Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het optische microscopieveld, zoals het maken van afbeeldingen met superresolutie en FRET-beelden met dezelfde microscoop. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we drie verschillende beeldmodules in één microscoop kunnen combineren, waardoor de totale kosten aanzienlijk worden verlaagd. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de montage van de excitatie pad is moeilijk te leren.

Ze vereisen een goede keuze van onderdelen en een gevoelige optische uitlijning. Installeer om te beginnen een gegevensacquisitiekaart via een PCI-interface en gebruik deze om de lasers op de computer aan te sluiten. Control the lasers'on and off behaviors by transistor-transistor logic output and their power adjustment by the analog output of this card.

Bereid vervolgens een trillingsgeïsoleerde optische tafel met spiegels en bundelspleters zoals hier weergegeven en beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Combineer de laserstralen in een single-mode optische vezel door eerst het monteren van een vezel adapter plaat in een z-as vertaling mount. Monteer vervolgens een achromatische doublet lens in een kooiplaat.

Gebruik een verlengstang om de adapter en lens aan te sluiten om een kooi te vormen. Gebruik vervolgens een-inch dikke optische palen om de kooi op de optische tafel te monteren. Lijn de 647 nanometer laser door het aanpassen van de componenten om maximale laser vermogen te krijgen door de vezel.

Zodra de uitlijning van de eerste laser is gedaan, installeer tijdelijk een paar irissen en lijn de rest van de lasers een voor een. Controleer de uitlijningsefficiëntie van elke laser met een vermogensmeter. Zorg ervoor dat u een iris voor de adapterplaat laat om de reflecties van de lasers te verminderen.

Ontwerp en installeer vervolgens de vergrotingslens zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Om het astigmatisme-effect te creëren dat nodig is voor het extraheren van de z-coördinaten van elk molecuul, plaatst u een 3D-lens met een brandpuntsafstand van 10 meter in de cassette en plaatst u deze in het emissiestraalpad. Gebruik emissiefilters die in een barrièrefilterwiel naast de microscoop zijn aangesloten om de trillingen tijdens sequentiële aquafluorescentievorming te minimaliseren.

Voor gelijktijdige multicolor detectie tijdens single-molecule FRET experimenten, plaats een andere filter set in een emissie splitter. Om voor diffractie-beperkte beeldvorming met behulp van epi-excitatie, eerst de excitatie laser incidentele hoek aan te passen aan epi-modus in de verlichting arm. Schakel vervolgens de 3D-lens uit en steek de bypasskubus in de emissiespl splitter.

Steek vervolgens de maglens in voor verbrede verlichting. Neem na het instellen meerdere kanalen, z-stack en/of tijdverloop van uw voorbeeld op basis van de gewenste resultaten. Als u multicolor single-molecule detectie van oppervlakte-geïmmobiliseerde moleculen wilt instellen, verplaatst u eerst het filterwiel naar een lege positie.

Hierdoor kunnen de lasers passeren. Pas vervolgens de excitatielasershoek aan de grasmathoek aan en ontkoppel zowel de mag- als de 3D-lenzen. Schakel vervolgens de driekanaalsmodus in de emissiespliter in door eerst de bypasskubus te vervangen door een kalibratiekubus waarmee al het licht door alle kanalen kan gaan.

Schakel vervolgens de camera onder DIC in en pas het diafragma van de emissiespleet aan tot er drie volledig gescheiden kanalen op het scherm verschijnen. Draai de verticaal-horizontale verstelknoppen op de emissiespl splitter en lijn de drie kanalen ongeveer uit. Schakel vervolgens de camera uit en vervang de kalibratiekubus door de driedubbele kubus.

Plaats een monster van 100 nanometer multi-channel kralen. Bij excitatie op 488 nanometer zenden de 100 nanometer multi-channel kralen verschillende golflengten van licht uit, waardoor driekanaals uitlijning mogelijk is. Zet vervolgens de camera en de 488 nanometerlaser aan, zoom in op een van de heldere kralen en lijn de drie kanalen uiteindelijk uit door de verstelknoppen opnieuw te draaien.

Met het monster nu op zijn plaats, met behulp van een zwakke laser, navigeren naar een gebied met een redelijke spotdichtheid en pas de laser kracht en belichtingstijd aan aanvaardbare signaal-ruis en fotobleaching niveaus te bereiken. Gebruik vervolgens de beeldsoftware om time-lapse-beelden te maken. Voor super-resolutie beeldvorming, beginnen met het invoegen van de 3D-lens en verwijder de mag lens.

Bepaal vervolgens de optimale excitatie laser incidentele hoek om de grasmat hoek. Om de juiste objectieve hoogte voor SR-beeldvorming te vinden, gebruikt u DIC-beeldvorming om het middelste vlak van de cellen te vinden. Identificeer het vlak aan de hoogte waarop de cellen transparant worden.

Zodra het gewenste brandpuntsvlak is bepaald, begint super-resolutie imaging. Tijdens het beeldvorming, verander de 405-nanometer laser macht om een redelijke dichtheid van knipperende plekken te behouden. Begin met beeldvorming zonder violette laserkracht.

Tel het aantal knipperende plekken in een bepaalde periode en verhoog het violette laservermogen, zodat het aantal knipperende plekken boven een door de gebruiker gedefinieerde teldrempel in het gezichtsveld wordt gehouden. Analyseer de gegevens door het detecteren van de centroids van elke plek in de beeldvormende frames en extraheren z-waarden voor elke plek uit X- en Y-breedtes. Bouw een gereconstrueerd beeld en visualiseer objecten in 3D.

Deze microscoopopstelling maakt flexibel en reproduceerbaar schakelen mogelijk tussen verschillende beeldvormingsmethoden, waaronder conventionele epifluorescente beeldvorming, op één moleculen gebaseerde superresolutiebeeldvorming en multicolor single-molecule detectie. Om fijnere details in de moleculaire assemblage te onthullen, combineert de microscopie met superresolutie duizenden beelden zoals deze. Deze beelden worden vervolgens gereconstrueerd om een uiteindelijke afbeelding met superresolutie te genereren.

Technieken met superresolutie zorgen voor een hoge ruimtelijke resolutie, met details die niet met andere technieken kunnen worden gezien. Dit wordt benadrukt in de twee beelden hier getoond. De super-resolutie beeld toont dezelfde bacteriële regulerende RNase als de epifluorescentie beeld, maar zorgt voor een molecuul detectie.

SmFRET is een andere methode die in staat is angstrom tot nanometer resolutie. Hier werden gevouwen RNA-moleculen gelabeld met een groene donorkleurstof en een rode acceptorkleurstof. Fluorescentie intensiteit trajecten kunnen worden gewonnen uit individuele enkele moleculen, het genereren van FRET-efficiëntie als een functie van de tijd.

Vergeet niet dat het werken met lasers gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van oogbescherming of het verlagen van laserkrachten moeten altijd worden genomen waar het uitvoeren van deze procedure.