisjes in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂ en 95% lucht gedurende één uur.

Gebruik een micropipet om voorzichtig de bovenste 700 µL van het hams F 10-medium, dat nu motiele spermatozoön bevat, uit elke buis te verwijderen. Voeg alle verzamelde monsters samen in één enkele schone glazen buis en voorkom daarbij belvorming. Breng 10 µL van het samengevoegde monster aan op het optisch vlakke glas van de basis van een Macula-telkamer en plaats het dekglas.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kamer ontstaan, aangezien dit zou leiden tot een onjuiste celtelling. Observeer onder een samengestelde microscoop uitgerust met een 20 x objectief. Het dekglas van de macular telkamer bevat een groot vierkant dat is opgebouwd uit 100 kleinere vierkantjes.

Tel de cellen in een willekeurige strook van 10 vakjes. Dit getal vertegenwoordigt de celconcentratie in miljoenen cellen per milliliter. Herhaal de telling in twee aanvullende stroken van 10 vakjes en bereken het gemiddelde van de drie tellingen om de cellen te laden met een fluorescente kleurstof.

Combineer in een 1,5 milliliter centrifugebuis het benodigde volume spermasuspensie met voldoende één millimolair FluoH-3AM-stoomoplossing om een uiteindelijke concentratie van twee micromolair FluoH-3AM te verkrijgen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en bescherm tegen licht. Centrifugeer de buis bij 750 ×g gedurende vijf minuten. De vorming van een wolk in plaats van een pellet geeft aan dat de cellen in goede conditie zijn; aspireer en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in het juiste volume menselijk spermamedium of HSM. Combineer voor de start van dit experiment in een glazen buis met een platte bodem 570 µL HSM en 30 µL spermacelsuspensie die vooraf is geladen met FluoH-3AM en geresuspendeerd in HSM om een concentratie van 1 × 10⁸ cellen per milliliter te verkrijgen.

Plaats een magnetische roerstaaf in de glazen buis en insert de buis in de meetkamer van de spectrometer die is voorverwarmd tot 37 °C. Het monster moet gedurende de gehele acquisitietijd worden geroerd. Start het experiment met de oli-software en verzamel fluorescentiewaarden met een frequentie van 0,5 hertz gedurende 300 seconden.

Nadat de basale fluorescentie gedurende 30 seconden is vastgelegd, wordt een Hamilton-microspuit gebruikt om het juiste volume van de testverbinding te injecteren, in dit geval voor micromolaire progesteron bij 100 seconden. Gebruik 20 micromolair ionomycine als positieve controle om de maximale fluorescentiewaarde te verkrijgen. In dit experiment worden intracellulaire calciumveranderingen gemeten met een hoge temporele resolutie.

Vul, met gebruik van een SFM 20 stopped-flow mengapparaat gekoppeld aan een rabid kinetics optisch systeem, één van de spuiten van het instrument met één milliliter geladen zaadcellen van flu. 3:00 AM en de tweede spuit met één milliliter van de te testen verbinding: 20 micromolaire progesteron opgelost in HSM.

In dit voorbeeld is het essentieel om belvorming te vermijden bij het opzuigen van de vloeistoffen in de spuiten. Til beide instrumentzuigers op tot ze de tip van de spuitplungers raken. Stel de totale bemonstertijd in dit geval in op 50 seconden en de frequentie op 10 milliseconden om celbeschadiging te minimaliseren; stel de stroomsnelheid in op de minimale waarde die een meetbare responstrigger oplevert.

Na het mengen van de reagentia wordt het verloop van de ruwe fluorescentie ten opzichte van de tijd op het computerscherm weergegeven. Herhaal deze procedure door progesteron te vervangen door HSM als negatieve controle en 10 µM ionomycin als positieve controle voorafgaand aan de flowcytometrie. Bereid de experimentele monsters voor door per cytometerbuis 500 µL cel-suspensie te plaatsen voor elke te testen conditie.

Stel een experiment in met behulp van de software van het apparaat. Maak eerst een nieuwe map, een experimenteel specimen en het aantal buisjes aan. Selecteer vervolgens de juiste cytometerinstellingen voor flu O 3:00 AM. Gebruik de filters voor fluoresceïne-isothiocyanaat en propidiumjodide.

