Name: Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Leer celrolstudies met hogere doorvoer onder gecontroleerde schuifstroom met een multi-well microfluidisch systeem. Deze methode minimaliseert reagensverbruik en versnelt analyse voor celtherapie-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CHO-P cellen waren een soort geschenk van Dr Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health subsidie ​​HL095722 aan JMK Dit werk werd mede ondersteund door een Movember-Prostaatkanker Stichting Challenge Award naar JMK

1. Celkweek <ol><li> Human promyelocytenleukemie (HL-60) cellen <ol><li> Cultuur HL-60 cellen in 75 cm2 flessen met 15 ml van Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s medium (IMDM), aangevuld met 20% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 1% (v / v) L-glutamine en 1 % (v / v) Penicilline-streptomycine. </li><li> Opnieuw media om de 3 dagen met afzuigen helft van de celsuspensie volume en vervangen door volledig IMDM medium. </li><li> Voor carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester (CFSE) kleuring centrifuge HL-60 celsuspensie (400 xg, 5 min.), resuspendeer in een 1 uM CFSE-oplossing (bereid in voorverwarmde PBS) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Dan centrifuge cellen, aspireren supernatant en resuspendeer cellen in vers voorverwarmd medium voor 30 minuten. Was de cellen in PBS en vervolgens gebruiken voor rollende experimenten (zie Figuur 1B voor representatief beeld van CFSE-gekleurde HL-60 cellen op P-sel-gecoate oppervlak). </li></ol></li></ol><p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NB: CFSE kleuring is optioneel, en wordt hier gepresenteerd aan het rollen fenomeen in de microfluïdische kanaal te tonen. Analyse van rollen parameters in dit manuscript werd uitgevoerd op ongekleurde cellen met standaard helderveld beeldvorming. <ol start="2"><li> Lung microvasculaire endotheelcellen (LMVECs) <ol><li> Coat 100 mm petrischalen met 0,1% gelatine-oplossing (v / v in PBS) en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten. </li><li> Cultuur LMVECs op gelatine gecoate 100 mm petrischaaltjes in volledige endothelial growth medium (endotheel basaal medium-2 (EBM-2)), aangevuld met een specifieke groei supplement kit, zie REAGENTIA). Wijzig de media om de andere dag en subcultuur cellen bij het bereiken van 80-90% samenvloeiing. </li><li> Voor subcultuur, wassen cellen met PBS en los cellen met 4 ml 1 x trypsine-EDTA gedurende 3 min bij 37 ° C en geneutraliseerd in een gelijk volume van volledige EBM-2 medium. Breng de celsuspensie om een ​​15 ml buis en centrifugee (400 xg, 5 min). Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 1 ml compleet medium en endotheliale cellen te tellen met een hemocytometer. Niet over-passage van de cellen, omdat dit invloed heeft op hun morfologie en functie-gebruik alleen cellen onder passage 7 voor alle experimenten. </li></ol></li></ol><ol start="3"><li> Chinese hamster ovarium-P-selectine (CHO-P) Cellen <ol><li> CHO-P cellen, die CHO-cellen stabiel getransfecteerd menselijke P-sel te uiten zijn, werden door medewerkers (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) 11,12. </li><li> Cultuur CHO-P cellen in T175 cm2 kolven in 25 ml F-12 media. </li><li> Voor passage, wassen cellen met 10 ml PBS gedurende 4-5 seconden en vervolgens trypsinize in 10 ml 1 x trypsine-EDTA gedurende 3 min bij 37 ° C, gevolgd door neutralisatie volledige media. