Name: Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Leer FPALM-microscopie voor nanometerprecisie-beeldvorming van meerdere eiwitten in levende en gefixeerde cellen. Deze techniek overtreft de diffractiegrens van traditionele fluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Philip Andresen, Matthew Parent en Sean Carter bedanken voor computerprogrammering, technische assistentie en nuttige gesprekken en Pat Byard voor administratieve assistentie. Dit werk werd gefinancierd door NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 en 2061, en de Maine Economic Improvement Fund.

Let op: Een diagrammatische weergave van optische componenten die in dit protocol worden vermeld, is te vinden in Figuur 1.
1. Voorbereiding van celmonsters
<ol>
	<li>Plaats cellen met een geoptimaliseerde dichtheid (voor NIH-3T3 cellen, dit is ongeveer 2-5 x 104 cellen/cm2) in putjes van een 8-putjes kamer. Cellen moeten in compleet medium worden geplaatst dat geschikt is voor het celtype, hoewel het medium moet worden gemaakt zonder antibiotica en zonder fenol rood, wat bijdraagt aan achtergrondfluorescentie. Merk op dat de omstandigheden voor celexperimenten, zoals het optimale bereik van passages, kunnen verschillen voor individuele cellijnen.</li>
	<li>Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 (of onder voorwaarden die geschikt zijn voor het celtype) om cellen te laten hechten aan de dekglas. Transfecteer cellen met endotoxine-vrij DNA voor elk van twee eiwitsoorten constructies (in dit geval DNA voor PAmCherry-actine en Dendra2-HA). Bedek het monster met lichtdicht materiaal zoals aluminiumfolie. Transfectie moet putjes met beide DNA-constructies omvatten, en putjes met slechts een van elk van deze constructies.</li>
	<li>Incubeer gedurende 4-6 uur, 37 °C en 5% CO2 (of onder voorwaarden die geschikt zijn voor het celtype), voordat overgeschakeld wordt naar compleet medium (met antibiotica, zonder fenol rood) en verder incuberen gedurende 16-48 uur om cellen toe te laten de gewenste eiwitten te produceren.
	<ol>
		<li>Cellen kunnen worden gefixeerd door drie keer te wassen met fosfaat gebufferd zout (PBS), en vervolgens 15 min bij RT in te kweken met 4% paraformaldehyde (PFA) (VOORZICHTIG: Toxisch) in PBS, en vervolgens nog 3x met PBS te wassen. Afhankelijk van de eiwitten van belang, kan deze fixatie resulteren in een aanzienlijke pool van getagde moleculen die nog steeds mobiel zijn. Om de mobiliteit verder te verminderen, omvatten alternatieve fixatiemethoden het gebruik van gekoeld 100% methanol, of 0.2% gluteraldehyde en 4% PFA in PBS gedurende >30 min bij 25 °C20. Bij beide methoden moeten cellen worden gewassen met PBS zoals hierboven. Merk op dat het gebruik van gluteraldehyde onder sommige beeldvormingsomstandigheden de achtergrondfluorescentie of autofluorescentie kan verhogen, en kan een post-fixatiebehandeling met natriumborohydrie21 noodzakelijk maken.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Het monster kan tot 7 dagen worden bewaard bij 4 °C, ondergedompeld in PBS, verzegeld in een zelfklevende film, voorafgaand aan beeldvorming.</li>
</ol>
2. Microscoopuitlijning
<ol>
