Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

Het algemene doel van het volgende experiment is om celrolonderzoeken uit te voeren met verhoogde doorvoer onder een strikt gecontroleerde, fysiologisch relevante schuifstroom. Dit wordt bereikt met behulp van een multi-well microfluïdisch systeem waarin aangrenzende wells in een gespecialiseerde plaat zijn verbonden via een microfluïdische kanaal. De interface van het systeem verbindt een elektro pneumatische pomp met de bovenkant van de multi-well plaat en past een pneumatische druk toe die de vloeistof vanuit de binnenkant van de wells door de microfluïdische kanalen met een gedefinieerde stroomsnelheid drijft.

Zodra het microfluïdische kanaal is bedekt met het gewenste substraat of celmono-monolayer, worden de cellen van belang geïntroduceerd in het microfluïdische kanaal om hun specifieke rolinteracties met het beklede oppervlak te onderzoeken. De roleigenschappen van de cellen terwijl ze onder verschillende experimentele omstandigheden met het substraat of met een monolaag bekleed oppervlak interageren, kunnen vervolgens worden geanalyseerd met de juiste software. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals parallel plate flow chamber, is dat deze techniek de studie van zilveren roleigenschappen mogelijk maakt met een aanzienlijk hogere doorvoer onder nauwkeurig gecontroleerde, fysiologisch relevante buisstroom, terwijl het gebruik van reagentia en cellen wordt geminimaliseerd. Dit platform kan helpen bij het bevorderen van exogene cel-gebaseerde therapieën door snelle en nauwkeurige analyse van engineeringbenaderingen die zijn ontworpen om celrollen en -homing te beïnvloeden.

Om een microfluïdisch kanaal met een eiwitsubstraat te bedekken, voegt u eerst 25 tot 50 microliter van de vers bereide eiwitoplossing toe aan de inlaat. Pas vervolgens een scheerkracht van twee dine per vierkante centimeter toe gedurende vijf minuten om de oplossing in het kanaal te perfunderen. Wanneer een druppel vloeistof zichtbaar wordt in de uitlaat, stopt u de stroom, incubeert u de plaat gedurende de juiste tijd met het eiwit van belang en aspireert u vervolgens de oplossing van elk wel.

Voeg vervolgens 200 tot 500 microliter PBS toe aan de uitlaatwel en pas vervolgens een scheerkracht van twee dines per vierkante centimeter toe gedurende vijf minuten om het kanaal te wassen om een celmonolayer binnen het microfluïdische kanaal te creëren. Begin door de cellen van belang gedurende drie minuten voorzichtig te trypsiniseren vanuit hun kweekbakje, stop de reactie met een dubbelvoudige hoeveelheid volledig medium en centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 400 Gs en rt. Was vervolgens de pellet in 10 milliliter volledig medium.

Resuspendeer vervolgens de cellen in één milliliter vers volledig medium en tel ze, pas de celoplossing aan tot de juiste concentratie en plateer vervolgens 25 tot 50 microliter van de celsuspensie in elke inlaat. Plaats nu de plaat op het microscoopplatform en pas een scheerkracht van twee dines per vierkante centimeter toe om de cellen in het kanaal te laten stromen totdat de cellen het hele kanaal vullen. Nadat de stroom is gestopt, vult u zowel de uitlaat als de binnenlandse wells met 200 microliter van het juiste cellmedium en laat u de cellen vervolgens bij 37 graden Celsius in 5% CO2 bezinken en hechten.

Na drie uur, wast u het kanaal met volledig medium om de niet-bevestigde cellen te verwijderen. De cellen moeten nu volledig confluent zijn en klaar voor gebruik om de inflammatoire activering van endotheelcellen in de kanalen te induceren. Voeg 100 microliter vers bereide TNF-alpha-oplossing toe aan de inlaatwel en introduceer vervolgens de oplossing in het kanaal door een scheerkracht van twee dines per vierkante centimeter gedurende vijf minuten toe te passen.

Voor de controle niet-geactiveerde endotheelcelkanalen, voegt u 100 microliter basaal endotheelcelmedium toe aan de inlaat. Om P of E selectine op het endotheelceloppervlak te blokkeren, introduceert u vijf microgram per milliliter van het juiste neutraliserende antilichaam in het kanaal en incubeert u de plaat gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Was vervolgens de kanalen met basaal medium voordat u met de roltest begint.

Bekijk de kanalen zorgvuldig onder een microscoop om te bevestigen dat de kanalen goed zijn bedekt. Was vervolgens de HL 60-celsuspensie met basaal medium twee keer na de tweede wastelling en suspendeer vervolgens de cellen in IMDM met een concentratie van vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Nadat u 25 tot 50 microliter van de celsuspensie in de uitlaat hebt toegevoegd, plaatst u de plaat in de temperatuur gecontroleerde plaathouder van 37 graden Celsius en plaatst u de plaathouder op het microscoopplatform.

Breng de cellen in het microfluïdische kanaal. Ze moeten binnen 10 tot 15 seconden worden waargenomen die vanuit de uitlaat naar de inlaat stromen. Hier kunnen de fluorescent gelabelde HL 60-cellen worden waargenomen die interageren met het P selectine-gecodeerde oppervlak en een rolreactie vertonen om de rolreactie als functie van schuifspanning te onderzoeken. Verlaag de schuifspanning tot 0,25 dine per vierkante centimeter en verwerf 20 tot 32 video's met behulp van de stream-acquisitiefunctie bij elke gewenste schuifspanning en door geleidelijk de schuifspanning te verhogen van 0,25 tot vijf dines per vierkante centimeter.

Gebruik tenslotte een CCD-camera om video van de test te verkrijgen met een stream-acquisitie van 11 frames per seconde. Hier wordt bijvoorbeeld een HL 60-cel getoond die rolt op een monolaag van chope-cellen. Analyseer de rolpaden en snelheden met de geschikte compatibele software.

HL 60-cellen worden beschouwd als de gouden standaard voor rollers omdat ze een verscheidenheid aan homing-liganden tot expressie brengen, waaronder de rolliganden, P select en glycoproteïne-ligand één en CI Lewis X. Om de mogelijkheden van het multi-well plaat microfluïdische systeem te testen, werden talrijke microfluïdische kanalen gelijktijdig bedekt met verschillende substraten en de rolinteracties van HL 60-cellen werden geanalyseerd. Met deze substraten werd geanalyseer