Name: Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer DNA-eiwitinteracties bestuderen met TIRFM-microscopie en quantum dot-labeling op enkelmoleculair niveau. Deze methode helpt onderzoekers bij inzicht in DNA-replicatie en genreparatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr. Hasan Yardimci en Dr.Sevim Yardimci van het Francis Crick Instituut voor soort helpen in de single-molecuul experimenten, Dr. Daniel Duzdevich van Dr. Eric C. Greene's lab van Columbia University, Dr. Yujie Sun van de Universiteit van Peking en Dr. Chunlai Chen van Tsinghua Universiteit voor nuttige discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisciplinaire innovatie Team en de Newton geavanceerde Fellowship (NA140085) van de Royal Society.

1. voorbereiding van de λ-ARS317 DNA substraat
<ol><li>DNA substraat bouw en verpakking<ol>
<li>Verteren inheemse λ DNA met behulp van Xhoik enzym; versterken van 543 bp DNA fragment invloed ARS317 uit de genomic DNA van ontluikende gist gebruikend inleidingen met 20 bp homologe reeksen van stroomopwaarts en stroomafwaarts van Xhoik enzym site op lambda DNA. Voeg 100 ng van Xhoverteerd ik λ DNA en 10 ng van DNA fragment aan 10 µL van homologe recombinatie reactie systeem, en de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.</li>
		<li>Als wilt inpakken de DNA recombinatie λ, voeg 25 µL van extracten van de verpakking van de lambda in het product recombinatie en Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 90 min. Vervolgens voegt u een extra 25 µL van extracten van de verpakking van de lambda in de reactiebuis. Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 90 minuten blijven.</li>
		<li>Voeg 500 µL van steriele verdunning buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) in het reactie-systeem, en meng zachtjes door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen. Voeg 25 µL van chloroform, meng zachtjes en bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Voeg 100 µL van verpakte bacteriofaag en 100 µL van bacteriën LE392MP (gekweekt op 0.8 - 1.0 LB via toevoegen met 10 mM MgSO4) in een nieuwe buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Voeg 200 µL van phage-bacterie mengsel in 4 mL oftop agar (LB medium + 0,7% agar + 10 mM MgSO4, afgekoeld tot 48 ° C). Meng onmiddellijk door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen en giet het op een bord voorverwarmde (37 ° C) LB.</li>
		<li>Na een nacht bebroeden de plaat bij 37 ° C en de λ-ARS317 plaquette met behulp van PCR en het rangschikken van het scherm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA substraat zuivering van vloeibare lysates11,18<ol>
<li>Kies een plaque in 200 µL van steriele ddH2O met 10 mM MgCl2 en 10 nM CaCl2. Meng met 200 µL van bacteriën LE392MP (gekweekte overnachting in LB medium) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Voeg het mengsel faag-bacterie in 100 mL NZCYM (10 g/L NZ-amine, 5 g/L gist extract, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino hydrolysaat en 2 g/L MgSO4·7H2O) medium en cultuur gedurende 7 uur bij 37 ° C. Voeg 250 µL van chloroform in de cultuur en schud voor een ander 10 min.</li>
		<li>Breng de cultuur in een maatkolf van 200 mL. Voeg 5.8 g NaCl (1 M eindconcentratie), roer om op te lossen met de hand, en broeden op het ijs gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van het puin van de cel. Verzamelen van de bovendrijvende substantie in een maatkolf van 200 mL en voeg toe 10% PEG8000 (m/V). Roer om los door magnetische roeren apparaat en incubeer op ijs gedurende 30 minuten of langer.</li>
		<li>Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het neerslaan van de bacteriofaag. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de neerslag in 2 mL zuiver faag verdunning buffer. Breng dit in een tube van 15 mL en voeg 10 µL van RNase (eindconcentratie is 20 µg/mL) en 40 µL van DNase (eindconcentratie is 5 µg/mL). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Voeg toe 2 mL 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 µL proteïnase K (eindconcentratie is 10 µg/mL). Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Voeg toe 2 mL pre gekoelde Kaliumacetaat (3 M, pH 4.8), en de buis op ijs gedurende 10 minuten uit te broeden.</li>
		<li>Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van de onoplosbare materialen.</li>
		<li>Voeg 0.7 x hoeveelheid isopropanol in het supernatant. Meng door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten op RT te precipiteren DNA. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Wassen het DNA zodra met 70% ethanol door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 10 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen.</li>
		<li>Elueer het DNA met 500 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) zachtjes, en breng het DNA in 1,5 mL-buis.</li>
		<li>Uitpakken van het DNA tweemaal met behulp van fenol: chloroform door centrifugeren bij 8.000 g gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Neerslag met 0.7 x volumedelen isopropanol. Meng door de buis opwaartse zachtjes naar beneden, en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Een keer wassen met 70% ethanol, resuspendeer in 200 µL voor TE. Meten van de concentratie van DNA, en opgeslagen bij-20 ° C in 12,5 µg aliquots.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
