Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om meerdere eiwitsoorten gelijktijdig met nanometerprecisie af te beelden in gefixeerde cellen of levende cellen. Dit wordt bereikt door eerst de positie van een camera en de optica aan te passen totdat een scherp beeld van de microscoop op de camerasensor wordt geprojecteerd. De tweede stap is het richten van de laserstralen zodat deze direct zijn uitgelijnd op een monster op de objecttafel van de microscoop.

Vervolgens wordt het voorbereide celmonster belicht en wordt een cel gekozen die de gewenste eiwitten tot expressie brengt. De laatste stap is het afbeelden van de cel met fluorescentie-fotoactivatie-lokalisatiemicroscopie door het monster met lasers te belichten en de celfluorescentie vervolgens naar de camera-chip te leiden om een dataset te verkrijgen. Uiteindelijk wordt fluorescentie-fotoactivatie-lokalisatiemicroscopie gebruikt om de lokalisatie van meerdere eiwitsoorten op nanometer-ruimtelijke schaal aan te tonen in gefixeerde of levende cellen, en dit kan zowel in wide-field als met behulp van totale interne reflectiefluorescentie om een dunne regio van het monster te isoleren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals confocale of elektronenmicroscopie, is dat men meerdere eiwitten gelijktijdig kan afbeelden met nanometerresolutie in gefixeerde of levende cellen. De volgende stappen verwijzen naar een numereringssysteem zoals hier getoond, wat een schema is voor de multicolor F Om-opstelling, verstrekt als figuur één in het bijbehorende tekstprotocol. Om de microscoop uit te lijnen, begint u met het plaatsen van een kalibratieschaal of radical op de objecttafel van de microscoop, met een 10 x objectief in positie en de lamp ingesteld voor transmissielicht. Centreer de verticale lijn in het midden van het gezichtsveld.

Stel vervolgens de microscoop in voor coherente verlichting door de veldapertuur te sluiten en door de oculairs naar het verticale vlak te kijken. Als de randen van de veldapertuur niet scherp zijn, pas dan de hoogte van de condensor aan totdat zowel de veldapertuur als het redle scherp zijn. Stel daarna de laterale positie van de veldapertuur in tot deze gecentreerd is ten opzichte van het gezichtsveld en sluit de veldapertuur totdat alleen het centrale rooster op het redle wordt verlicht.

Pas bij de eerste montage van deze componenten de padlengtes van elk kanaal aan zodat deze gelijk zijn. Om dit project te realiseren, worden de spiegels zeven en negen op de camera-chip aangepast en wordt de detectieopening gesloten om ruimtelijke overlap tussen de twee kanalen te voorkomen. Stel vervolgens het beeld van het radicaal scherp in het gereflecteerde lichtkanaal en controleer of dit ook scherp is in het doorgelaten lichtkanaal.

Als het beeld in het doorgeletkanaal niet scherp is, verschuif spiegel negen totdat het radicale beeld in beide kanalen gelijktijdig scherp is. Begin met het uitlijnen van de lasers door lens één uit het laserpad te verwijderen en de activatie- en uitleesstralen te blokkeren. Plaats vervolgens een wit kaartje strak tegen spiegel vier, open de microscoopsluiter en focus tot het radicale beeld op het kaartje voor spiegel vier wordt geprojecteerd.

Ontblok vervolgens de uitleesstraal en stel spiegel één zo in dat de uitleeslaser gecentreerd wordt op het kruis van het radicaalbeeld op spiegel vier. Zodra dit gecentreerd is, projecteert u het radicaalbeeld op spiegel vijf en stelt u spiegel vier af totdat de straal gecentreerd is op het beeldkruis van spiegel vijf. De uitleesstraal moet nu gecentreerd zijn bij zowel M vier als M vijf.

Blokkeer vervolgens de uitleesstraal door sluiter één te sluiten. Projecteer daarna het radicaalbeeld op spiegel drie. Verwijder de straaluitbreider uit het laserpad en maak de activatielaser vrij.

