Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking
March 10th, 2014
Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om direct de activiteit van DNA-bindende eiwitten in levende bacteriecellen te visualiseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door cellen te visualiseren die een foto-geactiveerd fluorescent eiwit tot expressie brengen dat gefuseerd is met een DNA-bindend eiwit van interesse. De tweede stap van de procedure is om een film te maken van individuele eiwitten die foto-geactiveerd worden terwijl ze worden geïmagerd.
Vervolgens worden de gegevens geanalyseerd om eiwitlocalisaties te bepalen en eiwitten in afzonderlijke cellen te volgen. DNA-bindende gebeurtenissen worden geïdentificeerd door verandering in de diffusiecoefficient van individuele eiwitten wanneer ze chromosomen contacteren. Uiteindelijk kunnen de resultaten een kwantitatief maatstaf bieden voor eiwit-DNA-interacties op enkelcelniveau door het aantal gebonden en diffunderende eiwitten per cel te tellen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het DNA-reparatieveld, zoals de in vivo reparatiesnelheden en de ruimtelijke verdeling van reparatieplaatsen. Nu zullen we de methode demonstreren door de reparatieactiviteit van DNA-polymerase één in levende E. coli-cellen te meten. Maak eerst deksels zonder achtergrondfluorescente deeltjes in een oven gedurende een uur op 500 graden Celsius. Verbrand een voorraad deksels van dikte nummer 1,5, bewaar ze op kamertemperatuur in aluminiumfolie.
Ze zijn wekenlang goed. Concentreer vervolgens een milliliter van de vroege exponentiële fase E. coli in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter van de stam. AB 1157 poly a PA m cherry centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 2.300 G.
Verwijder het supernatant en schud de cellen op in 20 microliter restmedium en vortex de cellen in oplossing. Maak vervolgens een 1,5% lage fluorescentie aros-oplossing in gedistilleerd water. Meng 500 microliters van de gesmolten aeros met 500 microliters van twee x minimaal medium door een paar keer voorzichtig op en neer te pipetteren voor DNA-schade-experimenten met behulp van methylmethylsulfonaat of MMS, terwijl voorzorgsmaatregelen worden genomen.
Voeg 8,3 microliters MMS toe aan de 500 microliters minimaal medium voordat u het mengt met de aros voordat het mengsel afkoelt. Verspreid het gelijkmatig en gecentreerd zonder bellen te maken op een verbrande deksel.
Vlakken met een tweede verbrande deksel. Zodra het is afgekoeld, verwijdert u het bovenste deksel van de pad en voegt u een microliter geconcentreerde celsuspensie toe. Immobiliseer de cellen door de pad te bedekken met een nieuw verbrand deksel en druk zeer voorzichtig naar beneden.
De cellen moeten binnen 45 minuten worden geïmagerd voordat ze uitdrogen. Om deze tijd te verlengen, kan de pad worden verzegeld in een siliconen afdichting voor DNA-schade-experimenten. Voordat u de cellen op de pad incubeert, incubeert u ze gedurende 20 minuten.
In een bevochtigde container bij kamertemperatuur beschikt de microscoop over een 405 nanometer foto-activeringslaser en een 561 nanometer excitatielaser. Enkele molecuulgevoeligheid wordt bereikt door alleen fluoro fours te exciteren in een dunne sectie boven het oppervlak van de deksel door gebruik te maken van hoog geneigde verlichting, de fluorescentie-emissie wordt geregistreerd op een elektronenvermenigvuldigende CCD-camera. Plaats het monster op het microscoopplatform en breng de cellen scherp.
Onder doorgelaten lichtverlichting, definieert u een bijgesneden gezichtsveld om de gegevensgrootte te verkleinen en de snelheid van de camera-uitlezing te verhogen. Bedek het monster tegen omgevingslicht en schakel de versterking van de elektronenvermenigvuldigende CCD-camera in voor enkele fluoro four-detectie. Stel de framesnelheid in op 15,26 milliseconden per frame.
Dit omvat de 0,26 milliseconden camera-uitlezing. Belichtingstijden moeten voldoende kort zijn om scherpe fluorescente vlekken met weinig bewegende blaffen te observeren. Aan de andere kant moeten de sporen worden bemonsterd met voldoende lange tijdsintervallen om duidelijk de gebonden moleculen te onderscheiden van de diffunderende moleculen. Geef nu de cameragegevens weer om het donkere achtergrondsignaal te controleren.
Schakel de 561 nanometer laser in en controleer het excitatieachtergrondsignaal. Schakel de 405 nanometer laser in voor foto-activering van de Paul one PA M cherry-fusie-eiwitten en verhoog de intensiteit totdat fluorescente vlekken van enkele moleculen verschijnen. Pas nu de hoek van de excitatiebundel aan om slechts een dunne sectie van het monster te belichten.
Sluit het oppervlak van de deksel. Deze methode is gebaseerd op de detectie en nauwkeurige lokalisatie van enkele fluorescente eiwitten, dus de optimale uitlijning en gevoeligheid van de microscoop zal cruciaal zijn voor de gegevenskwaliteit. Richt hiervoor de laserstraal in de achterbrandpuntsvlak van een 100 x numeriek diafragma 1,4 objectief.
Het verplaatsen van de focuslens loodrecht op de straal verplaatst de focus van het centrum van het objectief, waardoor de straal onder een hoek uit het objectief wordt gevoerd. Zorg ervoor dat de straal de fluorescentie-intensiteit maximaliseert en de achtergrond minimaliseert. Zoek een nieuw gezichtsveld van cellen in de doorgelaten lichtmicroscopiemodus en focus de afbeelding.