	<li>Plaats een kalibratieschaal (reticulum) op de microscooptafel. Gebruik een 10X objectief en de lamp voor doorgelaten licht om het reticulum in het midden van het gezichtsveld (FOV) te centreren.</li>
	<li>Köhler verlichting. Pas de microscoop aan voor Köhler verlichting22. Om te beginnen, sluit de veldopening en focuseer door de oculairen op het reticulum. Als de randen van de veldopening niet scherp staan, pas de hoogte van de condensor aan totdat zowel de veldopening als het reticulum scherp staan.</li>
	<li>Pas de laterale positie van de veldopening aan tot deze gecentreerd is ten opzichte van het FOV. Sluit de veldopening totdat alleen het middelste raster op het reticulum verlicht is.</li>
	<li>Voor een grove uitlijning van de camerapositie (d.w.z. de eerste keer dat de opstelling wordt uitgelijnd), gebruik een hoge lampintensiteit met de camerasluiter GESTRENGD, en plaats geen componenten in doos B (Figuur 1) in het optische pad totdat stap 2.5 is bereikt. Plaats L2 en L3 niet in het detectiepad bij het eerste uitlijnen van de camera. Centreer het reticulumbeeld ongeveer op de camerasluiter door de verticale en horizontale positie van de camera aan te passen (Figuur 2B). Schakel de EM-versterking uit, zet de kamerlichten uit en open de camerasluiter.</li>
	<li>Nadat de lampintensiteit is verlaagd tot een niveau dat de camerasensor niet zal beschadigen, projecteer het licht van het reticulumbeeld direct op de camerasensor (Figuur 2A). Focuseer het reticulum door de microscoop focusknop aan te passen terwijl het beeld in live videomodus binnen de acquisitiesoftware wordt bekeken. Centreer het reticulumbeeld op de camerasensor door de verticale en horizontale positie van de camera aan te passen (Figuur 2B).</li>
	<li>Plaats L2 en L3 in het detectiepad tussen de opening en de camera (Figuur 2C). Lijn L2 en L3 uit, zodat L2 één brandpuntsafstand verwijderd is van het brandpunt van de microscoopuitgangspoort en L3 één brandpuntsafstand verwijderd is van de camerasensor. De afstand tussen L2 en L3 moet idealiter gelijk zijn aan de som van de brandpuntsafstanden van L2 en L3, maar kan enigszins worden aangepast om ruimtebeperkingen te accommoderen. De camera en lenzen moeten op dezelfde hoogte zijn als de uitgangspoort.</li>
	<li>Merk op dat het licht dat van de microscoop wordt uitgezonden, gecentreerd moet zijn op L2 en L3. Pas de afstand tussen L2 en de microscoop aan om ervoor te zorgen dat het reticulumbeeld scherp is op zowel de camera als door de oculairen.</li>
	<li>Indien nodig kunnen kleine translaties (bijv. < 1 mm) van L2 en L3 worden gebruikt om het reticulumbeeld op de camerasensor te centreren.</li>
	<li>Tweekleurige module. Zodra de camerapositie is geoptimaliseerd, bevestig componenten die in doos B (Figuur 1) zijn getoond in het detectiepad. Deze componenten kunnen worden bevestigd aan een verwijderbare montage, zodat de hele module kan worden ingevoegd voor meerkleurige FPALM, of verwijderd voor andere FPALM-toepassingen die het niet vereisen.</li>
	<li>De eerste keer dat deze componenten worden samengesteld, pas de padlengtes van elk kanaal aan om gelijk te zijn. Projecteer he