<ol><li>Om phosphorylate biotinyleerd oligonucleotides (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotine-3') complementair aan het linkereinde van native λ DNA, voeg 1 µL (100 µM) van oligonucleotides, 7,5 µL van ddH2O, 1 µL van 10 x ligase buffer en 0,5 µL van T4 PNK. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Λ-ARS317 phosphorylate, toevoegen van 12,5 µg λ-ARS317, 3 µL van 10 x ligase buffer, Incubeer 1 µL van T4 PNK en ddH2O tot totale hoeveelheid 30 µL. de reactie bij 37 ° C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Toevoegen om te ontharden oligonucleotides met λ-ARS317, 0,5 µL van gefosforyleerd oligonucleotides, 195 µL van ddH2O, 25 µL van 10 × ligase buffer in de gefosforyleerd λ-ARS317 buis. Meng zachtjes door te draaien aan de buis ondersteboven en Incubeer bij 65 ° C gedurende 5 min. beurt uit het blok kachel, en laat het monster koel aan minder dan 33 ° C in het blok.</li>
	<li>Om het afbinden oligonucleotides met λ-ARS317, voeg 1 µL van T4 DNA ligase en 0.63 µL van ATP (200 mM). Meng voorzichtig door de buis ondersteboven draaien en na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur voor 2 uur of 4 ° C. Bewaren bij 4 ° C gedurende 1 maand. Opmerking: Om te voorkomen dat de sloop van het DNA, alle mengen stappen moeten worden gedaan door zachtjes draaien de buis ondersteboven, in plaats van mengen met behulp van pipetten.</li>
</ol>3. dekglaasje aan reinigings- en Functionalization
<ol><li>Dekglaasje aan schoonmaken<ol>
<li>Plaats 20 coverslips in 4 kleuring potten (5 coverslips/pot), bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 30 minuten in ethanol, en spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 3 keer.</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 30 minuten met 1 M kaliumhydroxide (KOH), en spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 3 keer. Herhaal de ethanol en KOH ultrasoonapparaat eens.</li>
		<li>Bewerk de ultrasone trillingen ten met aceton gedurende 30 minuten, en spoel na met ultrazuiver H2O grondig (minstens 3 maal). Opmerking: Aceton moet worden verwijderd grondig door spoelen met ultrazuiver H2O, omdat het leiden een explosie tot kan bij organische oplosmiddelen (zoals aceton) vermenging met de piranha-oplossing per ongeluk14.</li>
		<li>Plaats de coverslips in piranha-oplossing (3:1 mengsel van H2SO4 en 30% H2O2) en Incubeer bij 95 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: Piranha-oplossing is zeer energiek en erosieve, dus gebruik met voorzichtigheid. Bij de voorbereiding van piranha-oplossing, voegt toe 50 mL H2O2 eerst in een bekerglas van 500 mL glas, en vervolgens 150 mL H2dus4 langzaam af in het bekerglas.</li>
		<li>Spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 5 keer. Vervolgens wassen elke dekglaasje aan met ultrazuiver H2O grondig met behulp van 3 bekerglazen gevuld met ultrazuiver H2O en droog het dekglaasje aan met behulp van papier vanaf de rand van het dekglaasje aan. Plaatst het dekglaasje aan in de kleuring pot en droog het dekglaasje aan grondig in een oven van 110 ° C gedurende 30 minuten.<ol>
<li>Spoel het dekglaasje aan met methanol en plaats de kleuring pot in de oven van 110 ° C opnieuw aan het dekglaasje aan goed afdrogen. Opmerking: Het dekglaasje aan grondig drogen is zeer belangrijk, omdat APTES veel mogelijke oppervlakte structuren hebben zal zodra het in aanwezigheid van water19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dekglaasje aan functionalization<ol>
<li>Voeg 70 mL silane oplossing (93% methanol, 5% azijnzuur en 2% APTES) in elke pot, schroef de dop en laat de pot bij kamertemperatuur 's nachts.</li>
		<li>Was en droog de coverslips zoals beschreven in stap 3.1.5, behalve droog de coverslips grondig met stikstofgas in plaats van ze in de oven plaatsen.</li>
		<li>Los 150 mg voor mPEG (methoxy-polyethyleenglycol) en 6 mg Biotine-PEG (Biotine-polyethyleenglycol) grondig in 1 mL 0,1 M vers-en-klare NaHCO3 (pH 8.2). Vervolgens centrifuge op 17, 000 x g voor 1 min te verwijderen van de onoplosbare pinnen. Opmerking: Versgemaakte NaHCO3 is klaar; Er is geen behoefte aan te passen van de pH.</li>
		<li>Plaats van de coverslips gesilaneerde in vakken, en zet twee kleine coverslips op de bovenkant van twee uiteinden van de gesilaneerde coverslips. Pipetteer 100 µL van PEG oplossing in het midden van de gesilaneerde dekglaasje aan en plaats een andere gesilaneerde dekglaasje aan op de top.</li>
		<li>Sommige ultrazuiver H2O toevoegen in het vak te vochtig houden, en de coverslips met PEG oplossing voor ten minste 3 uur in het donker uit te broeden. Een overnachting incubatie kan eveneens werken.</li>
		<li>Scheiden van de paren dekglaasje aan en houden de functionalized oppervlakte gezicht, spoel de coverslips uitgebreid met behulp van ultrazuiver H2O en droog ze met stikstofgas.</li>
		<li>Markeer de functionalized kant van de coverslips op een van de hoeken gebruikmakend van een viltstift, houden de functionalized kant onder ogen zien, plaats ze in vakken en opslaan van de vakken in het vacuüm exsiccator voor 1 maand.</li>
		<li>Voor het opslaan van de coverslips voor een langere tijd, breng een dekglaasje aan in een tube van 50 mL geboord met een gat in de dop, dan zet de buis in een plastic zak en sluit de zak met behulp van een vacuum sealer. Op deze manier kunnen de coverslips worden opgeslagen bij-20 ° C ongeveer 3 maanden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. flow cel vergadering