Stel spiegel twee nu zo af dat de activatiebundel wordt gecentreerd op het kruis van het radicaalbeeld op spiegel drie. Zodra dit gecentreerd is, plaatst u de bundelexpander weer tussen spiegel twee en drie en past u de positie van de bundelexpander aan totdat de bundel gecentreerd is op het kruis van het radicaalbeeld. Projecteer op spiegel drie het radicaalbeeld op spiegel vijf en stel scherp.

Stel met de focusknop van de microscoop de hoek van dichroïsche spiegel nummer één zo in dat de activatiestraal gecentreerd is op het rode beeld. Blokkeer vervolgens de activatielaser door sluiter twee te sluiten, terwijl er geen objectief is geplaatst en de microscoopsluiter openstaat. Open de uitleessluiter sluiter één en projecteer de laser door de achteropening van de microscoop.

Stel spiegel vijf af totdat de bundel uit de microscoop komt, zodat de bundel verticaal uit de microscoop treedt met lens één en het objectief weer op hun plaats. Plaats een monster dat 100 micromolair broom B bevat op de tafel terwijl de activatielaser is geblokkeerd. Projecteer de uitleeslaser door een 60 x objectief in de kleurstof.

Schakel de elektronenvermenigwordingsversterking uit. Verstuur dit beeld naar de camera. Focus vervolgens het objectief op het monster.

Open de diafragma opening breed genoeg om beeldvorming van het volledige straalprofiel mogelijk te maken. Verschuif het diafragma vervolgens zijdelings zodat het centrum van het straalprofiel en het diafragma concentrisch zijn. Selecteer met de camerasoftware het interessegebied (region of interest) zodat het kleinste camera-uitleesgebied dat beide kanalen omvat wordt gebruikt, en noteer deze coördinaten.

Maak op dit punt een enkele momentopname om het profiel van de uitleesstraal vast te leggen. Blok vervolgens de uitleeslaser door sluiter één te sluiten en open sluiter twee. Om het profiel van de activeringsstraal te gaan meten, projecteert u de activeringslaser op het monster; gebruik indien nodig een elektronenvermenigwindingsversterking van minder dan 100 en stel de eerste dichroïsche spiegel af totdat de straal in elk gezichtsveld is gecentreerd.

Neem vervolgens een momentopname van het activatiebundelprofiel om te beginnen met het verkrijgen van multicolor F palm-beelden. Schakel alle kamerverlichting uit. Projecteer daarna het kwiklamplicht via de flip-mount op de getransfecteerde cellen en vervang de filterkubus door een kubus met de juiste excitatiegolflengte van de pre-fotoschakelstatus.

Zodra er een cel is gekozen, beweegt u de flip-mount naar beneden zodat de lasers de microscoop kunnen binnendringen en wijzigt u de filterturret naar die met de juiste dichroïsche spiegel voor beeldvorming, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Projecteer dit beeld vervolgens op de camera om getransfecteerde cellen te onderscheiden van achtergrondfluorescentie en om te bevestigen dat de moleculen fotobehandelbaar zijn. Belicht het monster kort met een laag vermogen van minder dan 10 µW vanuit de activatielaser.

Bereid vervolgens de camerasoftware voor op de acquisitie van kinetische series door de electron multiplying gain in te stellen op 200 en het gewenste aantal frames tussen de vijf en 10.000 te stellen. Stel daarnaast de belichting in op een waarde tussen 10 en 30 milliseconden. Blokkeer vervolgens de activatiebundel, ontblokkeer de uitleesbundel en projecteer het beeld van de verlichte cel op de camera.

Kies een brandvlak nabij het onderste celmembraan door de focus naar beneden te verschuiven totdat de individuele moleculen niet langer zichtbaar zijn. Verplaats de focus vervolgens geleidelijk omhoog totdat de moleculen voor het eerst zichtbaar worden. Ontblok nu de activatiestraal en belicht het monster met een intensiteit van minder dan één watt per vierkante centimeter.