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H. en M.J.M. hebben patenten op superresolutie microscopie. S.T.H. is lid van de wetenschappelijke adviesraad van Vutara, Inc.

Localisatie-gebaseerde superresolutie beeldvorming biedt veel krachtige mogelijkheden voor biologische beeldvorming. De route van individuele optische componenten die op de tafel worden geplaatst tot een functionele superresolutiemicroscoop die in staat is om meerdere fluorescerende soorten in een biologisch monster tegelijkertijd te beeldvormen, vertoont een aantal uitdagingen. Sommige aspecten van de uitlijning zijn kritischer dan andere; we streven ernaar hieronder begeleiding te bieden aan potentiële gebruikers die t...

Terwijl cellulaire structuren bestaan op een breed scala aan ruimtelijke schalen, is fluorescentie-beeldvorming van cellulaire organisatie op lengte-schalen kleiner dan ~250 nm beperkt in conventionele microscopie vanwege de fysische beperking van de diffractielimiet. Deze limiet werd overwonnen met de komst van fluorescentiefotoactiveringslokalisatiemicroscopie (FPALM1) en vergelijkbare technieken2,3, die grote aantallen individuele moleculen met een nauwkeurigheid van ~10 nm kunnen lokaliseren, om beelden te genereren met een resolutie van een paar tientallen nanometer. FPALM is gebaseerd op het gebruik van optische controle om subsets van moleculen te activeren en te inactiveren (voor een volledige beschrijving van FPALM, en instructies over hoe dit beeldvormingssysteem te implementeren, zie Gould et al.4). Deze techniek maakt het mogelijk om de ruimtelijke verdelingen van hele populaties van enkele moleculen te karteren, waardoor biologische structuren worden opgehelderd op lengteschalen variërend van tientallen nanometer tot tientallen micrometer. Lokalisatie-gebaseerde superresolutiemicroscopie (hierna genoemd lokalisatiemicroscopie) is nu aangepast om een reeks biologische vragen aan te pakken, met technologische ontwikkelingen die bijvoorbeeld het beeldvormen van individuele moleculaire oriëntaties mogelijk maken met polarisatie FPALM, of P-FPALM5, de fluorescentiebeeldvorming van enkele moleculen in drie dimensies met Biplane FPALM6 of andere technieken7-9, en de superresolutie fluorescentiebeeldvorming van enkele moleculen in levende cellen10-12. Lokalisatiemicroscopie is ook toegepast op de beeldvorming van meerdere soorten in vaste cellen13-16. Onlangs zijn drie eiwitsoorten gelijktijdig afgebeeld met FPALM in zowel vaste als levende cellen17. Lokalisatiemicroscopie kan monsters afbeelden die op verschillende manieren zijn gelabeld: voorbeelden zijn eiwitten die tot expressie worden gebracht met PAFP of PSFP-fusietags, antilichamen of moleculen gelabeld met verkapte organische kleurstoffen, of conventionele organische kleurstoffen. Hoewel het gebruik van conventionele fluorescerende kleurstoffen het labelen van eiwitten mogelijk maakt in afwezigheid van een fusie-eiwit-tag, vereisen de voorwaarden die over het algemeen vereist zijn voor het gebruik van niet-verkapte organische kleurstoffen in superresolutiebeeldvorming dat monsters worden ondergedompeld in reducerende buffers2. Bovendien vereist de intracellulaire levering van antilichaam-kleurstofresten doorgaans dat cellen worden gefixeerd en hun membranen worden gepermeabiliseerd, of vereist dat levende cellen permeabel worden gemaakt door middel van elektroporatie of enige andere middelen. De vereisten voor reducerende bufferomstandigheden en membraanpermeabilisatie beperken de geschiktheid van organische kleurstoffen voor levende celbeeldvorming, hoewel recente ontwikkelingen hebben gezorgd voor effectief gebruik van HaloTags en FPALM om membraanstructuren af te beelden18.
FPALM was de eerste lokalisatiemicroscopietechniek die werd toegepast op levende cellen10. In levende cellen, naast het verstrekken van een tijdsafhankelijke ruimtelijke kaart van de locaties van gelabelde moleculen, kan FPALM enkele moleculen over meerdere frames volgen, en moleculaire trajecten bepalen over tijdschalen van milliseconden19. Dus, FPALM biedt toegang tot redelijk korte tijdschalen en nanoschaalresolutie.
Multicolor FPALM kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan verschillende sondes, inclusief fotoactiveerbare eiwitten en organische verkapte of niet-verkapte kleurstoffen. We geven hier details over het protocol en de opstelling voor de gelijktijdige beeldvorming van twee fluorescerende eiwitsoorten, Dendra2 en PAmCherry. We rapporteren de resultaten van de beeldvorming van PAmCherry geconjugeerd aan beta-actine (PAmCherry-actine) en Dendra2 geconjugeerd aan influenza hemagglutinine (Dendra2-HA) in NIH-3T3 fibroblasten. Componenten die in de opstelling worden beschreven, kunnen worden uitgewisseld voor andere hardware die meer geschikt is voor de beeldvorming van andere sondes. Waar dit het geval is, hebben we geprobeerd expliciet te zijn in de tekst.
Multicolor FPALM is ideaal voor het rapporteren van de ruimtelijke verdelingen van meerdere eiwitsoorten in levende of vaste cellen. Deze techniek is vooral geschikt voor het onderzoeken van ruimtelijke en/of dynamische relaties op nanometerlengteschalen, hoewel beelden lokalisatie zullen rapporteren op een reeks lengteschalen, van tientallen nanometer tot tientallen micrometer. Een belangrijk voordeel van multicolor FPALM is dat de opstelling relatief goedkoop is om te bouwen, en zeer flexibel voor gebruik met verschillende sondecombinaties. Het proces van constructie en kalibratie van het systeem uit componenten biedt ook aanzienlijk begrip van factoren die de kwaliteit en interpreteerbaarheid van de gegevens, en dus het onderzoeksresultaat, kunnen aantasten. We beschrijven hier de methoden voor de optische opstelling, monstervoorbereiding en gegevensverwerving van meerdere eiwitsoorten, met PSFP en PAFP-fusieconstructies, met behulp van FPALM. Hoewel dit protocol de analyse van vaste cellen beschrijft, zijn deze procedures gemakkelijk toepasbaar op de beeldvorming van levende cellen.
De hier beschreven optische opstelling is ideaal voor de gelijktijdige beeldvorming van de PSFP Dendra2 en de PAFP PAmCherry. Veel andere sondes kunnen worden gebruikt voor multicolorbeeldvorming; echter, de precieze vereiste componenten kunnen variëren, afhankelijk van de excitatie- en emissiespectra van de gekozen sondes. Keuzes van dichroïsche spiegels, filters en lasergolflengten moeten worden gemaakt op basis van deze overwegingen.

