Name: Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Leer FPALM-microscopie voor nanometerprecisie-beeldvorming van meerdere eiwitten in levende en gefixeerde cellen. Deze techniek overtreft de diffractiegrens van traditionele fluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Philip Andresen, Matthew Parent en Sean Carter bedanken voor computerprogrammering, technische assistentie en nuttige gesprekken en Pat Byard voor administratieve assistentie. Dit werk werd gefinancierd door NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 en 2061, en de Maine Economic Improvement Fund.

Let op: Een diagrammatische weergave van optische componenten die in dit protocol worden vermeld, is te vinden in Figuur 1.
1. Voorbereiding van celmonsters
<ol>
	<li>Plaats cellen met een geoptimaliseerde dichtheid (voor NIH-3T3 cellen, dit is ongeveer 2-5 x 104 cellen/cm2) in putjes van een 8-putjes kamer. Cellen moeten in compleet medium worden geplaatst dat geschikt is voor het celtype, hoewel het medium moet worden gemaakt zonder antibiotica en zonder fenol rood, wat bijdraagt aan achtergrondfluorescentie. Merk op dat de omstandigheden voor celexperimenten, zoals het optimale bereik van passages, kunnen verschillen voor individuele cellijnen.</li>
	<li>Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 (of onder voorwaarden die geschikt zijn voor het celtype) om cellen te laten hechten aan de dekglas. Transfecteer cellen met endotoxine-vrij DNA voor elk van twee eiwitsoorten constructies (in dit geval DNA voor PAmCherry-actine en Dendra2-HA). Bedek het monster met lichtdicht materiaal zoals aluminiumfolie. Transfectie moet putjes met beide DNA-constructies omvatten, en putjes met slechts een van elk van deze constructies.</li>
	<li>Incubeer gedurende 4-6 uur, 37 °C en 5% CO2 (of onder voorwaarden die geschikt zijn voor het celtype), voordat overgeschakeld wordt naar compleet medium (met antibiotica, zonder fenol rood) en verder incuberen gedurende 16-48 uur om cellen toe te laten de gewenste eiwitten te produceren.
	<ol>
		<li>Cellen kunnen worden gefixeerd door drie keer te wassen met fosfaat gebufferd zout (PBS), en vervolgens 15 min bij RT in te kweken met 4% paraformaldehyde (PFA) (VOORZICHTIG: Toxisch) in PBS, en vervolgens nog 3x met PBS te wassen. Afhankelijk van de eiwitten van belang, kan deze fixatie resulteren in een aanzienlijke pool van getagde moleculen die nog steeds mobiel zijn. Om de mobiliteit verder te verminderen, omvatten alternatieve fixatiemethoden het gebruik van gekoeld 100% methanol, of 0.2% gluteraldehyde en 4% PFA in PBS gedurende >30 min bij 25 °C20. Bij beide methoden moeten cellen worden gewassen met PBS zoals hierboven. Merk op dat het gebruik van gluteraldehyde onder sommige beeldvormingsomstandigheden de achtergrondfluorescentie of autofluorescentie kan verhogen, en kan een post-fixatiebehandeling met natriumborohydrie21 noodzakelijk maken.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Het monster kan tot 7 dagen worden bewaard bij 4 °C, ondergedompeld in PBS, verzegeld in een zelfklevende film, voorafgaand aan beeldvorming.</li>
</ol>
2. Microscoopuitlijning
<ol>