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie (400 xg, 5 min.), voorzichtig zuig de supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml volledige media en tel de cellen meteen hemocytometer. </li></ol></li></ol> 2. Werking van de geïntegreerde Multi-well plaat Microfluidic System <ol><li> Zorg ervoor dat alle apparatuur goed is aangesloten en zet de verschillende modules: computer, controller, omgekeerde microscoop, en CCD-camera. </li><li> Open de imaging software, zorg ervoor dat de multi-well plaat module en de beeldvorming module goed worden gepresenteerd op het scherm. </li><li> Sluit de buizen naar de damp val (aangesloten op de controller) en sluit ze aan de Pressure Interface ook. </li><li> Plaats de plaat met meerdere holtes in de plaat verwarmer / adapter. Reagentia Naar putjes (hieronder beschreven) welke interface bovenkant van de plaat. Plaats plaat voor de beeldvorming op geautomatiseerde podium. </li><li> De interface hecht aan de bovenkant van de plaat en past een pneumatische druk van de controller naar de top van de putten, het besturen van de vloeistof door de microfluïdische kanalen met de gedefinieerde stroomsnelheid gemakkelijk geregeld met de multi-well plaatmodule scherm onder de handmatige modus. </li><li> Reagentia in het kanaal stroom over een observatie gebied, gelegen tussen de putten. Microfluïdische kanaal afmetingen zijn 350 micrometer breed x 70 micrometer lang. De lengte van het lineaire kanaal 1 mm en de bodem van de kanalen bestaat uit een 180 urn dekglaasje glas, die verenigbaar met helderveld, fase fluorescentie en confocale microscopie. </li><li> Verwerven van video&#39;s met behulp van een CCD-camera (acquisitie stroom, 11 beelden / sec) en analyseren via compatibele software. </li></ol> 3. Coating van microfluïdische kanalen met een eiwitsubstraat of een celmonolaag <ol><li> Microfluïdische kanaal bekleden met fibronectine of P-/E-selectin <ol><li> Bereid 1 ml van 20 ug / ml fibronectine-oplossing in PBS. Alter volume op basis van het aantal kanalen te coaten (gebruik 25-50 gl fibronectine per kanaal). </li><li> Voeg 25-50 ul van fibronectine oplossing voor elke inlaat goed. Solliciteer dwarskracht van 2 dyn / cm 2gedurende 5 minuten om het kanaal doortrekken. Let op de hiel van de vloeistof die in de uitlaat ook. Incubeer 30-45 minuten bij kamertemperatuur </li><li> Verstuif de oplossing uit putten (niet direct te zuigen uit de midden cirkel die het kanaal voedt) 1,13. Voeg 200-500 ul PBS in het stopcontact en goed wassen met PBS kanaal door het toepassen van schuifkracht 2 dyn / cm 2 gedurende 5 minuten. Het kanaal is nu goed bedekt met fibronectine en klaar voor gebruik. </li><li> Om jas met P-of E-sel, stelt een 5 ug / ml oplossing van de gewenste menselijk recombinant eiwit in PBS, en laag de kanalen zoals boven beschreven, met 1 uur incubatie bij 37 ° C coating mogelijk. </li></ol></li><li> Creatie van CHO-P of LMVEC monolaag binnen de microfluïdische kanaal <ol><li> Voorzichtig trypsinize cellen van kweekschalen gedurende 3 min, uitdoven met een 2-voudig volume van volledige media en gecentrifugeerd (5 minuten bij 400 xg). Resuspendeer cellen met 10 ml volledige media en centrifugeer (5 minuten bij 400 xg) tegn. </li><li> Tel de cellen celconcentratie bepalen de suspensie. Om de vorming van een confluente monolaag LMVEC in het kanaal te waarborgen, brengen celconcentratie 15-20 miljoen cellen / ml. Voor een confluente CHO-P celmonolaag Gebruik 50-60.000.000 cellen / ml. Gebruik 25-50 gl celsuspensie per kanaal - bepalen oorspronkelijke aantal cellen voor het experiment gebruikt dienovereenkomstig. </li><li> Voeg 25-50 gl celsuspensie in de geschikte concentratie aan de inlaat goed. Plaats de plaat op de microscoop podium en cellen te introduceren in het kanaal (2 dyn / cm 2) tot cellen worden waargenomen op het scherm vullen het gehele kanalen, en dan stoppen de stroom. </li><li> Vul beide afvoer en toevoer met 200 ul van een van beide vol LMVEC of CHO media. Laat