Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System
October 16th, 2013
Deze studie gebruikte een multi-well plaat microfluïdische systeem aanzienlijk verhogen doorvoer cel rollen studies onder fysiologisch relevante schuifkracht. Gezien het belang van cel rollen in het multi-step cel homing cascade en het belang van cel homing na systemische toediening van exogene populaties van cellen bij patiënten, biedt dit systeem potentieel als een screening platform om celtherapie verbeteren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om celrolonderzoeken uit te voeren met verhoogde doorvoer onder een strikt gecontroleerde, fysiologisch relevante schuifstroom. Dit wordt bereikt met behulp van een multi-well microfluïdisch systeem waarin aangrenzende wells in een gespecialiseerde plaat zijn verbonden via een microfluïdische kanaal. De interface van het systeem verbindt een elektro pneumatische pomp met de bovenkant van de multi-well plaat en past een pneumatische druk toe die de vloeistof vanuit de binnenkant van de wells door de microfluïdische kanalen met een gedefinieerde stroomsnelheid drijft.
Zodra het microfluïdische kanaal is bedekt met het gewenste substraat of celmono-monolayer, worden de cellen van belang geïntroduceerd in het microfluïdische kanaal om hun specifieke rolinteracties met het beklede oppervlak te onderzoeken. De roleigenschappen van de cellen terwijl ze onder verschillende experimentele omstandigheden met het substraat of met een monolaag bekleed oppervlak interageren, kunnen vervolgens worden geanalyseerd met de juiste software. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals parallel plate flow chamber, is dat deze techniek de studie van zilveren roleigenschappen mogelijk maakt met een aanzienlijk hogere doorvoer onder nauwkeurig gecontroleerde, fysiologisch relevante buisstroom, terwijl het gebruik van reagentia en cellen wordt geminimaliseerd. Dit platform kan helpen bij het bevorderen van exogene cel-gebaseerde therapieën door snelle en nauwkeurige analyse van engineeringbenaderingen die zijn ontworpen om celrollen en -homing te beïnvloeden.
Om een microfluïdisch kanaal met een eiwitsubstraat te bedekken, voegt u eerst 25 tot 50 microliter van de vers bereide eiwitoplossing toe aan de inlaat. Pas vervolgens een scheerkracht van twee dine per vierkante centimeter toe gedurende vijf minuten om de oplossing in het kanaal te perfunderen. Wanneer een druppel vloeistof zichtbaar wordt in de uitlaat, stopt u de stroom, incubeert u de plaat gedurende de juiste tijd met het eiwit van belang en aspireert u vervolgens de oplossing van elk wel.
Voeg vervolgens 200 tot 500 microliter PBS toe aan de uitlaatwel en pas vervolgens een scheerkracht van twee dines per vierkante centimeter toe gedurende vijf minuten om het kanaal te wassen om een celmonolayer binnen het microfluïdische kanaal te creëren. Begin door de cellen van belang gedurende drie minuten voorzichtig te trypsiniseren vanuit hun kweekbakje, stop de reactie met een dubbelvoudige hoeveelheid volledig medium en centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 400 Gs en rt. Was vervolgens de pellet in 10 milliliter volledig medium.
Resuspendeer vervolgens de cellen in één milliliter vers volledig medium en tel ze, pas de celoplossing aan tot de juiste concentratie en plateer vervolgens 25 tot 50 microliter van de celsuspensie in elke inlaat. Plaats nu de plaat op het microscoopplatform en pas een scheerkracht van twee dines per vierkante centimeter toe om de cellen in het kanaal te laten stromen totdat de cellen het hele kanaal vullen. Nadat de stroom is gestopt, vult u zowel de uitlaat als de binnenlandse wells met 200 microliter van het juiste cellmedium en laat u de cellen vervolgens bij 37 graden Celsius in 5% CO2 bezinken en hechten.
Na drie uur, wast u het kanaal met volledig medium om de niet-bevestigde cellen te verwijderen. De cellen moeten nu volledig confluent zijn en klaar voor gebruik om de inflammatoire activering van endotheelcellen in de kanalen te induceren. Voeg 100 microliter vers bereide TNF-alpha-oplossing toe aan de inlaatwel en introduceer vervolgens de oplossing in het kanaal door een scheerkracht van twee dines per vierkante centimeter gedurende vijf minuten toe te passen.
Voor de controle niet-geactiveerde endotheelcelkanalen, voegt u 100 microliter basaal endotheelcelmedium toe aan de inlaat. Om P of E selectine op het endotheelceloppervlak te blokkeren, introduceert u vijf microgram per milliliter van het juiste neutraliserende antilichaam in het kanaal en incubeert u de plaat gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Was vervolgens de kanalen met basaal medium voordat u met de roltest begint.
Bekijk de kanalen zorgvuldig onder een microscoop om te bevestigen dat de kanalen goed zijn bedekt. Was vervolgens de HL 60-celsuspensie met basaal medium twee keer na de tweede wastelling en suspendeer vervolgens de cellen in IMDM met een concentratie van vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Nadat u 25 tot 50 microliter van de celsuspensie in de uitlaat hebt toegevoegd, plaatst u de plaat in de temperatuur gecontroleerde plaathouder van 37 graden Celsius en plaatst u de plaathouder op het microscoopplatform.
Breng de cellen in het microfluïdische kanaal. Ze moeten binnen 10 tot 15 seconden worden waargenomen die vanuit de uitlaat naar de inlaat stromen. Hier kunnen de fluorescent gelabelde HL 60-cellen worden waargenomen die interageren met het P selectine-gecodeerde oppervlak en een rolreactie vertonen om de rolreactie als functie van schuifspanning te onderzoeken. Verlaag de schuifspanning tot 0,25 dine per vierkante centimeter en verwerf 20 tot 32 video's met behulp van de stream-acquisitiefunctie bij elke gewenste schuifspanning en door geleidelijk de schuifspanning te verhogen van 0,25 tot vijf dines per vierkante centimeter.