	<li>Plaats een kalibratieschaal (reticulum) op de microscooptafel. Gebruik een 10X objectief en de lamp voor doorgelaten licht om het reticulum in het midden van het gezichtsveld (FOV) te centreren.</li>
	<li>Köhler verlichting. Pas de microscoop aan voor Köhler verlichting22. Om te beginnen, sluit de veldopening en focuseer door de oculairen op het reticulum. Als de randen van de veldopening niet scherp staan, pas de hoogte van de condensor aan totdat zowel de veldopening als het reticulum scherp staan.</li>
	<li>Pas de laterale positie van de veldopening aan tot deze gecentreerd is ten opzichte van het FOV. Sluit de veldopening totdat alleen het middelste raster op het reticulum verlicht is.</li>
	<li>Voor een grove uitlijning van de camerapositie (d.w.z. de eerste keer dat de opstelling wordt uitgelijnd), gebruik een hoge lampintensiteit met de camerasluiter GESTRENGD, en plaats geen componenten in doos B (Figuur 1) in het optische pad totdat stap 2.5 is bereikt. Plaats L2 en L3 niet in het detectiepad bij het eerste uitlijnen van de camera. Centreer het reticulumbeeld ongeveer op de camerasluiter door de verticale en horizontale positie van de camera aan te passen (Figuur 2B). Schakel de EM-versterking uit, zet de kamerlichten uit en open de camerasluiter.</li>
	<li>Nadat de lampintensiteit is verlaagd tot een niveau dat de camerasensor niet zal beschadigen, projecteer het licht van het reticulumbeeld direct op de camerasensor (Figuur 2A). Focuseer het reticulum door de microscoop focusknop aan te passen terwijl het beeld in live videomodus binnen de acquisitiesoftware wordt bekeken. Centreer het reticulumbeeld op de camerasensor door de verticale en horizontale positie van de camera aan te passen (Figuur 2B).</li>
	<li>Plaats L2 en L3 in het detectiepad tussen de opening en de camera (Figuur 2C). Lijn L2 en L3 uit, zodat L2 één brandpuntsafstand verwijderd is van het brandpunt van de microscoopuitgangspoort en L3 één brandpuntsafstand verwijderd is van de camerasensor. De afstand tussen L2 en L3 moet idealiter gelijk zijn aan de som van de brandpuntsafstanden van L2 en L3, maar kan enigszins worden aangepast om ruimtebeperkingen te accommoderen. De camera en lenzen moeten op dezelfde hoogte zijn als de uitgangspoort.</li>
	<li>Merk op dat het licht dat van de microscoop wordt uitgezonden, gecentreerd moet zijn op L2 en L3. Pas de afstand tussen L2 en de microscoop aan om ervoor te zorgen dat het reticulumbeeld scherp is op zowel de camera als door de oculairen.</li>
	<li>Indien nodig kunnen kleine translaties (bijv. < 1 mm) van L2 en L3 worden gebruikt om het reticulumbeeld op de camerasensor te centreren.</li>
	<li>Tweekleurige module. Zodra de camerapositie is geoptimaliseerd, bevestig componenten die in doos B (Figuur 1) zijn getoond in het detectiepad. Deze componenten kunnen worden bevestigd aan een verwijderbare montage, zodat de hele module kan worden ingevoegd voor meerkleurige FPALM, of verwijderd voor andere FPALM-toepassingen die het niet vereisen.</li>
	<li>De eerste keer dat deze componenten worden samengesteld, pas de padlengtes van elk kanaal aan om gelijk te zijn. Projecteer he