de cellen regelen en hechten gedurende 3 uur in de incubator (37 ° C, 5% CO2). </li><li> Na de incubatie van 3 uur, was het kanaal met volledige media (2 dyn / cm 2, 10-15 min) niet gehecht te verwijderencellen. Cellen moet nu volledig samenvloeiing en het kanaal is nu klaar voor gebruik. Afhankelijk eerste cel zaaidichtheid kunnen aanvullende 2-3 uur van afwikkeling tijde aan volledige dekking van het oppervlak van met de cellen. </li></ol></li></ol> 4. LMVEC Pro-inflammatoire Activering en Antibody Blokkeren van P-/E-selectin <ol><li> Bereid een TNF-α-oplossing (10 ng / ml) in LMVEC basale media. </li><li> Inflammatoire activatie van LMVEC induceren in de kanalen, voeg 100 ul van de TNF-α oplossing voor de inlaat goed en introduceren van de oplossing in het kanaal door toepassing schuifkracht van 2 dyn / cm 2 gedurende 5 minuten. Voor controle kanalen (niet-geactiveerde EC), voeg 100 ul van LMVEC basale media om de inlaat goed en introduceren in het kanaal (2 dyn / cm 2 voor 5 min). Kanaal is nu klaar voor een rollende assay. </li><li> P-sel en E-sel op LMVECs en CHO-P cellen blokkeren, introduceren neutraliseren P-sel (kloon AK4, 5 ug / ml in basal media) of E-sel (kloon P2H3, 5 ug / ml in basale media) antilichamen in het kanaal en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Vervolgens wassen kanalen met basale media (2 dyn / cm 2 gedurende 5 minuten). Kanalen zijn nu klaar voor een rollende assay. </li></ol> 5. HL-60 Rolling Assay op Substraat / Cel-Monolayer Coated Microfluidic Channels <ol><li> Zorgvuldig onderzoek van de kanalen onder de microscoop te bevestigen dat kanalen correct zijn bekleed (bij bekleding met cellen zou volledig confluente monolaag worden waargenomen). </li><li> HL-60 cel suspensie te bereiden voor het rollen experimenten centrifuge HL-60 celsuspensie (5 min bij 400 xg) en eenmaal wassen met basale media. Tel de cellen en resuspendeer in IMDM (basale media, met Ca2 + en Mg2 +) om een celsuspensie HL-60 maakt met 5.000.000 cellen / ml. Gebruik 25-50 ul van celsuspensie voor elk kanaal tot de voortschrijdende analyse uit te voeren. </li><li> Voeg 25-50 ul van de cel Suspension goed uitlaat, plaat plaats binnen de temperatuurgecontroleerde kentekenplaathouder (37 ° C) en plaats op de microscoop podium. Vervolgens cellen te introduceren in het kanaal door het toepassen van dwarskracht van 2 dyn / cm 2 (cellen worden waargenomen binnen 10-15 sec voortvloeien uit uitlaat naar inlaat). </li><li> Om de rollen zelf een functie van schuifspanning onderzoeken verminderen afschuiving 0,25 dyn / cm 2 en verwerven 20-30 seconden video (met de functie &quot;overname stroom&quot;) in elke gewenste afschuiving (shear stijgen geleidelijk van 0,25 tot 5 dyn / cm 2. Ook kunnen hogere schaar gebruiken). </li><li> Verwerven van video&#39;s met behulp van een CCD-camera (acquisitie stroom, 11 beelden / sec) en analyseren glooiende paden en glooiende snelheden via compatibele software. </li></ol> 6. Flowcytometrie om de expressie van Surface moleculen te detecteren <ol><li> Na behandeling met trypsine, bereiden een celsuspensie (met behulp van 1-2 x 10 5 cellen / monster) van de gewenste celtype (HL-60, CHO-P of LMVECs) in PBS (- / -), aangevuld met 2% FBS. Was de cellen tweemaal en breng monstervolume 50 pl (met dezelfde buffer). </li><li> Incubeer elk monster met de gewenste fluorofoor-geconjugeerde Ab (zie bijgevoegde tabel voor gedetailleerde informatie) bij 4 ° C gedurende 20 minuten (afdekken met aluminiumfolie). </li><li> Was de cellen tweemaal (dezelfde buffer) en breng uiteindelijk volume van gekleurd celsuspensie tot 200 pi. Analyseer de monsters met een flow cytometer om expressie van oppervlaktemoleculen detecteren. </li></ol>

