Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Het algemene doel van deze procedure is om de activiteit van DNA-bindende eiwitten in levende bacteriële cellen direct te visualiseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door cellen te visualiseren die een foto-geactiveerd fluorescent eiwit tot expressie brengen, gefuseerd aan een DNA-bindend eiwit van belang. De tweede stap van de procedure is het vastleggen van een film van individuele eiwitten die gefoto-activeerd worden terwijl ze worden afgebeeld.

Vervolgens worden de gegevens geanalyseerd om de lokalisaties van eiwitten te bepalen en eiwitten binnen individuele cellen te volgen. DNA-bindingsgebeurtenissen worden geïdentificeerd door een verandering in de diffusiecoëfficiënt van individuele eiwitten wanneer zij in contact komen met chromosomen. Uiteindelijk kunnen de resultaten een kwantitatieve maat bieden voor eiwit-DNA-interacties op het niveau van de individuele cel door het aantal gebonden en diffunderende eiwitten per cel te tellen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van DNA-herstel, zoals de in vivo herstelsnelheden en de ruimtelijke verdeling van herstelplaatsen. Nu demonstreer we de methode door de herstelactiviteit van DNA-polymerase one in levende e coli cellen te meten. Maak eerst dekglasplaatjes zonder fluorescerende achtergronddeeltjes in een oven bij 500 °C gedurende een uur. Brand een voorraad dekglasplaatjes met dikte nummer 1.5 en bewaar deze op kamertemperatuur in aluminiumfolie.

Ze zijn nog wekenlang houdbaar. Concentreer vervolgens een milliliter E. coli in de vroege exponentiële fase van de stam AB 1157 poly a PA m cherry in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de cellen bij 2.300 G gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 20 µL resterend medium en vortex de cellen tot een oplossing. Maak vervolgens een 1,5% aeros-oplossing met lage fluorescentie in gedestilleerd water. Meng 500 µL van de gesmolten aeros met 500 µL tweevoudig minimaal medium door voorzichtig een paar keer op en neer te pipetteren voor DNA-schade-experimenten met methylmethaansulfonaat of MMS, waarbij de nodige voorzorgsmaatregelen worden getroffen.

Voeg 8,3 µL MMS toe aan de 500 µL minimaal medium voordat het gemengd wordt met de aros, voordat het mengsel afkoelt. Verspreid het op een gebrande dekglasplaat. Verspreid het gelijkmatig en gecentreerd zonder bubbels te vormen.

Vlak het kussentje af met een tweede gebrande dekglasplaatje. Verwijder na afkoeling het bovenste dekglas van het kussentje en voeg een microliter van de geconcentreerde celsuspensie toe. Immobiliseer de cellen door het kussentje te bedekken met een nieuw gebrande dekglasplaatje en heel voorzichtig aan te drukken.

De cellen moeten binnen 45 minuten worden gefotografeerd voordat ze uitdrogen. Om deze tijd te verlengen, kan het kussentje voor experimenten naar DNA-schade worden afgesloten in een siliconen pakking. Incubeer de cellen 20 minuten op het kussentje voordat u de cellen fotografeert.

In een bevochtigingskamer bij kamertemperatuur is de microscoop uitgerust met een 405 nanometer fotoactivatielaser en een 561 nanometer excitatielaser. Enkelvoudige molecuulgevoeligheid wordt bereikt door middel van sterk hellende belichting, waarbij enkel fluoroforen binnen een dunne sectie boven het oppervlak van het dekglas worden geëxciteerd; de fluorescentie-emissie wordt vastgelegd met een elektronenvermenigvende CCD-camera. Plaats het monster op de objecttafel van de microscoop en stel de cellen scherp.

Stel onder transsetverlichting een uitgesneden gezichtsveld (cropped field of view) in om de datagrootte te verminderen en de uitleessnelheid van de camera te verhogen. Bescherm het monster tegen omgevingslicht en schakel de gain van de elektron-multipliceerde CCD-camera in voor detectie van enkelvoudige fluorescente markers. Stel de framerate in op 15,26 milliseconden per frame.

Dit omvat de 0,26 milliseconde uitleestijd van de camera. De belichtingstijden moeten kort genoeg zijn om scherpe fluorescentievlekken met minimale bewegingsonscherpte waar te nemen. Aan de andere kant moeten de sporen met voldoende lange tijdsintervallen worden bemonsterd om een duidelijk onderscheid te maken tussen de gebonden en de diffunderende moleculen. Toon nu de cameragegevens om het donkere achtergrondsignaal te controleren.