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H. en M.J.M. hebben patenten op superresolutie microscopie. S.T.H. is lid van de wetenschappelijke adviesraad van Vutara, Inc.

Localisatie-gebaseerde superresolutie beeldvorming biedt veel krachtige mogelijkheden voor biologische beeldvorming. De route van individuele optische componenten die op de tafel worden geplaatst tot een functionele superresolutiemicroscoop die in staat is om meerdere fluorescerende soorten in een biologisch monster tegelijkertijd te beeldvormen, vertoont een aantal uitdagingen. Sommige aspecten van de uitlijning zijn kritischer dan andere; we streven ernaar hieronder begeleiding te bieden aan potentiële gebruikers die t...

Terwijl cellulaire structuren bestaan op een breed scala aan ruimtelijke schalen, is fluorescentie-beeldvorming van cellulaire organisatie op lengte-schalen kleiner dan ~250 nm beperkt in conventionele microscopie vanwege de fysische beperking van de diffractielimiet. Deze limiet werd overwonnen met de komst van fluorescentiefotoactiveringslokalisatiemicroscopie (FPALM1) en vergelijkbare technieken2,3, die grote aantallen individuele moleculen met een nauwkeurigheid van ~10 nm kunnen lokaliseren, om beelden te genereren met een resolutie van een paar tientallen nanometer. FPALM is gebaseerd op het gebruik van optische controle om subsets van moleculen te activeren en te inactiveren (voor een volledige beschrijving van FPALM, en instructies over hoe dit beeldvormingssysteem te implementeren, zie Gould et al.4). Deze techniek maakt het mogelijk om de ruimtelijke verdelingen van hele populaties van enkele moleculen te karteren, waardoor biologische structuren worden opgehelderd op lengteschalen variërend van tientallen nanometer tot tientallen micrometer. Lokalisatie-gebaseerde superresolutiemicroscopie (hierna genoemd lokalisatiemicroscopie) is nu aangepast om een reeks biologische vragen aan te pakken, met technologische ontwikkelingen die bijvoorbeeld het beeldvormen van individuele moleculaire oriëntaties mogelijk maken met polarisatie FPALM, of P-FPALM5, de fluorescentiebeeldvorming van enkele moleculen in drie dimensies met Biplane FPALM6 of andere technieken7-9, en de superresolutie fluorescentiebeeldvorming van enkele moleculen in levende cellen10-12. Lokalisatiemicroscopie is ook toegepast op de beeldvorming van meerdere soorten in vaste cellen13-16. Onlangs zijn drie eiwitsoorten gelijktijdig afgebeeld met FPALM in zowel vaste als levende cellen17. Lokalisatiemicroscopie kan monsters afbeelden die op verschillende manieren zijn gelabeld: voorbeelden zijn eiwitten die tot expressie worden gebracht met PAFP of PSFP-fusietags, antilichamen of moleculen gelabeld met verkapte organische kleurstoffen, of conventionele organische kleurstoffen. Hoewel het gebruik van conventionele fluorescerende kleurstoffen het labelen van eiwitten mogelijk maakt in afwezigheid van een fusie-eiwit-tag, vereisen de voorwaarden die over het algemeen vereist zijn voor het gebruik van niet-verkapte organische kleurstoffen in superresolutiebeeldvorming dat monsters worden ondergedompeld in reducerende buffers2. Bovendien vereist de intracellulaire levering van antilichaam-kleurstofresten doorgaans dat cellen worden gefixeerd en hun membranen worden gepermeabiliseerd, of vereist dat levende cellen permeabel worden gemaakt door middel van elektroporatie of enige andere middelen. De vereisten voor reducerende bufferomstandigheden en membraanpermeabilisatie beperken de geschiktheid van organische kleurstoffen voor levende celbeeldvorming, hoewel recente ontwikkelingen hebben gezorgd voor effectief gebruik van HaloTags en FPALM om membraanstructuren af te beelden18.
FPALM was de eerste lokalisatiemicroscopietechniek die werd toegepast op levende cellen10. In levende cellen, naast het verstrekken van een tijdsafhankelijke ruimtelijke kaart van de locaties van gelabelde moleculen, kan FPALM enkele moleculen over meerdere frames volgen, en moleculaire trajecten bepalen over tijdschalen van milliseconden19. Dus, FPALM biedt toegang tot redelijk korte tijdschalen en nanoschaalresolutie.
Multicolor FPALM kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan verschillende sondes, inclusief fotoactiveerbare eiwitten en organische verkapte of niet-verkapte kleurstoffen. We geven hier details over het protocol en de opstelling voor de gelijktijdige beeldvorming van twee fluorescerende eiwitsoorten, Dendra2 en PAmCherry. We rapporteren de resultaten van de beeldvorming van PAmCherry geconjugeerd aan beta-actine (PAmCherry-actine) en Dendra2 geconjugeerd aan influenza hemagglutinine (Dendra2-HA) in NIH-3T3 fibroblasten. Componenten die in de opstelling worden beschreven, kunnen worden uitgewisseld voor andere hardware die meer geschikt is voor de beeldvorming van andere sondes. Waar dit het geval is, hebben we geprobeerd expliciet te zijn in de tekst.
Multicolor FPALM is ideaal voor het rapporteren van de ruimtelijke verdelingen van meerdere eiwitsoorten in levende of vaste cellen. Deze techniek is vooral geschikt voor het onderzoeken van ruimtelijke en/of dynamische relaties op nanometerlengteschalen, hoewel beelden lokalisatie zullen rapporteren op een reeks lengteschalen, van tientallen nanometer tot tientallen micrometer. Een belangrijk voordeel van multicolor FPALM is dat de opstelling relatief goedkoop is om te bouwen, en zeer flexibel voor gebruik met verschillende sondecombinaties. Het proces van constructie en kalibratie van het systeem uit componenten biedt ook aanzienlijk begrip van factoren die de kwaliteit en interpreteerbaarheid van de gegevens, en dus het onderzoeksresultaat, kunnen aantasten. We beschrijven hier de methoden voor de optische opstelling, monstervoorbereiding en gegevensverwerving van meerdere eiwitsoorten, met PSFP en PAFP-fusieconstructies, met behulp van FPALM. Hoewel dit protocol de analyse van vaste cellen beschrijft, zijn deze procedures gemakkelijk toepasbaar op de beeldvorming van levende cellen.
De hier beschreven optische opstelling is ideaal voor de gelijktijdige beeldvorming van de PSFP Dendra2 en de PAFP PAmCherry. Veel andere sondes kunnen worden gebruikt voor multicolorbeeldvorming; echter, de precieze vereiste componenten kunnen variëren, afhankelijk van de excitatie- en emissiespectra van de gekozen sondes. Keuzes van dichroïsche spiegels, filters en lasergolflengten moeten worden gemaakt op basis van deze overwegingen.