Neem een camerafoto om de celcontouren vast te leggen. Schakel de 561 nanometer laser in en bleek de cellulaire autofluorescentie en achtergrondvlekken op de deksel. Glijd een paar seconden.
Voordat u met gegevensverwerving begint, start u de verwerving van een palmfilm onder continue 561 nanometer excitatie. Schakel de 405 nanometer laser in en verhoog geleidelijk de intensiteit tijdens de looptijd van de film tot één watt per vierkante centimeter. Vermijd hogere 405 nanometer intensiteiten die cellulaire autofluorescentie veroorzaken.
Let op de dichtheid van fluorescente moleculen. Het is belangrijk om de activeringssnelheden laag te houden zodat de fluorescente vlekken in elk frame duidelijk geïsoleerd zijn. Neem ongeveer 10.000 frames per film op, wat met een bijgesneden gezichtsveld doorgaans tot drie minuten duurt en tot een gigabyte harde schijfruim
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het visualiseren en kwantificeren van DNA-bindende eiwitactiviteit in levende Escherichia coli-cellen met behulp van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) in combinatie met single-molecuul tracking. De benadering stelt onderzoekers in staat om direct eiwit-DNA-interacties waar te nemen en hun dynamica binnen de cellulaire omgeving te analyseren.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biofysica
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwit-DNA-interacties is cruciaal voor inzichten in cellulaire processen.
- Traditionele methoden bieden mogelijk niet de resolutie die nodig is voor single-molecuulanalyse.
- PALM biedt een krachtige techniek voor het observeren van deze interacties in real-time.
- Deze studie richt zich op DNA-bindende eiwitten in bacteriecellen.
Doel van het onderzoek
- Om de activiteit van DNA-bindende eiwitten in levende cellen te visualiseren en te kwantificeren.
- Om de reparatieactiviteit van DNA-polymerase één in E. coli te meten.
- Om een kwantitatief meetbaarheid van eiwit-DNA-interacties op single-celniveau te verschaffen.
Gebruikte methoden
- Cellen die fotogeactiveerde fluorescente eiwitten tot expressie brengen, werden bereid.
- Filmpjes van individuele eiwitten werden verkregen tijdens fotoactivatie.
- Data-analyse omvatte het volgen van eiwitlokalisaties en diffusiecoefficienten.
- Microscopietechnieken werden geoptimaliseerd voor single-molecuuldetectie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van eiwit-DNA-interacties in levende E. coli.
- Kwantitatieve gegevens over het aantal gebonden en diffunderende eiwitten per cel.
- Inzichten in de ruimtelijke verdeling van reparatieplaatsen.
- Aangetoonde methode kan sleutelvragen in DNA-reparatie aanpakken.
Conclusies
- De methode biedt een nieuwe aanpak voor het bestuderen van eiwit-DNA-interacties.
- Het verbetert het begrip van DNA-reparatiemechanismen in levende cellen.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken naar andere cellulaire processen die DNA-bindende eiwitten betreffen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of protein-DNA interactions in live bacterial cells, providing a single-cell level readout of DNA-binding protein activity. By measuring the fraction of bound molecules via changes in diffusion coefficient, it offers a quantitative proxy for substrate abundance and target engagement in a native cellular context. This supports mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular behavior to functional output in DNA repair pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying target engagement of DNA-binding proteins in live cells.
- Operational Value: Provides a direct readout of protein activity through bound vs. diffusing molecule ratios, supporting functional validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring DNA repair activity in response to genotoxic stress, informing target confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, single-cell resolution data on protein-DNA binding events suitable for high-content screening formats.
- Reproducibility: Uses standardized photoactivation and tracking parameters to ensure consistent localization and diffusion measurements across experiments.
- Scalability: Compatible with microfluidic and high-throughput imaging setups for screening compound effects on DNA repair protein dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly measures DNA repair activity in live cells, aligning with biomarker strategies in genotoxicity and oncology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to in vivo functional readouts, supporting mechanism-based go/no-go decisions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables quantification of target modulation under DNA damage conditions, informing preclinical safety and efficacy assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, particularly for compounds targeting DNA repair or genome maintenance pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing how DNA-binding proteins engage chromosomes under basal and stressed conditions.
- Screening: Enables assessment of compound effects on protein-DNA interaction kinetics through changes in bound molecule fractions.
- Analytics: Generates diffusion coefficient histograms and mean square displacement curves as quantitative outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular binding events to functional DNA repair outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any DNA-binding protein of interest in live bacterial or adaptable eukaryotic systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time visualization of target engagement in a physiological context.
- Operational Value: Standardizes single-molecule imaging and tracking workflows for reproducible quantification of protein dynamics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional DNA repair activity, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative engagement and pathway modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule microscopy, photoactivation techniques, and MATLAB-based tracking analysis.
- Needs a TIRF-capable microscope with 405 nm and 561 nm lasers, EM-CCD camera, and environmental control for live bacterial imaging.
- Demands standardization of photoactivation intensity and tracking window parameters to avoid artifacts in molecule linkage and diffusion measurements.
- Adaptation to eukaryotic systems may require optimization of nucleoid structure, photoactivation density, and background fluorescence.
- Practical limitations include photobleaching of PA-mCherry after acquisition and the need for low activation rates to ensure single-molecule resolution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Cell Slide Preparation
4:00
Preparing Microscopy Data Acquisition
6:43
Acquiring Photo-activated Localization Microscopy (PALM) Movies
8:16
PALM Movie Analysis
12:48
Representative Results: Pol1-DNA Binding in Single Bacterial Cells
15:53
Conclusion