<ol><li>Het snijden van een kanaal van 15 mm × 2 mm in het midden van een stukje dubbelzijdig tape (30 mm × 12 mm) met behulp van een perforatie.</li>
	<li>Afschilferen van de kant van de papier van de dubbelzijdige tape en plak deze op het glasplaatje met twee gaten. Druk op om luchtbellen te verwijderen. Gebaseerd op onze ervaring, is het makkelijker te verwijderen van luchtbellen door peeling uit de kant van de papier dan de plastic kant van de dubbelzijdige tape.</li>
	<li>Snijd een functionalized dekglaasje aan (60 mm × 24 mm) in vier stukken (30 mm × 12 mm) met behulp van een diamant-tipped glas scribe en verwijderen van het puin met stikstofgas. Vergeet niet om de functionalized kant onder ogen zien.</li>
	<li>Afschilferen van de plastic kant van de dubbelzijdige tape, en plak de dia op de functionalized dekglaasje aan. Druk zachtjes op luchtbellen tussen het dekglaasje aan en de band verwijderen. Het grondig verwijderen van luchtbellen kan behoeden de stroom cel terwijl buffers werden gepompt in het lekken.</li>
	<li>Invoegen inlaat en uitlaat slang in kleine en grote gaten, respectievelijk. Bevestigen van de buis met behulp van epoxy.</li>
	<li>Pomp 20 µL van daar (0,2 mg/mL) in cel van stroom met behulp van een injectiespuit handmatig en Incubeer bij RT gedurende 10 min. Vervolgens pomp blokkerende buffer10 in stroom cel ter vervanging van daar, en bewaar deze bij kamertemperatuur.</li>
</ol>5. enkel molecuul visualisatie
<ol><li>De focal uitlijning van rood en far-red met A5 op de fluorescentie Microscoop test dia #1 verkrijgen door gelijktijdige excitatie met behulp van een 532 nm laser en een 640 nm-laser. Produceren dubbele golflengte beelden met het splitsen van optica (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Plaats van de cel van de stroom op de Microscoop en sluit haar uitlaat slang aan een langere buis aansluiten met een veer van de 10 mL op een geautomatiseerde infusie/intrekking programmeerbare pomp geïnstalleerd. Opmerking: Het pompen van buffers in de cel van de stroom onderstaande middelen intrekking van de buffers van de buizen van de inlaat van de stroom-cel met de spuit.</li>
	<li>Pomp buffer met blokkerend op 500 µL/min in de cel van de stroom lucht snel verwijderen en ervoor zorgen dat de buffer in de cel van de stroom opgeheven wordt. Vervolgens de buffer met blokkerend op 200 µL/min pomp in de cel van de stroom en de uitlaat slang om te verwijderen van luchtbellen uit de buis van de inlaat en de stroom-cel grondig wegknippen. Opmerking: Alle buffers in de cel stroom gepompt moeten worden ontgast in een vacuüm exsiccator gedurende ten minste 15 minuten vóór gebruik.</li>
	<li>Voeg 0,5 µL van biotinyleerd λ-ARS317 DNA in 80 µL van buffer met blokkerend, en pomp het in de cel van de stroom aan 25 µL/min gedurende 2 minuten. Vervolgens spoel λ-ARS317 DNA met behulp van 200 µL van buffer met blokkerend met een snelheid van 50 µL/min.</li>
	<li>Pomp 200 µL van bindende buffer10 bij een snelheid van 50 µL/min voor het verwijderen van de buffer met blokkerend in de cel van de stroom.</li>
	<li>Voeg 0.2 µL van daar beklede Qdot705 (1 µM) en 0.2 µL van biotinyleerd ORC (1,2 µM) in een buis, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Daarna voeg 20 µL van bindende buffer in de buis, en plaats het op het ijs. De uiteindelijke concentratie van ORC-Qdot705 is ongeveer 10 nM.</li>
	<li>Voeg 2 µL van ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL van DTT (100 mM), 1 µL van ATP (200 mM) in 96 µL van bindende buffer. De uiteindelijke concentratie van ORC-Qdot705 is 0,2 nM.</li>
	<li>Pomp 20 µL van 0,2 nM ORC-Qdot705 debiet van 10 µL/min in de cel van de stroom. Spoelen van buitensporige ORC-Qdot705 met behulp van 200 µL van bindende buffer tegen het tarief van 100 µL/min. Vervolgens pomp bindende buffer met 30 nM SYTOX oranje in de cel van de stroom aan de vlekken van DNA substraten met een snelheid van 100 µL/min.</li>
	<li>Wekken van het signaal van de705 ORC-Qdot en SYTOX oranje gekleurd DNA signaal met een 405 nm laser en 532 nm laser, respectievelijk. Observeren van de signalen gelijktijdig met 100 µL/min stroom met behulp van een Quad-band bandfilter filter (FF01-446/510/581/703-25) en het opnemen van de beelden door EM-CCD met 100 ms per frame. 20 afbeeldingsstapels verzamelen uit verschillende velden.</li>
</ol>6. de gegevensanalyse
<ol><li>Gewas de beelden met behulp van de Fiji-software met een nieuwe plugin, die door onszelf wordt gewijzigd op basis van de Image-plugin (OI_cut_RGBmerge), ontwikkeld door Dr. Ron Vale de lab aan de Universiteit van Californië, San Francisco.<ol>
<li>Het bijsnijden van een stapel van beelden (512 × 512 pixels) in twee stapels van beelden (256 × 256 pixels). Een is een 532 nm laser spannend resultaat, en anderzijds een 405 nm laser spannend resultaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>61 opeenvolgende afbeeldingen met behulp van Fiji-beeld-Stacks-Z project (gemiddelde intensiteit) verwerken.</li>
	<li>De lengte van DNA (LDNA) en de afstand vanaf de site van ORC-Qdot705 (LORC) bindt DNA tot het DNA dat de maatregel vastgebonden einde handmatig.</li>
	<li>Het resultaat van LORC/lDNA berekenen met behulp van excel, analyseren van de gegevens met behulp van de bootstrap methode door R, dan maken van het histogram en passen Gaussian distributies.</li>
</ol>