<table><tbody><tr><td>LabTek II-kamers</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Fluorescente kralen</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Kralen voor kalibratie</td></tr><tr><td>Tetraspeck kralen</td><td>Invitrogen</td><td>T- 7279</td><td>Vierkleurige kralen voor kalibratie</td></tr><tr><td>Objectief-immersieolie</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Immersieolie voor objectief met hoge NA (afhankelijk van de keuze van het objectief)</td></tr><tr><td>HPLC-water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Of Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibiotica</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>MPBiomedicals</td><td>1689149</td><td> </td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>VOORSICHT: Giftig</td></tr></tbody></table>

gelijktijdige multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie fotoactivatie lokalisatie microscopie

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localisatie-gebaseerde superresolutiemicroscopie kan worden toegepast om een ruimtelijke kaart (afbeelding) te verkrijgen van de verdeling van individueel fluorescent gelabelde enkele moleculen binnen een monster met een ruimtelijke resolutie van tientallen nanometers. Door gebruik te maken van fotoactiveerbare (PAFP) of fotoswitchbare (PSFP) fluorescente eiwitten gefuseerd met eiwitten van belang, of organische kleurstoffen geconjugeerd aan antilichamen of andere moleculen van belang, kan fluorescentiefotoactiveringslocalisatiemicroscopie (FPALM) tegelijkertijd meerdere soorten moleculen binnen enkele cellen afbeelden. Door de volgende aanpak te gebruiken, worden populaties van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van individuele moleculen in enkele cellen afgebeeld en gelocaliseerd met een precisie van ~10-30 nm. De verkregen gegevens kunnen worden toegepast om de nanoschalige ruimtelijke verdelingen van meerdere eiwitsoorten binnen een cel te begrijpen. Een belangrijk voordeel van deze techniek is de dramatische toename van ruimtelijke resolutie: terwijl diffractie de resolutie beperkt tot ~200-250 nm in conventionele lichtmicroscopie, kan FPALM lengteschalen meer dan een orde van grootte kleiner afbeelden. Aangezien veel biologische hypothesen betrekking hebben op de ruimtelijke relaties tussen verschillende biomoleculen, kan de verbeterde resolutie van FPALM inzicht bieden in vragen over cellulaire organisatie die eerder ontoegankelijk waren voor conventionele fluorescentiemicroscopie. Naast het beschrijven van de methoden voor monstervoorbereiding en data-acquisitie, beschrijven we hier de optische opstelling voor FPALM. Een extra overweging voor onderzoekers die superresolutiemicroscopie willen doen, is de kosten: in-house opstellingen zijn aanzienlijk goedkoper dan de meeste commercieel verkrijgbare beeldvormingsmachines. Beperkingen van deze techniek omvatten de noodzaak om de markering van moleculen van belang binnen celmonsters te optimaliseren, en de behoefte aan post-processing software om resultaten te visualiseren. We beschrijven hier het gebruik van PAFP en PSFP expressie om twee eiwitsoorten in vaste cellen af te beelden. Uitbreiding van de techniek naar levende cellen wordt ook beschreven.

