Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie
December 9th, 2013
We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om meerdere eiwitsoorten gelijktijdig met nanometer nauwkeurigheid in vaste of levende cellen te beeldvormen. Dit wordt bereikt door eerst de positie van een camera en optica aan te passen tot een scherp beeld van de microscoop wordt geprojecteerd op de camerachip. De tweede stap is om laserbundels zo te rangschikken dat ze direct op een monster op de microscooptafel zijn uitgelijnd.
Vervolgens wordt het voorbereide celmonster verlicht en wordt een cel gekozen die de gewenste eiwitten tot expressie brengt. De laatste stap is om de cel te beeldvormen met fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie door het monster met lasers te verlichten en vervolgens de celfluorescentie naar de camerachip te leiden om een dataset te verkrijgen. Uiteindelijk wordt fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie gebruikt om de lokalisatie van meerdere eiwitsoorten op de nanometerschaal in vaste of levende cellen te tonen en in het brede veld of wanneer totale interne reflectiefluorescentie wordt gebruikt om een dunne regio van het monster te isoleren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals confocale of elektronenmicroscopie, is dat men meerdere eiwitten gelijktijdig met nanometer resolutie in vaste of levende cellen kan beeldvormen. De volgende stappen verwijzen naar een nummeringssysteem zoals hier getoond, dat een schema is voor de meerkleurige F Om opstelling die als figuur een in het bijbehorende tekstprotocol wordt verstrekt om de microscoop uit te lijnen. Begin door een kalibratieschaal of radicaal op de microscooptafel te plaatsen met een 10 x objectief op zijn plaats en de lamp ingesteld voor doorgelaten licht. Centreer de verticale in het midden van het gezichtsveld.
Vervolgens past u de microscoop aan voor coer-verlichting door de veldopening te sluiten en door de oculaires naar de verticale te kijken. Als de randen van de veldopening onscherp zijn, pas dan de hoogte van de condensor aan totdat zowel de veldopening als de redle scherp staan. Pas vervolgens de laterale positie van de veldopening aan totdat deze gecentreerd is met betrekking tot het gezichtsveld en sluit de veldopening totdat alleen het middelste raster op de redle wordt verlicht.
De eerste keer dat deze componenten worden geassembleerd, pas dan de padlengtes van elk kanaal aan om gelijk te zijn. Om dit project te voltooien, pas dan de redle op de camerachip aan met spiegels zeven en negen en sluit de detectieopening om ruimtelijke overlap tussen de twee kanalen te voorkomen. Focus vervolgens op het beeld van de radicaal in het kanaal met gereflecteerd licht en controleer of het ook in focus is in het kanaal met doorgelaten licht.
Als het beeld in het kanaal met doorgelaten licht niet scherp is, verplaats dan spiegel negen totdat het radicaalbeeld gelijktijdig in beide kanalen scherp is. Begin met het uitlijnen van de lasers door lens één uit het laserpad te verwijderen en de activerings- en uitleesbundels te blokkeren. Plaats vervolgens een witte kaart vlak tegen spiegel vier, open de microscoopluik en focus tot het radicaalbeeld op de kaart voor spiegel vier wordt geprojecteerd.
Vervolgens deblokkeert u de uitleesbundel en past u spiegel één aan om de uitleeslaser te centreren op de kruislijnen van het radicaalbeeld op spiegel vier. Eenmaal gecentreerd, projecteert u het radicaalbeeld op spiegel vijf en past u spiegel vier aan totdat de bundel is gecentreerd op de kruislijnen van spiegel vijf. De uitleesbundel moet nu op zowel M vier als M vijf zijn gecentreerd.
Blokkeer vervolgens de uitleesbundel door sluiter één te sluiten. Projecteer vervolgens het radicaalbeeld op spiegel drie. Verwijder de bundelvergroter uit het laserpad en deblokkeer de activeringslaser.
Pas vervolgens spiegel twee aan om de activeringsbundel te centreren op de kruislijnen van het radicaalbeeld op spiegel drie. Eenmaal gecentreerd, plaatst u de bundelvergroter tussen spiegels twee en drie en past u de positie van de bundelvergroter aan totdat de bundel is gecentreerd op de kruislijnen van het radicaalbeeld. Projecteer het radicaalbeeld op spiegel vijf en focus op spiegel drie.
Gebruik de focusknop van de microscoop om de hoek van de dichroische spiegel nummer één aan te passen totdat de activeringsbundel is gecentreerd op het redle-beeld. Blokkeer vervolgens de activeringslaser door sluiter twee te sluiten zonder objectief op zijn plaats en met de microscoopluik open. Open de uitleesluik sluiter één en projecteer de laser door de achterste opening van de microscoop.
Pas vervolgens spiegel vijf aan totdat de bundel uit de microscoop komt, zodat de bundel het microscoop verticaal verlaat met lens één en het objectief weer op zijn plaats. Plaats een monster met 100 micromolair broom B op de tafel met de geblokkeerde activeringslaser. Projecteer de uitleeslaser door een 60 x objectief en in de kleurstof.