Begin met het verzamelen van deze gegevens via de camerasoftware, terwijl een dichtheid van 0,1 tot één zichtbaar fotoactiveerbaar molecuul per vierkante micron wordt gehandhaafd door het neutrale dichtheidsfilter voor de activatielaser dynamisch aan te passen. Monteer voor total internal reflection fluorescentie-imaging spiegel vijf en lens één op één enkele translatieplateau die zijdelings vlak achter de ingang van de microscoop kan worden bewogen. Naarmate spiegel vijf en lens één worden verplaatst, zullen de lasers die via het objectief omhoog door het monster treden geleidelijk naar één kant kantelen; blijf het plateau verplaatsen totdat de hoek van de lasers 90 graden ten opzichte van de verticale as bereikt.

Op dit punt zal de uitgaande laser zelf verdwijnen en zal de inkomende laser via de opening worden teruggekaatst, waarbij deze antiparallel aan de inkomende straal beweegt en zijdelings is verschoven. U zou een afname van de achtergrond moeten zien wanneer het monster overgaat in totale interne reflectie-fluorescentie. Nadat de beeldacquisities zijn voltooid, sluit u onmiddellijk het sluiter van de microscoop en blokkeert u beide stralen. Schakel de elektronenvermenigwindingsversterking uit.

Stel de camera in om één frame op te nemen en stel het uitleesgebied van de camera in op de maximale grootte. Blokkeer tot slot één kanaal door een kaartje over F drie of F vier te plaatsen, met een longpassfilter op de microscooplamp gemonteerd. Belicht het monster en projecteer dit beeld op de camera.

Leg een snapshot van de cel vast om de gehele cel in doorgelaten licht weer te geven. Hier wordt een voorbeeld getoond van een tweekleurige F palm acquisitie van een NIH 3T3-cel die zowel DENDRA 2 Hemagglutinine als PAM Cherry actine tot expressie brengt. Het doorgelaten kanaal links bevat langere golflengten dan het gereflecteerde kanaal rechts.

Hier worden snapshots getoond van dezelfde tweekleurige F OM-acquisitie na achtergrondsubtractie en transformatie om de linker- en rechterkanalen over elkaar heen te leggen. Individuele moleculen kunnen worden geïdentificeerd en gelokaliseerd. Sommige moleculen lijken helderder in het transmissiekanaal en sommige hebben een gelijkmatigere verdeling van de emissie tussen de twee kanalen.

Dit geeft het verschil in emissiespectra tussen PAM cherry en DENDRA two respectievelijk aan en wordt in analyses gebruikt om deze twee soorten te identificeren. Het hier getoonde histogram geeft een verhouding aan van de intensiteit van het rood doorlatende kanaal gedeeld door de totale intensiteit voor alle gelokaliseerde moleculen nadat de toleranties waren toegepast. De pixels verschijnen wit in de linkeronderafbeelding en verschijnen rood in de uiteindelijke samengevoegde afbeelding rechtsonder, terwijl die in het groene gebied als wit worden weergegeven in de rechterbovenafbeelding en groen verschijnen in de uiteindelijke samengevoegde afbeelding rechtsonder.

De gekozen drempelwaarden bij het renderen hebben een grote invloed op de mate van ruis en het uiterlijk van de colocalisatie. Hier worden drie verschillende renderopties getoond die leiden tot variërende gradaties van bleed-through; de meest conservatieve drempelwaarden zijn onderaan weergegeven. Histogrammen van Color F palm alpha zijn het best te interpreteren wanneer er twee duidelijk herkenbare pieken in de afbeelding aanwezig zijn.

Hoewel het histogram aan de linkerkant een goede kandidaat is voor verdere analyse, zullen de afbeeldingen die voortkomen uit de andere twee histogrammen veel moeilijker te interpreteren zijn na het volgen van deze procedure. Methoden zoals totale interne reflectie-microscopie en live cell imaging kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop eiwitten op nanoschaal zijn georganiseerd in levende celmembranen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw eigen FAR-microscoop opstelt en gebruikt om gegevens te verzamelen.

Vergeet niet dat werken met lasers extreem gevaarlijk kan zijn, en dat een veiligheidstraining moet zijn voltooid voordat u deze procedure uitvoert.