Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul
July 17th, 2018
Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen op het gebied van beeldvorming van enkele moleculen van DNA-eiwitinteracties zoals DNA-replicatie, genherstel en het behoud van de chromosoomstructuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat men gemodificeerd lambda-DNA met hoog collageen kan verkrijgen en vervolgens snel de gelabelde eiwitten kan verwijderen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het assembleren van de flow cell moeilijk te leren zijn.
Om de dekvlakjes schoon te maken, plaatst u 20 dekvlakjes in vier bekleedpotjes, giet er ethanol in en soniceer gedurende 30 minuten in ethanol. Spoel de dekvlakjes vervolgens drie keer met ultrapuur water. Soniceer de dekvlakjes vervolgens met één molaar kaliumhydroxide gedurende 30 minuten en spoel de dekvlakjes drie keer met ultrapuur water.
Herhaal vervolgens de ethanol en kaliumhydroxide sonicatie eenmaal. Soniceer de dekvlakjes met aceton gedurende 30 minuten en spoel ze vervolgens grondig met ultrapuur water. Plaats de dekvlakjes nu in Piranha-oplossing en incubeer gedurende één uur bij 95 graden Celsius.
Na incubatie spoelt u de dekvlakjes vijf keer met ultrapuur water. Spoel vervolgens elk dekvlakje uitgebreid met ultrapuur water. Gebruik papier om het dekvlakje vanaf de rand te drogen en plaats het dekvlakje in een bekleedpotje.
Droog het dekvlakje grondig in een oven van 110 graden Celsius. Spoel het dekvlakje vervolgens met methanol en plaats het bekleedpotje terug in de oven van 110 graden Celsius om het dekvlakje te drogen. Om het dekvlakje te functionaliseren, voegt u 70 milliliter Silaan-oplossing toe aan elk potje, schroef de dop erop en laat het potje een nacht op kamertemperatuur staan.
Was de dekvlakjes met behulp van drie bekers gevuld met ultrapuur water. Droog de dekvlakjes grondig met stikstofgas. Los 150 milligram methoxy-PEG en zes milligram biotin-PEG op in één milliliter vers bereide 0,1 molare natriumbicarbonaat.
Centrifugeer gedurende één minuut bij 17.000 keer g om onoplosbare PEG's te verwijderen. Pipetteer nu 100 microliter PEG-oplossing op het midden van het silaniseerde dekvlakje en plaats een ander silaniseerde dekvlakje er bovenop. Incubeer de dekvlakjes met PEG-oplossing gedurende minimaal drie uur in het donker.
Scheid de paar dekvlakjes en houd het gefunctionaliseerde oppervlak met de bovenkant naar boven. Spoel de dekvlakjes grondig met ultrapuur water en droog ze met stikstofgas. Markeer nu de gefunctionaliseerde zijde van de dekvlakjes op een van de hoeken met een markeerstift.
Plaats één dekvlakje in een 50 milliliter buisje met een gat in het deksel. Plaats het buisje in een plastic zak, verzegel de zak met een vacuümsealer en bewaar het bij min 20 graden Celsius. Om de flow cell te assembleren, snijdt u een kanaal in het midden van een stuk dubbelzijdig plakband met behulp van een pons.
Pel de papierzijde van het dubbelzijdig plakband eraf en plak deze op een glazen zijde met twee gaten. Het is gemakkelijker om luchtbellen te verwijderen door de papierzijde eraf te pellen in plaats van de plastic zijde van het dubbelzijdig plakband. Druk op de tape om luchtbellen te verwijderen.
Snij vervolgens een gefunctionaliseerd dekvlakje in vier stukken met behulp van een diamantstift en verwijder het puin met behulp van stikstofgas waarbij u de gefunctionaliseerde zijde naar boven houdt. Pel de plastic zijde van het dubbelzijdig plakband eraf en plak de schuif op het gefunctionaliseerde dekvlakje. Druk voorzichtig om luchtbellen tussen het dekvlakje en de tape te verwijderen.
Het grondig verwijderen van luchtbellen kan de flow cell beschermen tegen lekken terwijl buffers erin worden gepompt. Plaats nu de inlaatslang in het kleine gat en de uitlaatslang in het grote gat. Bevestig de slangen met epoxy.
Pomp handmatig 20 microliter 0,2 milligram per milliliter Streptavidin in de flow cell met behulp van een spuit en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Pomp vervolgens blokkeringsbuffer in de flow cell om Streptavidin te vervangen en houd het op kamertemperatuur. Verkrijg de focale uitlijning van rood en ver verwijderd rood met A5 op de testslide van de fluorescentiemicroscoop nummer één door gelijktijdige excitatie met behulp van een 532 nanometer laser en een 640 nanometer laser.