<ol><li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots%3A+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62(2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li>
<li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li>
<li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li>
<li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).</li>
<li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation%3A+origin+specificity%2C+licensing%2C+and+firing+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li>
<li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li>
<li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095927317301020">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li>
<li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li>
<li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+%CE%BB+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li>
<li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+modification+of+%CE%BB-DNA+substrates+for+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een protocol om te zien hoe de interactie tussen het eiwit Qdot-label en het DNA van de site-specifically gemodificeerde λ met behulp van de TIRFM in een flow-cel. De noodzakelijke stappen omvatten site-specific wijziging van DNA substraat, DNA biotinylation dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, stroom-cel voorbereiding en single-molecuul imaging. Er zijn twee cruciale aandachtspunten die dient te worden opgemerkt. Ten eerste, al de stappen met λ DNA moeten zachtjes worden gemanipuleerd om ...

Interacties tussen eiwitten en DNA zijn essentieel voor vele complexe biologische processen, zoals DNA-replicatie, DNA-reparatie en transcriptie. Hoewel conventionele benaderingen licht op de eigenschappen van deze processen werpen hebben, zijn vele belangrijke mechanismen zijn nog onduidelijk. Onlangs, met de zich snel ontwikkelende enkel molecuul technieken, sommige van de mechanismen zijn geadresseerd1,2,3.
De toepassing van single-molecuul fluorescentie microscopie op het visualiseren van eiwit-DNA interacties in real-time voornamelijk hangt af van de ontwikkeling van fluorescentie detectie en fluorescerende sondes. Voor de studie van een enkel molecuul is het belangrijk om de proteïne van belang van een label met een geschikt fluorescente sonde aangezien fluorescentie detectiesystemen meestal commercieel beschikbaar zijn.
Fluorescerende eiwitten worden vaak gebruikt in moleculaire biologie. Echter beperken de lage fluorescerende helderheid en stabiliteit tegen photobleaching de toepassing ervan in veel enkel molecuul testen. Quantumdots (Qdots) zijn kleine lichtgevende nanodeeltjes4. Vanwege hun unieke optische eigenschappen, Qdots zijn 10 - 20 keer helderder en verscheidene duizend keer meer stabiel dan de gebruikte organische kleurstoffen5. Bovendien hebben de Qdots een grote Stokes shift (het verschil tussen de positie van excitatie en emissie pieken)5. Dus, is dat de Qdots kan worden gebruikt voor lange tijd waarneming (minuten tot uren) en verwerving van beelden met hoge signaal-ruis verhoudingen, terwijl ze kunnen niet worden gebruikt in de kwantitatieve tests.
Tot op heden zijn er twee benaderingen van label een doel eiwit met Qdots site-specifically: labelen met behulp van Qdot-geconjugeerde primaire of secundaire antilichamen6,7,8; of het doel-eiwit met Qdots direct, dat is gebaseerd op de sterke wisselwerking tussen Biotine en daar9,10,11,12,13te labelen. Daar beklede Qdots zijn commercieel verkrijgbaar. In onze recente studie site-specifically biotinyleerd eiwitten in de ontluikende gist met hoge efficiëntie werden gezuiverd door co-overexpressie van BirA en Avi-gelabelde proteïnen in vivo10. Door het volgende en het optimaliseren van de single-molecuul testen14,15,16,17, nageleefd wij de interacties tussen Qdot-geëtiketteerden eiwitten en DNA op de enkel molecuul niveau met behulp van TIRFM10.
Hier, we kiezen de ontluikende gist oorsprong erkenning complexe (ORC), die kan worden specifiek herkend en binden aan de autonoom replicerende volgorde (ARS), als onze proteïne van belang. Het volgende protocol presenteert een stapsgewijze procedure voor het visualiseren van de interactie van Qdot-label ORC met ARS met behulp van TIRFM. De voorbereiding van het site-specifically gemodificeerde DNA substraat, de biotinylation van DNA, het dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, de vergadering van de stroom-cel en de single-molecuul beeldvorming worden beschreven.