Influenza hemagglutinine (HA) vormt clusters met een grootte van tientallen nanometers tot micrometers, en deze clusters colocaliseren in variabele mate met actine (Figuur 5). Deze ruimtelijke distributies bevestigen imaging op een grovere schaal van deze twee eiwitten28, en de afhankelijkheid van de ruimtelijke distributies van HA van actine19. Multicolor FPALM-beelden kunnen verder worden gebruikt om de dichtheid, het oppervlak en de omtrek van deze clusters te beschrijven, evenal...

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Het algemene doel van deze procedure is om meerdere eiwitsoorten gelijktijdig met nanometerprecisie af te beelden in gefixeerde cellen of levende cellen. Dit wordt bereikt door eerst de positie van een camera en de optica aan te passen totdat een scherp beeld van de microscoop op de camerasensor wordt geprojecteerd. De tweede stap is het richten van de laserstralen zodat deze direct zijn uitgelijnd op een monster op de objecttafel van de microscoop.Vervolgens wordt het voorbereide celmonster belicht en wordt een cel gekozen die de gewenste eiwitten tot expressie brengt. De laatste stap is het afbeelden van de cel met fluorescentie-fotoactivatie-lokalisatiemicroscopie door het monster met lasers te belichten en de celfluorescentie vervolgens naar de camera-chip te leiden om een dataset te verkrijgen. Uiteindelijk wordt fluorescentie-fotoactivatie-lokalisatiemicroscopie gebruikt om de lokalisatie van meerdere eiwitsoorten op nanometer-ruimtelijke schaal aan te tonen in gefixeerde of levende cellen, en dit kan zowel in wide-field als met behulp van totale interne reflectiefluorescentie om een dunne regio van het monster te isoleren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals confocale of elektronenmicroscopie, is dat men meerdere eiwitten gelijktijdig kan afbeelden met nanometerresolutie in gefixeerde of levende cellen. De volgende stappen verwijzen naar een numereringssysteem zoals hier getoond, wat een schema is voor de multicolor F Om-opstelling, verstrekt als figuur één in het bijbehorende tekstprotocol. Om de microscoop uit te lijnen, begint u met het plaatsen van een kalibratieschaal of radical op de objecttafel van de microscoop, met een 10 x objectief in positie en de lamp ingesteld voor transmissielicht. Centreer de verticale lijn in het midden van het gezichtsveld.Stel vervolgens de microscoop in voor coherente verlichting door de veldapertuur te sluiten en door de oculairs naar het verticale vlak te kijken. Als de randen van de veldapertuur niet scherp zijn, pas dan de hoogte van de condensor aan totdat zowel de veldapertuur als het redle scherp zijn. Stel daarna de laterale positie van de veldapertuur in tot deze gecentreerd is ten opzichte van het gezichtsveld en sluit de veldapertuur totdat alleen het centrale rooster op het redle wordt verlicht.Pas bij de eerste montage van deze componenten de padlengtes van elk kanaal aan zodat deze gelijk zijn. Om dit project te realiseren, worden de spiegels zeven en negen op de camera-chip aangepast en wordt de detectieopening gesloten om ruimtelijke overlap tussen de twee kanalen te voorkomen. Stel vervolgens het beeld van het radicaal scherp in het gereflecteerde lichtkanaal en controleer of dit ook scherp is in het doorgelaten lichtkanaal.Als het beeld in het doorgeletkanaal niet scherp is, verschuif spiegel negen totdat het radicale beeld in beide kanalen gelijktijdig scherp is. Begin met het uitlijnen van de lasers door lens één uit het laserpad te verwijderen en de activatie- en uitleesstralen te blokkeren. Plaats vervolgens een wit kaartje strak tegen spiegel vier, open de microscoopsluiter en focus tot het radicale beeld op het kaartje voor spiegel vier wordt geprojecteerd.Ontblok vervolgens de uitleesstraal en stel spiegel één zo in dat de uitleeslaser gecentreerd wordt op het kruis van het radicaalbeeld op spiegel vier. Zodra dit gecentreerd is, projecteert u het radicaalbeeld op spiegel vijf en stelt u spiegel vier af totdat de straal gecentreerd is op het beeldkruis van spiegel