<ol><li>Conant, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well+plate+microfluidic+system+for+investigation+of+dynamic+platelet+behavior+under+variable+shear+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).</li>
<li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well+plate-coupled+microfluidic+devices+designed+for+facile+image-based+cell+adhesion+and+transmigration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).</li>
<li>Ankrum, J., Karp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapy%3A+Two+steps+forward%2C+one+step+back%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back.</a> Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).</li>
<li>Karp, J. M., Leng Teo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+homing%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details.</a> Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li>
<li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+selectins+in+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The role of selectins in inflammation and disease.</a> Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).</li>
<li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9(2001).</li>
<li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte%2Fendothelial+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li>
<li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+adhesion+and+aggregation+under+flow+using+microfluidic+flow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells.</a> J. Vis. Exp. (10), e1644(2009).</li>
<li>Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+platelet+P-selectin+and+microparticle+PSGL-1+in+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation.</a> Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).</li>
<li>Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+macrophages+express+both+P-selectin+and+PSGL-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1.</a> J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).</li>
<li>Conant, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+well-plate+microfluidic+devices+to+conduct+shear-based+thrombosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays.</a> J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).</li>
<li>Larsen, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+and+E-selectin.+Distinct+but+overlapping+leukocyte+ligand+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities.</a> J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectin+ligands%3A+will+the+real+ones+please+stand+up%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Selectin ligands: will the real ones please stand up.</a> J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).</li>
<li>Bohnsack, J. F., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+beta+1+integrin+fibronectin+receptors+on+HL60+cells+after+granulocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation.</a> Blood. 83, 543-552 (1994).</li>
<li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+%28CD62L%2CP%2CE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).</li>
<li>Moore, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+glycoprotein+ligand-1+mediates+rolling+of+human+neutrophils+on+P-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin.</a> J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).</li>
<li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+roll+on+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils roll on E-selectin.</a> J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+inducible+expression+of+P-selectin+and+E-selectin+in+mice+and+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates.</a> Blood. 94, 3820-3828 (1999).</li>
<li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoengineering+of+HCELL%2C+the+human+bone+marrow+homing+receptor%3A+sweetly+programming+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. , e1009(2009).</li>
<li>Muller, W. A., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+transendothelial+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assays of transendothelial migration in vitro.</a> Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).</li>
<li>Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).</li>
<li>Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+device+for+high-throughput+viability+screening+of+flow+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New device for high-throughput viability screening of flow biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Selectin ligands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).</li>
<li>Ramos, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+demonstration+of+P-selectin-+and+VCAM-1-dependent+mononuclear+cell+rolling+in+early+atherosclerotic+lesions+of+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+1-derived+O-glycans+are+essential+E-selectin+ligands+on+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+engages+PSGL-1+and+CD44+through+a+common+signaling+pathway+to+induce+integrin+alphaLbeta2-mediated+slow+leukocyte+rolling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling.</a> Blood. 116, 485-494 (2010).</li>
<li>Simone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rolling+and+adhesion+on+surfaces+in+shear+flow.+A+model+for+an+antibody-based+microfluidic+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectronic+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system.</a> Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).</li>
<li>Perozziello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+modulate+tumor+cell+line+susceptibility+to+NK+cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition.</a> Small. 8, 2886-2894 (2012).</li>
<li>Perozziello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+biofunctionalisation+protocols+to+form+multivalent+interactions+for+cell+rolling+and+phenotype+modification+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations.</a> Electrophoresis. , (2013).</li>
<li>Simone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+in+situ+microfluidic+method+for+creating+multivalent+surfaces%3A+toward+functional+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics.</a> Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).</li>
<li>Sarkar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered cell homing.</a> Blood. 118, e184-e191 (2011).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Migration+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Modified+With+CXCR4+Gene+to+Infarcted+Myocardium+Improves+Cardiac+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance.</a> Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).</li>
<li>Enoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+mesenchymal+cell+engraftment+by+IGF-1+improves+left+ventricular+function+in+rats+undergoing+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction.</a> Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).</li>
</ol>

Auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Een van de belangrijkste uitdagingen succesvolle vertaling van exogeen celtherapie is het onvermogen om cellen efficiënt te leveren aan plaatsen van verwonding en ontsteking met een hoog rendement engraftment 3. Cell rollen is een cruciale stap in het proces van cel homing, de vertraging van cellen vergemakkelijken op de wanden van bloedvaten, uiteindelijk leidend tot de stevige adhesie en transmigratie door het endotheel in het weefsel 5. Beter begrip van het walsen verkregen voor kandidaat celtyp...

Een van de belangrijkste uitdagingen in de succesvolle klinische vertaling van cel-gebaseerde therapie is de inefficiënte levering of targeting van systemisch toegediend cellen aan gewenste locaties 3,4. Bijgevolg is er een voortdurende zoektocht naar benaderingen cel homing verbeteren, en in het bijzonder cel rollen, als een strategie voor celtherapie verbeteren. Cel rollen op de bloedvaten is een belangrijke stap in de cel homing cascade, klassiek gedefinieerd voor leukocyten die zijn aangeworven om ziekteplaatsen 5. Deze stap wordt geregeld door specifieke interacties tussen endotheliale selectine namelijk P-en E-selectine (P-en E-sel), en de teller liganden op het oppervlak van leukocyten 5,6. Beter begrip en een grotere efficiëntie van de cel homing, en in het bijzonder de rollende stap, zijn van groot belang in de zoektocht naar nieuwe platforms om celtherapie verbeteren. Tot op heden dit is bereikt door het gebruik van parallelle plaat stromingskamers (PPFCs), bestaande uit twee platte plates met daartussen een pakking met een instroom en uitstroom poort aan de bovenste plaat, waardoor een celsuspensie wordt geperfuseerd met een spuitpomp 7,8, 9. Het oppervlak van de bodemplaat kan worden bekleed met een relevant celmonolaag / substraten en de interactie tussen geperfundeerde cellen en het oppervlak onder schuifkracht wordt vervolgens onderzocht 7. Echter, PPFC is een lage omzet, reagens-consumeren, en tamelijk vervelend methode, met belvorming, lekkage en slecht gecontroleerde stroom presenteren belangrijke nadelen. Een alternatieve techniek voor de traditionele PPFC is een multi-well plaat microfluïdische systeem, waardoor hogere doorvoercapaciteit van cellulaire assays (tot 10 keer hoger dan PPFCs) onder nauwkeurige computergestuurde schuifstroom met lage reagensverbruik 1,10. Cell rollen experimenten worden uitgevoerd binnen het microfluïdische kanalen, die kunnen worden bekleed met cel monolagen of speciale substraten en afgebeeld using een microscoop, met rollende eigenschappen gemakkelijk geanalyseerd met behulp van een geschikte software. In deze studie demonstreren we de mogelijkheden van deze multi-well plaat microfluïdische systeem bestuderen van de roleigenschappen van de menselijke promyelocytische leukemie (HL-60) cellen op verschillende oppervlakken. HL-60 rollen op substraten zoals P-en E-sel, en op cel monolagen die verschillende rollen receptoren werd geanalyseerd. Bovendien antilichaam (Ab) blokkeren gebruikt om directe betrokkenheid van specifieke selectinen bij het mediëren van de rolbeweging van HL-60 op de oppervlakken te tonen. Rolling experimenten werden uitgevoerd met een verhoogde doorvoersnelheid, onder stabiele afschuifstroming, met minimale reagens / cel verbruik, waardoor efficiënte analyse van de belangrijkste rollen parameters zoals walsen snelheid, het aantal rollen cellen, en glooiende pad eigenschappen.