<table><tbody><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>Bewaar 25 &mu;L aliquoten bij -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>XhoI enzym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Quick-fusion klonering kit</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda Verpakking Extracten</td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>Bacterie strain LE392MP is inbegrepen in dit pakket.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10013092</td><td>Elke merk is acceptabel.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Elke merk is acceptabel.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Elke merk is acceptabel.</td></tr><tr><td>NZ-amine</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Casamino zuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Magneet roer apparaat</td><td>IKA</td><td>KMO2 basic</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Eppendorf buis</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td>15 mL, steriele, bulk, 500st</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylerde primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reactie Buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Kalium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80120891</td><td>zwavelzuur</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011218</td><td>30% Waterstofperoxide</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG (methoxy-polyethyleenglycol)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotin-PEG (biotin-polyethyleenglycol)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum droogkast</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum sealer</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Diamant-tipped glazen schraper</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Glijplaat</td><td>Sail Brand</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Inlaat slang</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td></tr><tr><td>Uitlaat slang</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td></tr><tr><td>Dubbelzijdig plakband</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>vijf minuten epoxy</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie Microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Infusie/terugtrekking programmeerbare pomp</td><td>Harvard apparatus</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging splitsingsoptiek</td><td>Hamamatsu photonics K.K.</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF verlichtingssysteem</td><td>Olympus</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60&times;TIRF objectief</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Quad-edge laser dichroic beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/ 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Quad-band bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/ 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emissieflitser</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Emissieflitser</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck fluorescentie, microscoop test slide #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Streptavidin Conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Bewaar bij 4 &ordm;C, niet bevriezen.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>Bereidt 200 mM ATP oplossing, gebruik ddH2O, pas pH aan tot 7.0, en bewaar 10 &mu;L aliquoten bij -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>Bereidt 1 M oplossing met behulp van ddH2O, en bewaar 10 &mu;l aliquoten bij -20 &ordm;C.</td></tr></tbody></table>