Maak afbeeldingen met dubbele golflengte met behulp van splitsingsoptiek. Plaats de flow cell op de microscoop en verbind de uitlaatslang met een langere slang die is verbonden met een 10 milliliter veer geïnstalleerd op een geautomatiseerde infuus-terugtrekprogramma pomp. Verwijder luchtbellen in de flow cell door blokkeringsbuffer te injecteren en de uitlaatslang om te draaien.
Voeg 0,5 microliter gebiotinyleerd lambda-ARS317 DNA toe aan 80 microliter blokkeringsbuffer. Pomp het bereide mengsel in de flow cell bij 25 microliter per minuut gedurende twee minuten. Spoel vervolgens het lambda-ARS317 DNA uit met 200 microliter blokkeringsbuffer met een snelheid van 50 microliter per minuut.
Pomp nu 200 microliter bindingsbuffer met een snelheid van 50 microliter per minuut om de blokkeringsbuffer in de flow cell te verwijderen. Voeg vervolgens twee microliter ORC-Qdot705, één microliter DTT en één microliter ATP toe aan 96 microliter bindingsbuffer. De uiteindelijke concentratie van ORC-Qdot705 is 0,2 nanomolair.
Na het pompen van de bindingsbuffer zoals beschreven in het tekstprotocol, pompt u 20 microliter van de bereide ORC-Qdot705-oplossing met een snelheid van 10 microliter per minuut in de flow cell. Spoel overtollig ORC-Qdot705 uit met 200 microliter bindingsbuffer met een snelheid van 100 microliter per minuut. Pomp vervolgens bindingsbuffer met 30 nanomolair SYTOX Orange in de flow cell om DNA-substraten te kleuren met een snelheid van 100 microliter per
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM). De methode maakt gebruik van een op een specifieke locatie gemodificeerde λ DNA-substraat en Quantum-dot gelabelde eiwitten om beeldvorming van enkele moleculen mogelijk te maken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Moleculair biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van DNA-eiwitinteracties is cruciaal voor inzichten in DNA-replicatie en genherstel.
- Technieken voor beeldvorming van enkele moleculen geven gedetailleerde informatie over moleculaire dynamica.
- Het protocol beoogt de assemblage van flow cells voor TIRFM te vereenvoudigen.
- Visuele demonstraties verbeteren het leren en de toepassing van de methode.
Doel van studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties.
- Om het begrip van moleculaire mechanismen in chromosoomstructuuronderhoud te verbeteren.
- Om onderzoek naar technieken voor beeldvorming van enkele moleculen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van gemodificeerde λ DNA-substraten.
- Labeling van eiwitten met Quantum dots.
- Assemblage van flow cells voor TIRFM-beeldvorming.
- Schoonmaken en voorbereiden van dekglasjes voor optimale beeldvormingsomstandigheden.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt effectieve visualisatie van DNA-eiwitinteracties mogelijk.
- Toonde succesvolle beeldvorming van gelabelde eiwitten die interageren met DNA.
- Biedt een stapsgewijze handleiding om veelvoorkomende uitdagingen bij de assemblage van flow cells te overwinnen.
- Benadrukt het belang van reinigingsprocedures voor dekglasjes.
Conclusies
- Deze methode verbetert de studie van DNA-eiwitinteracties.
- Het dient als een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers in de moleculaire biologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitbreiden naar verschillende aspecten van genetisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-molecule visualization of DNA-protein interactions using Qdot-labeled proteins and site-specifically modified λ DNA enables direct interrogation of molecular mechanisms underlying replication and repair. This approach enhances predictive confidence in target validation by providing high-resolution, quantitative insights into binding events and spatial localization. The method supports early discovery inflection points where mechanistic de-risking and functional validation are critical for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein-DNA binding specificity and localization at the single-molecule level.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying functional engagement of candidate targets.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of replication and repair pathways relevant to disease models.
- Provides foundational data for triaging targets based on real-time molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-molecule imaging systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, high-stability fluorescent labeling with Qdots for extended observation windows.
- Enables quantitative measurement of binding events, supporting assay standardization and scalability.
- Prepares robust platforms for evaluating compound effects on DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanistic findings with disease-relevant DNA replication and repair processes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling detailed molecular characterization.
- Reduces translational risk by providing direct evidence of target engagement and functional relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target validation and assay development phases.
- Discovery Biology: Provides high-resolution visualization for hypothesis testing and pathway clarification in DNA-protein interaction studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables statistical comparison of binding distributions and localization patterns across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to disease-relevant systems by modeling replication and repair events in vitro.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable to diverse protein-DNA interaction studies across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows with robust, photostable Qdot labeling and reproducible flow cell assembly.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of molecular interactions and target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy and flow cell assembly.
- Demands access to TIRFM instrumentation and high-sensitivity EMCCD imaging systems.
- Necessitates rigorous cleaning and functionalization protocols for coverslips to ensure reproducibility.
- Adaptation to other protein-DNA systems may require optimization of labeling and buffer conditions.
- Qdot photostability limits application in quantitative assays requiring dynamic intensity measurements.