vijf. De uitleesstraal moet nu gecentreerd zijn bij zowel M vier als M vijf.Blokkeer vervolgens de uitleesstraal door sluiter één te sluiten. Projecteer daarna het radicaalbeeld op spiegel drie. Verwijder de straaluitbreider uit het laserpad en maak de activatielaser vrij.Stel spiegel twee nu zo af dat de activatiebundel wordt gecentreerd op het kruis van het radicaalbeeld op spiegel drie. Zodra dit gecentreerd is, plaatst u de bundelexpander weer tussen spiegel twee en drie en past u de positie van de bundelexpander aan totdat de bundel gecentreerd is op het kruis van het radicaalbeeld. Projecteer op spiegel drie het radicaalbeeld op spiegel vijf en stel scherp.Stel met de focusknop van de microscoop de hoek van dichroïsche spiegel nummer één zo in dat de activatiestraal gecentreerd is op het rode beeld. Blokkeer vervolgens de activatielaser door sluiter twee te sluiten, terwijl er geen objectief is geplaatst en de microscoopsluiter openstaat. Open de uitleessluiter sluiter één en projecteer de laser door de achteropening van de microscoop.Stel spiegel vijf af totdat de bundel uit de microscoop komt, zodat de bundel verticaal uit de microscoop treedt met lens één en het objectief weer op hun plaats. Plaats een monster dat 100 micromolair broom B bevat op de tafel terwijl de activatielaser is geblokkeerd. Projecteer de uitleeslaser door een 60 x objectief in de kleurstof.Schakel de elektronenvermenigwordingsversterking uit. Verstuur dit beeld naar de camera. Focus vervolgens het objectief op het monster.Open de diafragma opening breed genoeg om beeldvorming van het volledige straalprofiel mogelijk te maken. Verschuif het diafragma vervolgens zijdelings zodat het centrum van het straalprofiel en het diafragma concentrisch zijn. Selecteer met de camerasoftware het interessegebied (region of interest) zodat het kleinste camera-uitleesgebied dat beide kanalen omvat wordt gebruikt, en noteer deze coördinaten.Maak op dit punt een enkele momentopname om het profiel van de uitleesstraal vast te leggen. Blok vervolgens de uitleeslaser door sluiter één te sluiten en open sluiter twee. Om het profiel van de activeringsstraal te gaan meten, projecteert u de activeringslaser op het monster; gebruik indien nodig een elektronenvermenigwindingsversterking van minder dan 100 en stel de eerste dichroïsche spiegel af totdat de straal in elk gezichtsveld is gecentreerd.Neem vervolgens een momentopname van het activatiebundelprofiel om te beginnen met het verkrijgen van multicolor F palm-beelden. Schakel alle kamerverlichting uit. Projecteer daarna het kwiklamplicht via de flip-mount op de getransfecteerde cellen en vervang de filterkubus door een kubus met de juiste excitatiegolflengte van de pre-fotoschakelstatus.Zodra er een cel is gekozen, beweegt u de flip-mount naar beneden zodat de lasers de microscoop kunnen binnendringen en wijzigt u de filterturret naar die met de juiste dichroïsche spiegel voor beeldvorming, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Projecteer dit beeld vervolgens op de camera om getransfecteerde cellen te onderscheiden van achtergrondfluorescentie en om te bevestigen dat de moleculen fotobehandelbaar zijn. Belicht het monster kort met een laag vermogen van minder dan 10 µW vanuit de activatielaser.Bereid vervolgens de camerasoftware voor op de acquisitie van kinetische series door de electron multiplying gain in te stellen op 200 en het gewenste aantal frames tussen de vijf en 10.000 te stellen. Stel daarnaast de belichting in op een waarde tussen 10 en 30 milliseconden. Blokkeer vervolgens de activatiebundel, ontblokkeer de uitleesbundel en projecteer het beeld van de verlichte cel op de camera.Kies een brandvlak nabij het onderste celmembraan door de focus naar beneden te verschuiven totdat de individuele moleculen niet langer zichtbaar zijn. Verplaats de focus vervolgens geleidelijk omhoog totdat de moleculen voor het eerst zichtbaar worden. Ontblok nu de activatiestraal en belicht het monster met een intensiteit van minder dan één watt per vierkante centimeter.Begin