visualiseren van de interactie tussen het eiwit qdot-label en site-specifically gemodificeerde λ dna op het niveau van één molecuul

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

De fluorescentie microscopie heeft grote bijdragen geleverd in de ontrafeling van de mechanismen van complexe biologische processen op het niveau van één molecuul. In één molecuul testen voor de studie van DNA-eiwit interactie, zijn er twee belangrijke factoren ter overweging: de DNA-substraat met voldoende lengte voor gemakkelijk waarneming en labelen van een eiwit met een geschikt fluorescente sonde. 48.5 kb λ DNA is een goede kandidaat voor de DNA-substraat. Quantumdots (Qdots), toestaan als een klasse van fluorescerende sondes, dat lange tijd observatie (minuten tot uren) en kwalitatief hoogwaardige Beeldacquisitie. In deze paper presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interacties op het niveau van de single-molecuul, waarin de voorbereiding van een site-specifically gemodificeerde λ DNA en labelen van een target eiwit met streptavidine beklede Qdots. Voor een proof of concept, wij kiezen voor ORC (oorsprong erkenning complexe) in ontluikende gist als een proteïne van belang en visualiseren de wisselwerking daarvan met een ARS (autonoom replicerende sequence) met behulp van TIRFM. Vergeleken met andere tl sondes, Qdots hebben duidelijke voordelen in één molecuul studies als gevolg van de hoge stabiliteit tegen photobleaching, maar hierbij moet worden opgemerkt dat deze eigenschap de toepassing ervan in kwantitatieve tests beperkt.

