Name: Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Leer LAM-PCR voor nauwkeurige lokalisatie van virale vectorintegratie in het genoom. Deze methode verbetert de biosafety en efficiëntie van gentherapie door exacte integratieposities te onthullen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering werd verzorgd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, subsidie van het Tumor Center Heidelberg/Mannheim), door het Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), door het VIe en VIIe Kaderprogramma van de Europese Commissie (CONSERT, CLINIGENE en PERSIST). We danken Ina Kutschera voor het demonstreren van de protocoltechniek in de video.

1. Bereiding van Linker Cassettes (LC) <ol><li> Meng 40 pl LC1 oligonucleotide (tabel 1), 40 pl LC2 oligonucleotide (tabel 1, met de juiste restrictie-enzym overhang), 110 pl Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) en 10 pi 250 mM MgCl2. </li><li> Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten en laat het reactiemengsel langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 300 ul H2O en concentreer dsLinker-DNA op een centrifugatie filter. Voeg 80 ui H2O het eluaat en 10 pi aliquot van bereide linker cassette 0,2 PCR buizen. </li></ol> 2. Preamplification van Vector Genome Knooppunten <ol><li> Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie. <ol><li> Bepaal de concentratie van de DNA-monsters. Pipet x pi (1-1,000 ng voor LAM/100-1, 000 ng voor nrLAM) van DNA in een 0,2 ml PCR-buis. Volume van DNA moet gelijk zijn in elk monster en in de liep zijnge van 0,5 tot 25 ul. </li><li> Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 2 Mix (50 - x). Ul van de master mix met elk DNA-monster in 0,2 ml PCR-buisjes. </li></ol></li><li> Preamplify vector genoom juncties middels PCR-omstandigheden toegelicht in Tabel 2. Na voltooiing van PCR wordt 0,5 ul Taq Polymerase aan elke PCR buis en herhaling PCR-programma. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C. </li></ol> 3. Magnetische scheiding van PCR Product <ol><li> Bereiding van Magnetic Beads <ol><li> Pipetteer 20 ul (200 ug) van streptavidine beklede magnetische kralen in een 1,5 ml buis en blootgesteld gedurende 1 minuut op de magnetische deeltjesscheider (MPS) bij kamertemperatuur. Gooi supernatant. </li><li> Verwijder buis MPS en resuspendeer magnetische kralen in 40 ul PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Herhaal eenmaal deze stap. </li><li> Wassen kralen wie 20 pl 3 M LiCl oplossing (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) bloot aan MPS gedurende 1 min en gooi supernatant. Resuspendeer kralen in 50 gl 6 M LiCl oplossing (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). </li></ol></li><li> Meng gehele PCR-reactie van stap 2.2 met 50 ul van vervaardigde magnetische kralen. Incubeer op een horizontaal schudapparaat (300 rpm) ten minste 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Deze stap maakt binding van gebiotinyleerd PCR-product beklede parels (DNA-Bead complex) streptavidine. DNA parelcomplex kan worden overnacht geïncubeerd op het schudapparaat of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen. </li><li> Expose DNA-Bead complex MPS gedurende 1 min bij kamertemperatuur verwijderd supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 pi H2O Onmiddellijk verder met stap 4 voor LAM of stap 5 voor nrLAM. </li></ol> 4. LAM-Procedure <ol><li> Dubbele streng DNA (dsDNA) Synthese (LAM alleen) <ol><li> Expose DNA-Bead complex van stap 3.3 tot MPS gedurende 1 minuut en diskaart supernatant. Voeg 8,25 ui H2O, 1 pl 10x hexa-buffer, 0,25 pl dNTPs (10 mM) en 0,5 pl (2 U) Klenow polymerase. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 90 ui H2O en blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut. Gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 ul H 2 O. </li></ol></li><li> Beperking Digest <ol><li> Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 8,5 ul H2O, 1 pi 10x restrictie-enzym buffer en 0,5 ul van restrictie-enzym en incubeer reactie gedurende 1 uur. Herhaal stap 4.1.2. OPMERKING: Incubeer reactie bij de temperatuur door de fabrikant van het restrictie-enzym. Zorg ervoor dat er geen beperking plaats aanwezig binnen of stroomafwaarts van de primer bindingsplaats voor voorversterking in het DNA van belang. Voor de keuze van geschikte restrictie-enzymen / restrictie-enzym combinaties verwijzen naar 9. </li></ol></li><li> Ligatie van ds Linker (LK) <ol><li> Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 5 ul H 2 O, 1 ui 10x FastLink buffer, 1 ui ATP (10 mM), 2 pi Linker cassette uit stap 1.2, en 1 ui Fast-Link DNA ligase (2 U / pl). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal stap 4.1.2. </li></ol></li><li> Denaturatie van Gesynthetiseerde dsDNA <ol><li> Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Resuspendeer DNA-Bead complex in 5 pi 0,1 N NaOH. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur op een horizontale schudinrichting. </li><li> Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en verzamel voorversterkte vector-genoom knooppunt bevattende supernatant in nieuwe 1,5 ml buis. Onmiddellijk verder met stap 6 of winkel supernatant bij -20 ° C. </li></ol></li></ol> 5. NrLAM-Procedure <ol><li> Ligatie van enkelstrengs linker (SSLC) (nrLAM alleen) <ol><li> Expose DNA-Bead complex van stap 3.3 tot MPSgedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 6,5 ul H2O, 1 pi 10x CircLigase Reaction Buffer, 0,5 pl MnCl2 (50 mM), 0,5 ui ATP (1 mM), 1 ui ssLinker oligonucleotide en 0,5 pl CircLigase (100 U / pl). Incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 90 ui H2O en blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut. Verwijder supernatant en was DNA-Bead complex in 100 pi H2O Opnieuw blootstellen aan MPS 1 min, gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 10 ui H2O </li></ol></li></ol> 6. Exponentiële Amplification I <ol><li> Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie. <ol><li> Pipetteer 2 pi template DNA (uit stap 4.4.2 (LAM) of 5.1.2 (nrLAM)) in een 0,2 ml PCR-buis. </li><li> Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 3. Voeg 48 ul van master mix aan elk monster uit stap 6.1.1 en versterken vector genoom kruispunten door PCR conditions geïllustreerd in Tabel 3. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C. </li></ol></li></ol> 7. Magnetische scheiding van PCR Product <ol><li> Bereid magnetische korrels zoals toegelicht in stap 3.1.1 - 3.1.3. Resuspendeer kralen in 20 pl (voor LAM) en 50 pl (voor nrLAM) van 6 M LiCl oplossing (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Meng 20 pl (LAM) en 50 pl (nrLAM) PCR-reactie uit stap 6.1.2 met vervaardigde magnetische beads (stap 7.1) en incubeer op een horizontaal schudapparaat (300 rpm) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. DNA parelcomplex kan worden overnacht geïncubeerd op het schudapparaat of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen. </li><li> Expose DNA-Bead complex MPS gedurende 1 min, verwijder supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 pi H2O Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. </li><li> Resuspendeer DNA-Bead complex in 20 pi (LAM) of 5 pl (nrLAM) 0,1 N NaOH. Incuverminder gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een horizontaal schudapparaat, blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut en laat geamplificeerd DNA supernatant nieuwe 1,5 ml buisje. Onmiddellijk verder met stap 8.1 of winkel supernatant bij -20 ° C. </li></ol> 8. Exponentiële Amplification II <ol><li> Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie. <ol><li> Pipetteer 2 pl matrijs-DNA (uit stap 7.3) in een 0,2 ml PCR buis. </li><li> Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 4. Voeg 48 ul van master mix aan elk monster uit stap 8.1.1 en versterken vector genoom splitsingen PCR-omstandigheden toegelicht in Tabel 4. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Visualiseren (nr) LAM-PCR-producten, belasting 10 ul van het PCR-product uit stap 8.1.2 op een 2% agarosegel. Als banden zijn zichtbaar, analyseren 10 ul van de LAM-PCR-product op hoge-resolutie gel. LET OP: Ethidium bromide is mutageen. Werken zeer zorgvuldig en altijd de juiste handschoenen te dragen. </li></ol> 9. Voorbereiding voor high-throughput sequencing <ol><li> Zuivering van (nr) LAM-PCR-producten <ol><li> Meng 40 pi PCR-product van stap 8.1.2 met 44 ul van kamertemperatuur AMPure XP Magnetic Beads. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur en bloot MPS extra 2 minuten. </li><li> Het supernatans en tweemaal wassen met 200 ul 70% EtOH het MPS. </li><li> Gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 30 pi H 2 O. Incubeer 1 min en overdracht supernatant in de frisse 0,2 ml buis. Bepaal de concentratie van gezuiverd DNA. </li></ol></li><li> Fusionprimer PCR om sequencing specifieke adapters toevoegen. <ol><li> Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie. </li><li> Pipet x pi (40 ng) van DNA in een 0,2 ml PCR-buis. Omvang van DNA moet gelijk in elk monster en in het traject van 0,5 tot 25 pi zijn. </li><li> Bereid PCR master mix zoals beschreven in tabel 5 plaatsen (50 - x). Gl master mix aan elk monster uit stap 9.2.2 sequentiebepaling adapters introduceren (nr) LAM-PCR producten van PCR-omstandigheden toegelicht in tabel 5 PCR producten. kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C. </li><li> Om Fusionprimer-PCR producten load visualiseren 10 ul van het PCR-product uit stap 9.2.3 op een 2% agarosegel. Zuiver resterende PCR-product zoals beschreven in stap 9.1.1 - 9.1.3. Analyseer 1 ui gezuiverd PCR product uit stap 9.4 op een geautomatiseerde high-resolution elektroforeseapparaat exact te kwantificeren concentratie en fragment grootte van Fusionprimer-PCR-producten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+direct+genomic+sequencing+of+multiple+rare+unknown+flanking+DNA+in+highly+complex+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples.</a> Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).</li>
<li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+%28LAM-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).</li>
<li>Schroeder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li>
<li>Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+start+regions+in+the+human+genome+are+favored+targets+for+MLV+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration.</a> Science. 300, 1749-1751 (2003).</li>
<li>Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+physical+properties+of+DNA+affecting+target+site+selection+of+sleeping+beauty+and+other+Tc1%2Fmariner+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements.</a> J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).</li>
<li>Lewinski, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+viral+and+cellular+determinants+of+target-site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection.</a> PLoS Pathog. 2, (2006).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+footprinting+of+a+muscle+specific+enhancer+by+ligation+mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).</li>
<li>Harkey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiarm+high-throughput+integration+site+detection%3A+limitations+of+LAM-PCR+technology+and+optimization+for+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis.</a> Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).</li>
<li>Wang, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bar+coding+and+pyrosequencing+to+analyze+adverse+events+in+therapeutic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer.</a> Nucleic acids research. 36, (2008).</li>
<li>Paruzynski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+high-throughput+integrome+analyses+by+nrLAM-PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing.</a> Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMO2-associated+clonal+T+cell+proliferation+in+two+patients+after+gene+therapy+for+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1.</a> Science. 302, 415-419 (2003).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).</li>
<li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326, 818-823 (2009).</li>
<li>Matrai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-targeted+expression+by+integrase-defective+lentiviral+vectors+induces+antigen-specific+tolerance+in+mice+with+low+genotoxic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk.</a> Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).</li>
<li>Penaud-Budloo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+genomes+persist+as+episomal+chromatin+in+primate+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle.</a> Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).</li>
<li>Kaeppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+largely+random+AAV+integration+profile+after+LPLD+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy.</a> Nature medicine. 19, 889-891 (2013).</li>