met het verzamelen van deze gegevens via de camerasoftware, terwijl een dichtheid van 0,1 tot één zichtbaar fotoactiveerbaar molecuul per vierkante micron wordt gehandhaafd door het neutrale dichtheidsfilter voor de activatielaser dynamisch aan te passen. Monteer voor total internal reflection fluorescentie-imaging spiegel vijf en lens één op één enkele translatieplateau die zijdelings vlak achter de ingang van de microscoop kan worden bewogen. Naarmate spiegel vijf en lens één worden verplaatst, zullen de lasers die via het objectief omhoog door het monster treden geleidelijk naar één kant kantelen; blijf het plateau verplaatsen totdat de hoek van de lasers 90 graden ten opzichte van de verticale as bereikt.Op dit punt zal de uitgaande laser zelf verdwijnen en zal de inkomende laser via de opening worden teruggekaatst, waarbij deze antiparallel aan de inkomende straal beweegt en zijdelings is verschoven. U zou een afname van de achtergrond moeten zien wanneer het monster overgaat in totale interne reflectie-fluorescentie. Nadat de beeldacquisities zijn voltooid, sluit u onmiddellijk het sluiter van de microscoop en blokkeert u beide stralen. Schakel de elektronenvermenigwindingsversterking uit.Stel de camera in om één frame op te nemen en stel het uitleesgebied van de camera in op de maximale grootte. Blokkeer tot slot één kanaal door een kaartje over F drie of F vier te plaatsen, met een longpassfilter op de microscooplamp gemonteerd. Belicht het monster en projecteer dit beeld op de camera.Leg een snapshot van de cel vast om de gehele cel in doorgelaten licht weer te geven. Hier wordt een voorbeeld getoond van een tweekleurige F palm acquisitie van een NIH 3T3-cel die zowel DENDRA 2 Hemagglutinine als PAM Cherry actine tot expressie brengt. Het doorgelaten kanaal links bevat langere golflengten dan het gereflecteerde kanaal rechts.Hier worden snapshots getoond van dezelfde tweekleurige F OM-acquisitie na achtergrondsubtractie en transformatie om de linker- en rechterkanalen over elkaar heen te leggen. Individuele moleculen kunnen worden geïdentificeerd en gelokaliseerd. Sommige moleculen lijken helderder in het transmissiekanaal en sommige hebben een gelijkmatigere verdeling van de emissie tussen de twee kanalen.Dit geeft het verschil in emissiespectra tussen PAM cherry en DENDRA two respectievelijk aan en wordt in analyses gebruikt om deze twee soorten te identificeren. Het hier getoonde histogram geeft een verhouding aan van de intensiteit van het rood doorlatende kanaal gedeeld door de totale intensiteit voor alle gelokaliseerde moleculen nadat de toleranties waren toegepast. De pixels verschijnen wit in de linkeronderafbeelding en verschijnen rood in de uiteindelijke samengevoegde afbeelding rechtsonder, terwijl die in het groene gebied als wit worden weergegeven in de rechterbovenafbeelding en groen verschijnen in de uiteindelijke samengevoegde afbeelding rechtsonder.De gekozen drempelwaarden bij het renderen hebben een grote invloed op de mate van ruis en het uiterlijk van de colocalisatie. Hier worden drie verschillende renderopties getoond die leiden tot variërende gradaties van bleed-through; de meest conservatieve drempelwaarden zijn onderaan weergegeven. Histogrammen van Color F palm alpha zijn het best te interpreteren wanneer er twee duidelijk herkenbare pieken in de afbeelding aanwezig zijn.Hoewel het histogram aan de linkerkant een goede kandidaat is voor verdere analyse, zullen de afbeeldingen die voortkomen uit de andere twee histogrammen veel moeilijker te interpreteren zijn na het volgen van deze procedure. Methoden zoals totale interne reflectie-microscopie en live cell imaging kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop eiwitten op nanoschaal zijn georganiseerd in levende celmembranen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw eigen FAR-microscoop opstelt en gebruikt om gegevens te verzamelen.Vergeet niet dat werken met lasers extreem gevaarlijk kan zijn, en dat een veiligheidstraining moet zijn voltooid voordat u deze procedure uitvoert.