<table><tbody><tr><td>Human Lung Microvascular Endothelial Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)</td><td>Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HL-60 Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Cultuur Reagents</td></tr><tr><td>Endotheel Basaal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Endotheel Basaal Medium Supplementen</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV SingleQuots</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>IMDM - Iscove's Gemodificeerd Dulbecco's Medium 1x</td><td>Gibco</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (L/G) 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovien serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Sa550</td><td></td></tr><tr><td>Petri schotels</td><td>BD Falcon</td><td>BD-353003</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Cell Cultuur Dish, Tissue-Culture Behandeld Polystyrene</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (15 ml polypropyleen conische buizen)</td><td>MedSupply Partners</td><td>TC1500</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flacons</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine Oplossing (2%)</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>dPBS (zonder calciumchloride en magnesiumchloride)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA Oplossing (10x)</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antilichamen</td></tr><tr><td>Anti-hE-Selectin/CD62E</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>FITC Geconjugeerd Muis IgG1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hP-Selectin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA34</td><td></td></tr><tr><td>FITC Geconjugeerd Muis IgG1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA34</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis IgG&shy;1 &kappa; Isotype Control</td><td>BD Bioscience</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18</td><td>Santa Cruz</td><td>SC70545</td><td></td></tr><tr><td>FITC Geconjugeerd</td><td>Santa Cruz</td><td>SC70545</td><td></td></tr><tr><td>Normale Muis IgM-FITC Isotype Control</td><td>Santa Cruz</td><td>SC2859</td><td></td></tr><tr><td>PE Muis Anti-Human CD162, Clone: KPL-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>556055</td><td></td></tr><tr><td>PE Muis IgG1 k Isotype Control</td><td>BD Pharmingen</td><td>550617</td><td></td></tr><tr><td>Anti-P-Selectin Ab (AK4)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC19996</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3</td><td>Millipore</td><td>MAB2150</td><td></td></tr><tr><td>Muis IgG1 Isotype Control</td><td>Santa Cruz</td><td>SC3877</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Andere Reagentia</td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-alpha</td><td>PeproTech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - Voor Flow Cytometry</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Human P-selectin-FC recombinant proteïne</td><td>R&amp;D Systems</td><td>137-PS-050</td><td></td></tr><tr><td>Human E-selectin-FC recombinant proteïne</td><td>R&amp;D Systems</td><td>724-ES-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Human, Plasma</td><td>Invitrogen</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Bioflux 1000</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>Bioflux Montage was de software die werd gebruikt om de experimenten uit te voeren en de gegevens te analyseren</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux 48-wells platen</td><td>Fluxion Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>CFlow Plus was de software die werd gebruikt om de experimenten uit te voeren en de gegevens te analyseren</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-S</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 CCD camera</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

systematische analyse van in vitro cel rolling met behulp van een multi-well plaat microfluidic system

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Een belangrijke uitdaging voor celtherapie is het onvermogen om systemisch doel een grote hoeveelheid levensvatbare cellen met een hoge efficiëntie weefsels van belang na intraveneuze of intra-arteriële infusie. Bijgevolg toenemende cel homing wordt momenteel bestudeerd als een strategie om celtherapie verbeteren. Cel rollen op het vasculaire endotheel is een belangrijke stap in het proces van cel homing en kan worden gesondeerd in vitro met een parallelle plaat stroming kamer (PPFC). Echter, dit is een uiterst vervelend, lage throughput assay, met slecht gecontroleerde stroming. In plaats daarvan, gebruikten we een multi-well plaat microfluïdische systeem bestuderen van cellulaire roleigenschappen maakt een hogere doorvoer onder nauwkeurig gecontroleerde, fysiologisch relevante schuifstroom 1,2. In dit artikel laten we zien hoe de roleigenschappen van HL-60 (menselijke promyelocytenleukemie) cellen op P-en E-selectine-gecoate oppervlakken, alsmede op cel-monolaag gecoate oppervlakken readil kan zijny onderzocht. Om beter te simuleren ontstekingen, werd de microfluïdische kanalen oppervlak bedekt met endotheelcellen (EC), die vervolgens werden geactiveerd met tumornecrosefactor-α (TNF-α), aanzienlijke verhoging interacties met HL-60 cellen onder dynamische omstandigheden. De verbeterde doorvoer en geïntegreerde multi-parameter software analyse platform, dat een snelle analyse van parameters zoals het rollen snelheden en glooiende pad maakt, zijn belangrijke voordelen voor de beoordeling cel rollen woningen in-vitro. Waardoor een snelle en nauwkeurige analyse van technische oplossingen ontwikkeld om cellen rollen en homing beïnvloeden, kan dit platform helpen vooraf exogene celtherapie.

HL-60 cellen rollen op P-en E-selectine oppervlakken, maar niet op fibronectine HL-60 cellen beschouwd gouden standaard &quot;rollen&quot; of drukken zij diverse doelzoekende liganden, waaronder de rollen liganden P-sel glycoproteïne ligand-1 (PSGL-1) en Sialyl-Lewis X (SLEX) 5,14 (figuur 1A ). Het oppervlakte-eiwit PSGL-1 werkt als een steiger voor de tetra-saccharide SLEX, bemiddelen specifieke interactie met P-en E-sel, die up-gereguleerd op het endotheel tijdens ...

Deze studie gebruikte een multi-well plaat microfluïdische systeem aanzienlijk verhogen doorvoer cel rollen studies onder fysiologisch relevante schuifkracht. Gezien het belang van cel rollen in het multi-step cel homing cascade en het belang van cel homing na systemische toediening van exogene populaties van cellen bij patiënten, biedt dit systeem potentieel als een screening platform om celtherapie verbeteren.

Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om celrolonderzoeken uit te voeren met verhoogde doorvoer onder een strikt gecontroleerde, fysiologisch relevante schuifstroom. Dit wordt bereikt met behulp van een multi-well microfluïdisch systeem waarin aangrenzende wells in een gespecialiseerde plaat zijn verbonden via een microfluïdische kanaal. De interface van het systeem verbindt een elektro pneumatische pomp met de bovenkant van de multi-well plaat en past een pneumatische druk toe die de vloeistof vanuit de binnenkant van de wells door de microfluïdische kanalen met een gedefinieerde stroomsnelheid drijft.Zodra het microfluïdische kanaal is bedekt met het gewenste substraat of celmono-monolayer, worden de cellen van belang geïntroduceerd in het microfluïdische kanaal om hun specifieke rolinteracties met het beklede oppervlak te onderzoeken. De roleigenschappen van de cellen terwijl ze onder verschillende experimentele omstandigheden met het substraat of met een monolaag bekleed oppervlak interageren, kunnen vervolgens worden geanalyseerd met de juiste software. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals parallel plate flow chamber, is dat de

systematic-analysis-vitro-cell-rolling-using-multi-well-plate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.

Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device

Dit rapport geeft een visuele voorstelling van de parallelle plaat stroom kamer analyse voor het bestuderen van leukocyten endotheliale interacties onder fysiologische shear stress. Deze methode is vooral nuttig voor het onderzoeken van de rol van het endotheel (E)-selectine en leukocyten E-selectine liganden die leiden tot leukocyten rollen op de endotheliale cellen oppervlakken.

Analyse van de Fysiologische E-selectine-Mediated Leukocyte Rolling op microvasculaire endotheel

Lijm micropatterns dat cellulaire architectuur normaliseren kan gebruikt worden om de gevoeligheid bij de detectie van de effecten van geneesmiddelen te verhogen, het verbeteren van de reproduceerbaarheid en vereenvoudiging van de geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse. Deze technologie zullen profiteren drug / siRNA screeningstesten, uitgevoerd op conventionele celcultuur ondersteunt en daardoor lijden aan overmatige cel-tot-cel variabiliteit.

Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen

Beschrijven we een protocol om te observeren en cel-rollen trajecten te analyseren op asymmetrische receptor-patroon substraten. De resulterende gegevens zijn nuttig voor de engineering van receptor-patroon substraten voor label-free cell scheiding en analyse.

Studeren Cell Rolling Trajecten op Asymmetrische Receptor Patterns

Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo&#39;s in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

Dit protocol beschrijft het gebruik van een aanpasbaar geautomatiseerde microfluidic apparaat te visualiseren van biofilm vorming in Candida albicans , onder fysiologische omstandigheden van de gastheer.

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Hier beschrijven we het gebruik van een hogere gegevensdoorvoer microfluidic bioreactor in combinatie met een fluorescente microscoop voor de analyse van shear stress effecten op Pseudomonas aeruginosa biofilms uiting van groen fluorescent eiwitten, met inbegrip van instrument instellen, de bepaling van biofilm dekking, groei en morfologische eigenschappen.

Cel analyse van Shear Stress voortleven Pseudomonas aeruginosa met behulp van een geautomatiseerde hoger-Throughput Microfluidic systeem

Dit protocol beschrijft een coatingmethode om endotheelcelgroei te beperken tot een specifiek gebied van een 6-putplaat voor afschuifspanningstoepassing met behulp van het orbitale shakermodel.

Segmentering van de groei van endotheelcellen in 6-putplaten op een orbitale shaker voor mechanobiologische studies

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Dit werk presenteert een flexibel protocol voor het gebruik van fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken (FLECS) -technologie in microwell-formaat voor vereenvoudigde, hands-off kwantificering van contractiele krachten met één cel op basis van gevisualiseerde verplaatsingen van fluorescerende eiwitmicropatronen.

Vereenvoudigde, high-throughput analyse van eencellige contractiliteit met behulp van microgepatterde elastomeren

Leer celrolstudies met hogere doorvoer onder gecontroleerde schuifstroom met een multi-well microfluidisch systeem. Deze methode minimaliseert reagensverbruik en versnelt analyse voor celtherapie-onderzoek.

Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

Meer video's verkennen