Om te visualiseren de interactie tussen Qdot-geëtiketteerden ORC en de ARS, gebouwd we eerst de λ-ARS317 DNA substraat. Een fragment van DNA met ARS317 werd geïntegreerd in Xhoik (33,5 kb) site van inheemse λ DNA door homologe recombinatie (figuur 1A). De recombinatie product is verpakt met behulp van extracten en de verpakte phage deeltjes werden gekweekt op LB platen (figuur 1B). De positieve faag plaquette werd gescre...

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.

Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen op het gebied van beeldvorming van enkele moleculen van DNA-eiwitinteracties zoals DNA-replicatie, genherstel en het behoud van de chromosoomstructuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat men gemodificeerd lambda-DNA met hoog collageen kan verkrijgen en vervolgens snel de gelabelde eiwitten kan verwijderen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het assembleren van de flow cell moeilijk te leren zijn.Om de dekvlakjes schoon te maken, plaatst u 20 dekvlakjes in vier bekleedpotjes, giet er ethanol in en soniceer gedurende 30 minuten in ethanol. Spoel de dekvlakjes vervolgens drie keer met ultrapuur water. Soniceer de dekvlakjes vervolgens met één molaar kaliumhydroxide gedurende 30 minuten en spoel de dekvlakjes drie keer met ultrapuur water.Herhaal vervolgens de ethanol en kaliumhydroxide sonicatie eenmaal. Soniceer de dekvlakjes met aceton gedurende 30 minuten en spoel ze vervolgens grondig met ultrapuur water. Plaats de dekvlakjes nu in Piranha-oplossing en incubeer gedurende één uur bij 95 graden Celsius.Na incubatie spoelt u de dekvlakjes vijf keer met ultrapuur wate

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een nieuwe en krachtige integratie van nanofotonica (QD-FRET) en microfluidics tot de vorming van polyelektrolyt polyplexes, die naar verwachting een betere controle en de synthese van een uniforme en aanpasbare polyplexes voor toekomstige op nucleïnezuur gebaseerde therapieën te onderzoeken.

De combinatie van QD-FRET en Microfluidics aan DNA Nanocomplex zelf-assemblage Monitor in Real-Time

This video describes a method to visualize the assembly of fusion protein condensates on DNA molecules at specific loci using single-molecule imaging. These condensates are formed due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, which allow for the recruitment of RNA polymerase II and enhanced gene transcription.

Single-Molecule Imaging to Visualize Fusion Protein Condensates Assembly on DNA Curtains

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

We bieden gedetailleerde instructies voor de bereiding van monovalente gerichte quantum dots (mQD's) van fosforothioaat-DNA van gedefinieerde lengte. DNA-wikkeling vindt plaats met een hoge opbrengst en daarom hoeven de producten niet gezuiverd te worden. We demonstreren het gebruik van de SNAP-tag om mQD's te richten op celoppervlaktereceptoren voor live-celbeeldvormingstoepassingen.

Productie en Targeting van Monovalent Quantum Dots

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Met behulp van kwantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kunnen we het reactiemechanisme van restrictie-endonucleasen onderzoeken met behulp van niet-gelabeld eiwit. Deze techniek met één molecuul maakt massaal gemultiplexte observatie van individuele eiwit-DNA-interacties mogelijk, en gegevens kunnen worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren.

Single-molecule dwell-time analyse van restrictie endonuclease-gemedieerde DNA-splitsing

Dit protocol demonstreert het uitvoeren van een single-molecule assay voor live visualisatie van DNA-afwikkeling door CMG helicase. Het beschrijft (1) het prepareren van een DNA-substraat, (2) het zuiveren van fluorescerend gelabelde Drosophila melanogaster CMG-helicase, (3) het voorbereiden van een microfluïdische flowcel voor totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie, en (4) de single-molecule DNA-afwikkeltest.

Real-time visualisatie van DNA met één molecuul door CMG Helicase

Leer DNA-eiwitinteracties bestuderen met TIRFM-microscopie en quantum dot-labeling op enkelmoleculair niveau. Deze methode helpt onderzoekers bij inzicht in DNA-replicatie en genreparatie.

Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul (Video) | JoVE Journal

Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul

Meer video's verkennen