Schakel de 561 nanometer laser in en controleer het excitatie-achtergrondsignaal. Schakel de 405 nanometer laser in voor fotoactivatie van de Paul one PA M cherry-fusie-eiwitten en verhoog de intensiteit totdat fluorescerende vlekken van enkelvoudige moleculen verschijnen. Stel nu de hoek van de excitatiebundel zo in dat slechts een dunne sectie van het monster wordt verlicht.

Sluit het oppervlak van het dekglas af. Deze methode is afhankelijk van de detectie en nauwkeurige lokalisatie van enkelvoudige fluorescente eiwitten, waardoor de optimale uitlijning en gevoeligheid van de microscoop cruciaal zijn voor de datakwaliteit. Focus daarom de laserstraal in het achterste brandpuntsvlak van een 100 x objectief met een numerieke apertuur van 1,4.

Door de focuslens loodrecht op de straal te verplaatsen, verschuift het brandpunt weg van het centrum van het objectief, waardoor de straal onder een hoek uit het objectief treedt. Streef ernaar de straal zo te positioneren dat de fluorescentie-intensiteit wordt gemaximaliseerd en de achtergrond wordt geminimaliseerd. Zoek een nieuw gezichtsveld met cellen in de modus voor transmissielichtmicroscopie en stel het beeld scherp.

Maak een snapshot met de camera om de celcontouren vast te leggen. Schakel de 561 nanometer laser in en bleek de cellulaire autofluorescentie en achtergrondvlekken opHet dekglas gedurende enkele seconden.

Voordat u begint met de data-acquisitie, start u de acquisitie van een palm-movie onder continue excitatie bij 561 nanometer. Schakel de 405 nanometer laser in en verhoog geleidelijk de intensiteit gedurende de movie tot maximaal één watt per vierkante centimeter. Vermijd hogere 405 nanometer intensiteiten die cellulaire autofluorescentie veroorzaken.

Let op de dichtheid van de fluorescente moleculen. Het is belangrijk om de activatiesnelheden laag te houden, zodat de fluorescente spots in elk frame duidelijk geïsoleerd zijn. Neem ongeveer 10.000 frames per movie op, wat bij een ingekaderd gezichtsveld doorgaans tot drie minuten duurt en tot een gigabyte aan schijfruimte in beslag neemt.

Let op: zodra een gezichtsveld is gefotografeerd, zijn de pa m cherry-fluoroforen onomkeerbaar gebleekt en kunnen ze niet meer worden waargenomen. Opnieuw: de volgende procedure maakt gebruik van aangepaste software in matlab. Enkelvoudige fluoroforen verschijnen als point spread functions of psf's.

In de film worden psfs eerst geïdentificeerd in een banddoorlaatgefilterd beeld met behulp van een Gaussische kernel met een diameter van zeven pixels; kandidaatposities komen overeen met P SFS met piekpixelintensiteiten die 4,5 keer hoger liggen dan de standaarddeviatie van de achtergrond. De lokaal helderste pixel per kandidaat-PSF dient als initiële schatting voor het fitten van een elliptische Gaussische functie. De vrije fitparameters zijn de X-positie, y-positie, X-breedte, Y-breedte, rotatiehoek, amplitude en achtergrondoffset.

Het elliptische Gaussiaanse masker houdt rekening met de molecuulbeweging tijdens de belichtingstijd, wat de PSF-plot vervaagt en vervormt. De resulterende XY-lokalisaties van alle frames van de PALM-film op het transmissielichtmicroscopiebeeld van hetzelfde gezichtsveld van de lokalisaties van Paul one PAM Cherry zouden binnen het centrale gebied van de E. coli-cellen moeten verschijnen. Geautomatiseerde tracking meet de beweging van de eiwitten, maar een succesvolle keuze van een trackingwindow is cruciaal.

Voer eerst het tracking-algoritme uit voor een reeks parameters van het trackingvenster. Zet het aantal gemeten tracks per cel af tegen het trackingvenster om het kleinst mogelijke trackingvenster te identificeren dat tracks niet splitst; toon de resulterende tracks op de transmissielichtmicroscopie-afbeelding van hetzelfde gezichtsveld. Om de ruimtelijke distributie van molecuulbewegingen binnen cellen te visualiseren, moeten de tracks diffusie vertonen die beperkt is tot individuele cellen; indien een fractie van de tracks tussen cellen lijkt over te gaan, suggereert dit dat afzonderlijke moleculen onterecht zijn gekoppeld omdat het trackingvenster te groot was gekozen en/of de fotoactivatiesnelheid te hoog was.