Analyseer de ongekleurde controlebuisjes één en twee in de cytometer. Verzamel gegevens over de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (forward and side scatter) om te verifiëren of de drempelinstellingen correct zijn en om de bijbehorende gate aan te maken om debris van cellen te onderscheiden. Analyseer de experimentele buisjes en verzamel fluorescentiegegevens van 10.000 events per monster.

Aan het einde. Exporteer alle gegevens naar de software die beschikbaar is voor analyse. Bereid de ronde dekglasjes voor die nodig zijn voor deze procedure door een druppel van 5 µL poly-L-lysine-oplossing op het centrum van elk dekglasje aan te brengen.

Laat dit gedurende ten minste één uur staan; spoel vóór gebruik het behandelde gebied af met water. Dit verwijdert overtollig polylysine, waardoor spermacellen met hun kop aan het dekglas kunnen hechten terwijl hun flagellen nog kunnen bewegen. Plaats het dekglas in de opnamekamer.

Plaats 10 µL flu oh 3:00 AM geladen cellen bij een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per mL in het centrum van het dekglas. Bedek de cellen met 200 µL voorverwarmd HSM.

Plaats de kamer op de tafel van de microscoop, vooraf verwarmd tot 37 °C, en bekijk de cellen met fasecontrast. Selecteer een gebied waar de celdichtheid geschikt is voor beeldvorming. Te veel cellen maken de analyse lastig door overlappende signalen.

De cellen moeten met hun kop stevig aan het dekglas vastzitten, maar wel flagelbeweging vertonen, wat de levensvatbaarheid bevestigt. Start het experiment door de software voor tijdserie-beeldacquisitie te activeren. Gewoonlijk zijn vier beelden per seconde vereist met een belichting van twee milliseconden per beeld.

Neem fluorescentiebeelden op in de live-modus. Pas de focus en helderheid aan. Gebruik een micropipet om de testverbinding, in dit geval progesteron, voorzichtig druppelsgewijs toe te voegen en ga verder met de beeldacquisitie zoals vereist.

Voer twee opeenvolgende controletoevoegingen uit in dezelfde kamer. 20 µM ionomycin om maximale fluorescentie te verkrijgen en 5 mM mangaanchloride om minimale fluorescentie te verkrijgen. Voer de beeldanalyse offline uit met behulp van IQ-software.

Teken de regio's van belang (regions of interest of ROI's) rond elke cel of elk deel van een cel. Selecteer daarnaast een celvrij gebied voor automatische achtergrondcorrectie door de software. Vervolgens wordt voor elke ROI een tijdserie van de fluorescentie-intensiteit verkregen; deze gegevens kunnen worden geëxporteerd naar Microsoft Excel voor verdere analyse.

Progesteron is een van de bekende inductoren van de acrosomreactie en veroorzaakt, zoals verwacht, een kortstondige toename van de intracellulaire calciumconcentratie in menselijke sperma, gemeten via conventionele fluorometrie. De rode fluorescentiecurve ten opzichte van de tijd toont de veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie veroorzaakt door de toevoeging van 4 µM progesteron; als negatieve controle werd HSM toegevoegd, wat geen enkele verandering in de intracellulaire calciumconcentraties veroorzaakte, zoals aangegeven door de blauwe fluorescentiecurve. De verandering geïnduceerd door 10 µM ionomycine is voor elke curve weergegeven als positieve controle.

Toevoeging van deze calciumionofoor veroorzaakt de maximale toename van de cellulaire calciumconcentratie in RA, die niet terugkeert naar de basale niveaus. Deze staafgrafiek toont de gemiddelde verandering in fluorescentie delta F voor elke conditie, plus of min de standaardfout waarbij N gelijk is aan drie en het asterisk een P-waarde van minder dan 0,001 aangeeft vergeleken met de controle. De door progesteron geïnduceerde toename van de intracellulaire calciumconcentratie werd gemeten met een hogere temporele resolutie via stopped-flow fluorometrie en representatieve resultaten worden hier getoond.

Ruwe sporen worden getoond in paneel A; zowel progesteron (weergegeven door de rode lijn) als ionomycines (weergegeven door de blauwe lijn) veroorzaakten een snelle toename van de intracellulaire calciumconcentratie. Het groene spoor is de negatieve controle waarin cellen waren gemengd met HSM. Paneel B toont gecorrigeerde sporen voor de signalen die zijn geïnduceerd met progesteron of met ionomycines, verkregen door het controlesignaal af te trekken van de overeenkomstige ruwe signalen.