<li>Voigt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+sleeping+beauty+transposon+insertions+by+engineered+zinc+finger+DNA-binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains.</a> Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).</li>
<li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nature medicine. 12, 348-353 (2006).</li>
<li>Boztug, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-Cell+Gene+Therapy+for+the+Wiskott-Aldrich+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome.</a> N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Deichmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+integration+is+nonrandom+and+clustered+and+influences+the+fate+of+lymphopoiesis+in+SCID-X1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy.</a> J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).</li>
<li>Schwarzwaelder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaretrovirus-mediated+correction+of+SCID-X1+is+associated+with+skewed+vector+integration+site+distribution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo.</a> J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+genome-wide+analysis+of+zinc-finger+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).</li>
<li>Dieter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+types+of+tumor-initiating+cells+form+human+colon+cancer+tumors+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases.</a> Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).</li>
<li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).</li>
<li>Zavidij, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+blood+formation+by+stem+cells+in+murine+steady-state+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis.</a> Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).</li>
<li>Martins, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-autonomous+T+cell+development+in+the+absence+of+progenitor+import%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import.</a> J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).</li>
<li>Arens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+clonality+analysis+of+next-generation+sequencing-derived+viral+vector+integration+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het LAM-PCR-techniek maakt het identificeren van onbekende DNA-sequenties die een bekende DNA regio flankeren. Vanwege de hoge gevoeligheid gevolg van voorversterking van de verbindingen met specifieke primers hybridiseren bij de bekende DNA-sequentie, is het mogelijk amplificeren en detecteren zelfs zeldzame verbindingen naar de enkele cel. Integendeel, een polyklonaal situatie LAM-PCR kan duizenden verschillende knooppunten amplificeren in een enkele reactie. Echter, door het gebruik van r...

Lineaire amplificatie-gemedieerde PCR (LAM-PCR) kan identificeren en karakteriseren onbekende flankerende DNA grenzend aan bekende DNA van elke oorsprong. Meer specifiek heeft LAM-PCR ontwikkeld om virale vector integratielocaties lokaliseren (IS) binnen het gastheergenoom 1,2. Genetische elementen zoals retrovirussen of transposons integreren hun genoom in het genoom van de gastheer in een (semi-) willekeurige wijze 3-6. In veel gevallen is beslissend precies de positie waar deze vectoren geïntegreerd kennen. LAM-PCR is bewezen superieur aan andere technieken zoals ligatie-gemedieerde PCR 7 en varianten of inverse PCR 8 zijn. De gevoeligheid en robuustheid van deze werkwijze ontstaat omdat de eerste voorversterking van het vector-genoom kruispunten en magnetische selectie van geamplificeerde PCR producten. Zoals de alternatieve methoden vermeld, LAM-PCR is gebaseerd op het gebruik van restrictie-enzymen, een voorspanning introduceren in het ophalen aantal IS 9-11. Aldusslechts een subset van de IS repertoire (de integrome) kan worden gedetecteerd in een reactie. Deze voorspanning wordt geminimaliseerd door de parallelle analyse van een monster met behulp van optimale combinaties van restrictie-enzymen 9. Onlangs, een variant van de technologie genoemd niet-beperkende LAM-PCR (nrLAM-PCR) ontwikkeld dat het gebruik van restrictie-enzymen omzeilt en maakt onpartijdige genoom-brede analyse van een monster in een enkele reactie 9,12. In het verleden, is LAM-PCR gebruikt om identificatie van de veroorzakende retrovirale geeft aanleiding tot leukemie bij enkele patiënten in klinische proeven voor gentherapie 13-15. Sindsdien is LAM-PCR aangepast identificeren IS van andere integrerende vectoren (lentivirale