Gebruik tenslotte een CCD-camera om video van de test te verkrijgen met een stream-acquisitie van 11 frames per seconde. Hier wordt bijvoorbeeld een HL 60-cel getoond die rolt op een monolaag van chope-cellen. Analyseer de rolpaden en snelheden met de geschikte compatibele software.
HL 60-cellen worden beschouwd als de gouden standaard voor rollers omdat ze een verscheidenheid aan homing-liganden tot expressie brengen, waaronder de rolliganden, P select en glycoproteïne-ligand één en CI Lewis X. Om de mogelijkheden van het multi-well plaat microfluïdische systeem te testen, werden talrijke microfluïdische kanalen gelijktijdig bedekt met verschillende substraten en de rolinteracties van HL 60-cellen werden geanalyseerd. Met deze substraten werd geanalyseer
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie demonstreert een multi-well plate microfluïdisch systeem dat de doorvoer van cel rollende studies onder fysiologisch relevante schaarstroom verbetert. Dit innovatieve platform heeft het potentieel om cel-gebaseerde therapieën te verbeteren door de analyse van cel rollende en homing mechanismen te vergemakkelijken.
Belangrijke studie componenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Microfluïdica
- Cel-gebaseerde therapieën
Achtergrond
- Cel rolling is een kritische stap in het cel homing proces.
- Het begrijpen van cel interacties onder schaarstroom is essentieel voor therapeutische toepassingen.
- Bestaande methoden hebben beperkingen in doorvoer en controle.
- Deze studie behandelt deze beperkingen met een nieuwe microfluïdische aanpak.
Doel van studie
- Om de doorvoer van cel rollende studies te verhogen.
- Om fysiologisch relevante schaarstroom omstandigheden te handhaven.
- Om een platform te bieden voor het screenen van cel-gebaseerde therapieën.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een multi-well microfluïdisch systeem.
- Verbinding van aangrenzende wells via microfluïdische kanalen.
- Toepassing van pneumatische druk om vloeistofstroom te controleren.
- Analyse van cel rollende interacties met behulp van gespecialiseerde software.
Belangrijkste resultaten
- Aanzienlijk hogere doorvoer vergeleken met traditionele methoden.
- Precieze controle over schaarstroom omstandigheden.
- Geminimaliseerde consumptie van reagentia en cellen.
- Verbeterde mogelijkheid om cel rollende eigenschappen te bestuderen.
Conclusies
- Het microfluïdische systeem is een veelbelovend hulpmiddel voor cel rollende studies.
- Dit platform kan de ontwikkeling van exogene cel-gebaseerde therapieën bevorderen.
- Toekomstig onderzoek kan dit systeem benutten voor verschillende toepassingen in celbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient and predictive assessment of cell rolling under physiologically relevant flow is critical for de-risking cell therapy strategies targeting tissue homing. The multi-well plate microfluidic system enables high-throughput, quantitative analysis of cell-endothelium interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This platform advances portfolio decision-making by enabling rapid, reproducible evaluation of engineering approaches to enhance cell homing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of cell rolling mechanisms on selectin-coated and endothelial surfaces.
- Supports functional validation of homing ligands and adhesion pathways under controlled shear flow.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating the impact of specific substrates and inflammatory activation.
- Provides quantitative outputs for predictive confidence in cell therapy design.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, standardized rolling assays across multiple substrates and conditions.
- Reduces reagent and cell consumption while increasing experimental scalability.
- Enables reproducible measurement of rolling velocities and cell-surface interactions using integrated software.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of cell engineering strategies.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant inflammatory conditions by activating endothelial monolayers with TNF-α.
- Aligns in vitro rolling behavior with in vivo homing mechanisms for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of cell therapy candidates based on quantitative rolling metrics.
- Enables rapid screening of conditions to enhance therapeutic cell homing potential.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic platform integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational assay development for cell-based therapies.
- Discovery Biology: Quantifies cell rolling and adhesion under defined shear, clarifying homing pathway contributions.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for evaluating engineered cell variants or blocking reagents.
- Analytics: Outputs rolling velocities, cell counts, and path tracking for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Simulates inflammatory endothelium to align in vitro findings with preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, multi-condition platform adaptable to diverse cell types and therapeutic hypotheses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell homing mechanisms and target validation.
- Operational Value: Standardizes rolling assays, enhances throughput, and minimizes resource use.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for cell therapy engineering strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell therapy candidates based on quantitative rolling data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, cell culture, and quantitative image analysis.
- Needs access to multi-well microfluidic hardware and compatible imaging systems.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and analytical protocols.
- Adaptable to various cell types and substrate coatings with protocol optimization.
- Throughput and analysis depend on software compatibility and imaging infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Coating of Microfluidic Channels with Fibronectin, P-selectin, or E-selectin
4:09
HL-60 Rolling Assay on Substrate/Cell Monolayer-coated Microfluidic Channels
5:41
Results: Analysis of HL-60 Rolling Using the MIcrofluidic Channel System
2:07
Creation of a Chinese Hamster Ovary P-selectin (CHO-P) or Lung Microvascular Endothelial Cells (LMVEC) Monolayer Inside the Microfluidic Channel
10:22
Conclusion
3:22
LMVEC Pro-inflammatory Activation and Antibody Blocking of P/E-selectin