<table><tbody><tr><td>LabTek II-kamers</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Fluorescente kralen</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Kralen voor kalibratie</td></tr><tr><td>Tetraspeck kralen</td><td>Invitrogen</td><td>T- 7279</td><td>Vierkleurige kralen voor kalibratie</td></tr><tr><td>Objectief-immersieolie</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Immersieolie voor objectief met hoge NA (afhankelijk van de keuze van het objectief)</td></tr><tr><td>HPLC-water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Of Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibiotica</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>MPBiomedicals</td><td>1689149</td><td> </td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>VOORSICHT: Giftig</td></tr></tbody></table>

gelijktijdige multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie fotoactivatie lokalisatie microscopie

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localisatie-gebaseerde superresolutiemicroscopie kan worden toegepast om een ruimtelijke kaart (afbeelding) te verkrijgen van de verdeling van individueel fluorescent gelabelde enkele moleculen binnen een monster met een ruimtelijke resolutie van tientallen nanometers. Door gebruik te maken van fotoactiveerbare (PAFP) of fotoswitchbare (PSFP) fluorescente eiwitten gefuseerd met eiwitten van belang, of organische kleurstoffen geconjugeerd aan antilichamen of andere moleculen van belang, kan fluorescentiefotoactiveringslocalisatiemicroscopie (FPALM) tegelijkertijd meerdere soorten moleculen binnen enkele cellen afbeelden. Door de volgende aanpak te gebruiken, worden populaties van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van individuele moleculen in enkele cellen afgebeeld en gelocaliseerd met een precisie van ~10-30 nm. De verkregen gegevens kunnen worden toegepast om de nanoschalige ruimtelijke verdelingen van meerdere eiwitsoorten binnen een cel te begrijpen. Een belangrijk voordeel van deze techniek is de dramatische toename van ruimtelijke resolutie: terwijl diffractie de resolutie beperkt tot ~200-250 nm in conventionele lichtmicroscopie, kan FPALM lengteschalen meer dan een orde van grootte kleiner afbeelden. Aangezien veel biologische hypothesen betrekking hebben op de ruimtelijke relaties tussen verschillende biomoleculen, kan de verbeterde resolutie van FPALM inzicht bieden in vragen over cellulaire organisatie die eerder ontoegankelijk waren voor conventionele fluorescentiemicroscopie. Naast het beschrijven van de methoden voor monstervoorbereiding en data-acquisitie, beschrijven we hier de optische opstelling voor FPALM. Een extra overweging voor onderzoekers die superresolutiemicroscopie willen doen, is de kosten: in-house opstellingen zijn aanzienlijk goedkoper dan de meeste commercieel verkrijgbare beeldvormingsmachines. Beperkingen van deze techniek omvatten de noodzaak om de markering van moleculen van belang binnen celmonsters te optimaliseren, en de behoefte aan post-processing software om resultaten te visualiseren. We beschrijven hier het gebruik van PAFP en PSFP expressie om twee eiwitsoorten in vaste cellen af te beelden. Uitbreiding van de techniek naar levende cellen wordt ook beschreven.