Progesteron veroorzaakte een zeer snelle en voorbijgaande toename van de intracellulaire calciumconcentratie, met een maximale fluorescentiewaarde 2,7 seconden na toevoeging van de inductor. CIN veroorzaakte daarentegen een snelle en aanhoudende toename van de intracellulaire calciumconcentratie gedurende 50 seconden. Het inzetstuk in paneel B toont een vergroot overzicht van de eerste 500 milliseconden voor elke respons.

Het uitblijven van een vertraging bij de door progesteron geïnduceerde toename van de intracellulaire calciumconcentratie is consistent met eerdere rapporten waarin wordt gesuggereerd dat progesteron het calciumkanaal CatSper direct activeert zonder tussenliggende signalering. De intracellulaire calciumconcentratie werd tevens gemeten in gecapaciteerde en niet-gecapaciteerde menselijke spermacellen met behulp van flowcytometrie. In deze representatieve forward- en side-scatter plots.

Gecapaciteerde cellen zijn blauw en niet-gecapaciteerde cellen zijn rood. De geselecteerde gate wordt aangegeven met de blauwe lijn en alleen de cellen binnen dat gebied werden gebruikt voor verdere analyse. Paneel B toont het fluorescentiehistogram in het Fitzy-kanaal van ongekleurde spermatozoa, en paneel D toont het fluorescentiehistogram in het FZ-kanaal van flu oh 3:00 AM gekleurde spermatozoa zoals waargenomen in Paneel D. De distributie van fluorescentiewaarden voor gecapaciteerde sperma, weergegeven door de blauwe lijn, is verschoven naar hogere waarden vergeleken met niet-gecapaciteerde sperma, weergegeven door de rode lijn.

Paneel C toont het fluorescentiehistogram in het PI-kanaal van ongekleurde cellen en paneel E toont het fluorescentiehistogram in het PI-kanaal van dode cellen. De fluorescentiewaarden voor elke individuele cel kunnen worden waargenomen in de tweedimensionale fluorescentie-dotplots die hier worden getoond. Voor ongekleurde cellen en cellen die dubbel zijn gekleurd met flu oh 3:00 AM en pi, wordt het percentage cellen dat in elk kwadrant is geregistreerd aangegeven door het rode getal.

Belangrijk is dat het signaal afkomstig van dode cellen kan worden geëlimineerd. Tot slot werd de door progesteron geïnduceerde verandering in de intracellulaire calciumconcentratie in individuele zaadcellen gemeten door middel van imaging; deze representatieve pseudokleurbeelden tonen cellen gevisualiseerd aan het begin en na toevoegingen van progesteron, CIN en mangaanchloride. Toevoeging van progesteron veroorzaakt een toename van de intracellulaire calciumconcentratie, zowel in de kop van de zaadcel als in het lumen; mangaanchloride wordt gebruikt om de fluorescentie te verlagen.

Hier worden representatieve genormaliseerde fluorescentiesporen van negen individuele cellen uit het experiment getoond voor fluorescentie door quenching om 3:00 uur. Zoals waargenomen in populatie-experimenten, onthulde analyse op enkelcelniveau respectievelijk een transiënte en een aanhoudende toename voor progesteron en ionmycine. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in drie tot vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de levensvatbaarheid van de cellen te verifiëren en de passende controles na deze procedure uit te voeren. Andere methoden, zoals elektrofysiologie, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de identificatie van specifieke ionkanalen die betrokken zijn bij de calciumstijgingen, door gebruik te maken van geschikte oplossingen en simulatieprotocollen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de celphysiologie om calciumedynamiek in levende cellen te bestuderen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de meest geschikte techniek kiest om intracellulaire calciumstijgingen te meten met behulp van fluorescerende kleurstoffen in elk type cel, afhankelijk van de specifieke vraag die u wilt beantwoorden. Vergeet niet dat het werken met menselijke semenmonsters gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van donoren met een bewezen goede gezondheid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moet altijd gebruik worden gemaakt van latex handschoenen en moeten oplossingen en materialen op de juiste wijze worden afgevoerd.