Zet de cumulatieve distributie van de staplengtes tussen opeenvolgende lokalisaties uit. De curve stijgt en verzadigt geleidelijk bij voldoende grote tracking-windows, maar vertoont een afkaprand indien het window te klein is gekozen. Zodra er een geschikt tracking-window is gekozen, kunnen de diffusiekarakteristieken van Paul one worden geanalyseerd.

Bereken de gemiddelde kwadratische verplaatsing (mean square displacement, MSD) tussen opeenvolgende lokalisaties voor elk traject met in totaal n stappen; gebruik uitsluitend trajecten met ten minste vijf lokalisaties om de statistische onzekerheid van de MSD te verminderen. Bereken vervolgens de schijnbare diffusiecoëfficiënt per traject op basis van de MSD. De tweede term corrigeert voor de geschatte lokalisatiefout.

Dit zijn de waarden voor de tweede term. Plot in dit voorbeeld nu een histogram van de gemeten diffusiecoëfficiëntwaarden van alle tracks in het gezichtsveld voor pol one in onbeschadigde cellen en voor pol one in cellen onder DNA-schadebehandeling met MMS; de rode balken identificeren de populatie van individuele pol one-moleculen die gebonden lijken te zijn aan het chromosoom en diffunderen met minder dan 0,15 square microns per second. Terwijl vrij diffunderende moleculen bewegen rond 0,9 square microns per second.

Nadat de gebonden Pol 1-moleculen zijn geïdentificeerd, kunnen de posities van de bindingsplaatsen worden gevisualiseerd in onbeschadigde cellen en in cellen met mm-MS-schade. De fractie gebonden sporen ten opzichte van het totale aantal waargenomen sporen biedt een directe kwantitatieve maat voor de DNA-reparatieactiviteit van pol.

Een in vivo fotoactivatie van pol one PA m cherry fusie-eiwitten werd uitgevoerd in levende E. coli-cellen. De fotoactivatie kon worden beperkt tot een enkel PA m cherry fluorofoor in één cel; hogere fotoactivatiesnelheden legden meer fluorescente moleculen bloot. Lokalisatieanalyse werd uitgevoerd voor elk frame van een PALM-video.

De precisie werd gemeten met behulp van immobiele moleculen in gefixeerde cellen of gebonden moleculen in levende cellen, en bleek 40 nanometer te zijn, wat overeenkomt met de theoretische voorspelling. Vervolgens werd de lokalisatiedrempel ingesteld wanneer deze te laag was. Willekeurige pieken in de achtergrondruis werden onterecht geselecteerd als kandidaatposities, terwijl bij een te hoge drempel sommige vlekken werden gemist.

De resulterende Paul one-lokalisaties bevonden zich in het centrale gebied van de cel, waardoor de ruimtelijke organisatie van het E. coli-nucleoïde grotendeels werd gereproduceerd. De meerderheid van de Paul one-tracks in onbeschadigde cellen vertoont diffusie. Een typische cel bevat enkele honderden Paul one-tracks, wat consistent is met het kopiegetal van ongeveer 400 Paul one-moleculen per E. coli-cel.

Verschillende typen moleculaire beweging kunnen worden geïdentificeerd door MSD-waarden te berekenen over een reeks vertragingstijden; gerichte beweging resulteert in een parabolische curve. Brownse beweging wordt gekenmerkt door een rechte lijn. Een curve van beperkte diffusie bereikt een plateau, en een offset van de MSD-curve voor immobiele deeltjes representeert de lokalisatie-onzekerheid.

De resulterende MSD-curve voor Paul one steeg lineair voor korte lag-tijden, wat duidde op brownse beweging, en raakte verzadigd bij langere lag-tijden als gevolg van celconfinement. Met behulp van deze methoden werd de DNA-reparatieactiviteit van Paul one gemeten in reactie op exogene DNA-alkylatieschade in onbeschadigde cellen. Het histogram van de diffusiecoëfficiënt van Paul one vertoont een dominante populatie van diffunderende moleculen.

De weinige gebonden moleculen kunnen betrokken zijn bij DNA-replicatie en het herstel van endogeen DNA-schade onder continue blootstelling aan 100 millimolair MMS. De frequentie van tracks met diffusiecoëfficiënten nabij nul neemt significant toe. Dit ondersteunt het model dat meer Paul one-moleculen betrokken moeten zijn bij DNA-herstel in aanwezigheid van het mutageen na deze procedure.

Andere data-analysemethoden, zoals lokalisatie en clustering, kunnen worden uitgevoerd om de ruimtelijke distributie van eiwitten in de cel te kwantificeren en om de aanwezigheid van grotere eiwitcomplexen die betrokken zijn bij DNA-herstel te onderzoeken.