Influenza hemagglutinine (HA) vormt clusters met een grootte van tientallen nanometers tot micrometers, en deze clusters colocaliseren in variabele mate met actine (Figuur 5). Deze ruimtelijke distributies bevestigen imaging op een grovere schaal van deze twee eiwitten28, en de afhankelijkheid van de ruimtelijke distributies van HA van actine19. Multicolor FPALM-beelden kunnen verder worden gebruikt om de dichtheid, het oppervlak en de omtrek van deze clusters te beschrijven, evenal...

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Het algemene doel van deze procedure is om meerdere eiwitsoorten gelijktijdig met nanometerprecisie af te beelden in gefixeerde cellen of levende cellen. Dit wordt bereikt door eerst de positie van een camera en de optica aan te passen totdat een scherp beeld van de microscoop op de camerasensor wordt geprojecteerd. De tweede stap is het richten van de laserstralen zodat deze direct zijn uitgelijnd op een monster op de objecttafel van de microscoop.Vervolgens wordt het voorbereide celmonster belicht en wordt een cel gekozen die de gewenste eiwitten tot expressie brengt. De laatste stap is het afbeelden van de cel met fluorescentie-fotoactivatie-lokalisatiemicroscopie door het monster met lasers te belichten en de celfluorescentie vervolgens naar de camera-chip te leiden om een dataset te verkrijgen. Uiteindelijk wordt fluorescentie-fotoactivatie-lokalisatiemicroscopie gebruikt om de lokalisatie van meerdere eiwitsoorten op nanometer-ruimtelijke schaal aan te tonen in gefixeerde of levende cellen, en dit kan zowel in wide-field als met behulp van totale interne reflectiefluorescentie om een dunne regio van het monster te isoleren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzi

simultaneous-multicolor-imaging-biological-structures-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes BiFC-PALM ― a combination of photoactivated localization microscopy and bimolecular fluorescence complementation ― to assess protein-protein interactions. BiFC involves the fusion of two fluorescent protein fragments with two interacting proteins of interest. When the two proteins interact, the fragments are brought into proximity, which allows the two parts to come together and reconstitute a functional fluorescent protein. The fluorescence of a single fluorophore is...

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Dubbele camera emissie splitsen systemen voor twee-kleuren fluorescentie microscopie genereren real-time beeld sequenties met een uitzonderlijke optische en temporele resolutie, een eis van bepaalde levende cel proeven, waaronder parallelle plaat stroom kamer adhesietesten. Wanneer de software wordt gebruikt om beelden van simultane emissie kanalen samenvoegt, worden pseudocolored beeldsequenties geproduceerd.

Gelijktijdig vastleggen van real-time beelden in Two Emissie Kanalen Met een Dual Camera Emission Splitting Systeem: Toepassingen op Hechting Cell

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

We tonen een methode aan om meerdere molecuelen te identificeren binnen heterogene nano-structuren bij nauwkeurige molecuul nauwkeurigheid, met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescent gelabelde antilichamen.

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Dit protocol bevat een stapsgewijze handleiding voor de Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic (SLAM) microscopische techniek, inclusief details over het genereren van de laserlichtbron, het voorbereiden van een weefselmonster, het uitvoeren van beeldvorming en het analyseren van de gegevens. SLAM bevordert niet-lineaire microscopie door vier complementaire labelvrije contrasten te meten om de micro-omgeving van het weefsel te onderzoeken.

Gelijktijdige labelvrije autofluorescentie multi-harmonische microscopie

Dit protocol biedt een efficiënte workflow voor single-molecule localisatie microscopiebeeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis-kernen, waarbij geoptimaliseerde isolatie, fixatie en labeling wordt gebruikt om betrouwbare nanoschaalvisualisatie van chromatine en RNA Polymerase II te bereiken. Deze benadering kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine-geassocieerde eiwitten of histonmodificaties voor beeldvorming met hoge resolutie.

Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

Leer FPALM-microscopie voor nanometerprecisie-beeldvorming van meerdere eiwitten in levende en gefixeerde cellen. Deze techniek overtreft de diffractiegrens van traditionele fluorescentiemicroscopie.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Meer video's verkennen