Met het uitschakelen van de elektronen vermenigvuldigende versterking. Stuur dit beeld naar de camera. Focus vervolgens de objectief in het monster.
Open de opening wijd genoeg om beeldvorming van het volledige bundelprofiel mogelijk te maken. Verplaats vervolgens de opening lateraal zodat het centrum van het bundelprofiel en de opening concentrisch zijn. Kies met de camerasoftware het gebied van belang om het kleinste camera-uitleesgebied te selecteren dat beide kanalen omvat en noteer deze coördinaten.
Op dit punt neemt u een enkele momentopname op om het uitleesbundelprofiel te vertegenwoordigen. Blokkeer vervolgens de uitleeslaser door sluiter één te sluiten en open sluiter twee. Om te beginnen met het meten van het activeringsbundelprofiel projecteert u de activeringslaser naar het monster, gebruik indien nodig een elektronen vermenigvuldigende versterking van minder dan 100 en pas de eerste dichroische spiegel aan totdat de bundel in elk gezichtsveld is gecentreerd.
Neem vervolgens een momentopname van het activeringsbundelprofiel op om te beginnen met het verwerven van meerkleurige F palm afbeeldingen. Elimineer alle kamerverlichting. Projecteer vervolgens de kwiklamp via de flip mount op getransfecteerde cellen en verander de filterkubus naar een die de juiste excitatiegolflengte van de pre-fotoschakelaar bevat.Staat.
Eenmaal een cel is gekozen, beweegt u de
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie demonstreert het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om meerdere eiwitsoorten binnen cellen af te beelden met nanometer precisie. De techniek maakt het mogelijk om duizenden fluorescent gelabelde eiwitten te lokaliseren in zowel gefixeerde als levende cellen.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Beeldtechnieken
Achtergrond
- Fluorescentie microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van cellulaire componenten.
- FPALM verbetert de resolutie voorbij de diffractielimiet van lichtmicroscopie.
- Deze methode maakt de studie van eiwitinteracties en -verdelingen op moleculair niveau mogelijk.
- Het kan worden toegepast op zowel gefixeerde als levende cel beeldvorming.
Doel van het Onderzoek
- Om gelijktijdige beeldvorming van meerdere eiwitsoorten te bereiken.
- Om hoge ruimtelijke resolutie in cellulaire beeldvorming te bieden.
- Om de studie van eiwit lokalisatie dynamiek in levende cellen te faciliteren.
Gebruikte Methoden
- Aanpassen van camera en optiek voor scherp beeld.
- Uitlijnen van laserstralen op het monster op het microscoopplatform.
- Verlichten van het celmonster dat de gewenste eiwitten tot expressie brengt.
- Verzamelen van datasets door middel van FPALM door fluorescentie naar het camerachip te richten.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle lokalisatie van meerdere eiwitsoorten op nanometerschaal.
- Gedemonstreerde capaciteit in zowel gefixeerde als levende cellen.
- Gebruik van brede veld- en totale interne reflectiefluorescentietechnieken.
- Opbrengst van hoge precisie in beeldvorming van duizenden individuele eiwitten.
Conclusies
- FPALM is een effectieve methode voor het bestuderen van eiwit lokalisatie.
- De techniek kan worden aangepast voor verschillende cellulaire contexten.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar cellulaire dynamiek en interacties.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Simultaneous multicolor FPALM enables nanometer-scale mapping of multiple protein species within single cells, directly addressing the challenge of resolving spatial relationships among biomolecules beyond the diffraction limit. This capability enhances predictive confidence in early discovery by revealing nanoscale organization critical for target validation and mechanistic de-risking. The method's compatibility with both fixed and living cells supports translational continuity and portfolio triage across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein colocalization and nanoscale spatial relationships for hypothesis interrogation.
- Supports functional target validation by mapping protein distributions with ~10–30 nm precision.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing true molecular interactions from proximity artifacts.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening by confirming molecular localization.
- Delivers quantitative, reproducible spatial data for assay standardization and benchmarking.
- Enables multiplexed imaging, supporting scalable evaluation of compound effects on multiple targets.
- Provides high-content readouts for reliable compound triage and prioritization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nanoscale imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling live-cell and fixed-cell analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement by clarifying molecular organization in relevant systems.
- Enhances mechanistic understanding for risk-adjusted decision-making.
Pipeline & Workflow Integration
FPALM integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, providing a reusable imaging capability for both fixed and live cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping protein distributions at nanometer resolution.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spatial outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical measurements of molecular localization and colocalization for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment of imaging outputs with disease-relevant models for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective imaging platform adaptable across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes high-resolution imaging workflows with reproducible, quantitative outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying molecular organization early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and laser safety.
- Demands precise optical alignment and calibration for multicolor imaging.
- Needs robust post-processing software for localization and colocalization analysis.
- Involves optimization of labeling strategies for target proteins in relevant cell models.
- Cost-effective in-house setups are feasible but require technical infrastructure and training.