simultaneous-multicolor-imaging-biological-structures-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes BiFC-PALM ― a combination of photoactivated localization microscopy and bimolecular fluorescence complementation ― to assess protein-protein interactions. BiFC involves the fusion of two fluorescent protein fragments with two interacting proteins of interest. When the two proteins interact, the fragments are brought into proximity, which allows the two parts to come together and reconstitute a functional fluorescent protein. The fluorescence of a single fluorophore is...

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Dubbele camera emissie splitsen systemen voor twee-kleuren fluorescentie microscopie genereren real-time beeld sequenties met een uitzonderlijke optische en temporele resolutie, een eis van bepaalde levende cel proeven, waaronder parallelle plaat stroom kamer adhesietesten. Wanneer de software wordt gebruikt om beelden van simultane emissie kanalen samenvoegt, worden pseudocolored beeldsequenties geproduceerd.

Gelijktijdig vastleggen van real-time beelden in Two Emissie Kanalen Met een Dual Camera Emission Splitting Systeem: Toepassingen op Hechting Cell

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

We tonen een methode aan om meerdere molecuelen te identificeren binnen heterogene nano-structuren bij nauwkeurige molecuul nauwkeurigheid, met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescent gelabelde antilichamen.

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Dit protocol bevat een stapsgewijze handleiding voor de Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic (SLAM) microscopische techniek, inclusief details over het genereren van de laserlichtbron, het voorbereiden van een weefselmonster, het uitvoeren van beeldvorming en het analyseren van de gegevens. SLAM bevordert niet-lineaire microscopie door vier complementaire labelvrije contrasten te meten om de micro-omgeving van het weefsel te onderzoeken.

Gelijktijdige labelvrije autofluorescentie multi-harmonische microscopie

Dit protocol biedt een efficiënte workflow voor single-molecule localisatie microscopiebeeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis-kernen, waarbij geoptimaliseerde isolatie, fixatie en labeling wordt gebruikt om betrouwbare nanoschaalvisualisatie van chromatine en RNA Polymerase II te bereiken. Deze benadering kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine-geassocieerde eiwitten of histonmodificaties voor beeldvorming met hoge resolutie.

Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

Leer FPALM-microscopie voor nanometerprecisie-beeldvorming van meerdere eiwitten in levende en gefixeerde cellen. Deze techniek overtreft de diffractiegrens van traditionele fluorescentiemicroscopie.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Meer video's verkennen