vectoren, transposons) en ook integratiepatronen passief integrerende vectoren zoals adeno-geassocieerde vectoren (AAV) of integrase-defecte lentivirale vectoren (IDLV) identificeren 16 -21. Toepassingen van LAM-PCR zijn wijd verspreid: traditionelely, de techniek wordt veel gebruikt om de klonale samenstelling van genetisch gemodificeerde cellen te bestuderen bij patiënten die gentherapie hebben ondergaan of om de bioveiligheid van nieuwe vector systemen te beoordelen door het ontrafelen van hun integratie gedrag 15,16,22-24. Onlangs, LAM-PCR ingeschakeld bepalen specificiteit en off-target activiteit van designer nucleases door een IDLV vangen test 25. Bovendien LAM-PCR laat toe om gemakkelijk volgen het lot van een getransduceerde cel na verloop van tijd in een organisme. Dit maakt proto-oncogenen en tumorsuppressor genen en om hematopoiese of kanker stamcel biologie 26-28 bestuderen. Tenslotte, LAM-PCR aangepast aan T-cel receptor diversiteit studie in mensen 29 (en ongepubliceerde gegevens). De intrinsieke kracht van de technologie wordt nog versterkt door het koppelen van de methode om diepe sequencing technologieën die het mogelijk maken het karakteriseren miljoenen onbekende flankerende DNA met single nucleotide rRESOLUTIE geheel genomen. In het volgende protocol beschrijven we stap voor stap de versterking en de identificatie van flankerende onbekende DNA voorbeeldig te identificeren lentivirale vector IS. Oligonucleotiden die in het protocol zijn opgesomd in tabel 1. Geëxtraheerde DNA of cDNA van elke bron kan worden gebruikt als DNA-matrijs voor LAM-PCR en nrLAM-PCR.

<table><tbody><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3001.5000</td><td>Alternatieve Taq-polymerasen kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>PCR Buffer</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td>Gebruik van deze buffer wordt aanbevolen</td></tr><tr><td>dNTP-Mengsel</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3015.4020</td><td>of enige andere dNTP's</td></tr><tr><td>Oligonucleotiden (Primers)</td><td>MWG Biotech</td><td></td><td>HPLC-gezuiverd</td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-086</td><td>0,1% wt/vol BSA</td></tr><tr><td>6 M LiCl</td><td>Roth</td><td>3739.1</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,5</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>22637</td><td>of enige andere leverancier</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A1103,0250</td><td>of enige andere leverancier</td></tr><tr><td>Klenow Polymerase</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104523001</td><td></td></tr><tr><td>Hexanucleotide mengsel</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Restrictieneuklease</td><td>NEB</td><td></td><td>of enige andere leverancier</td></tr><tr><td>Fast-Link DNA ligatiekit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>LK11025</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase ssDNA Ligase Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CL4111K</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>of enige andere leverancier</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11685660001</td><td>of enige andere leverancier</td></tr><tr><td>TBE buffer</td><td>Amresco</td><td>0658</td><td>of enige andere leverancier</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Applichem</td><td>A2273,0005</td><td>Ethidiumbromide is mutageen</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td>of enige andere DNA ladder</td></tr><tr><td>20 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71393-1L</td><td>of enige andere leverancier</td></tr><tr><td>Magna-Sep Magnetische Deeltjes Separator&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>K158501</td><td>voor gebruik met 1,5 ml buisjes</td></tr><tr><td>Magna-Sep Magnetische Deeltjes Separator</td><td>Life Technologies</td><td>K158696</td><td>voor gebruik met 96-well platen</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membraan</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>PerfectBlue Gelsystem Midi S</td><td>PeqLab</td><td>40-1515</td><td>of ander elektroforese systeem&nbsp;</td></tr><tr><td>TProfessional 96</td><td>Biometra</td><td>050-551</td><td>of andere Thermocycler voor 96-well platen</td></tr><tr><td>Orbital shaker KS 260 basic</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td>of andere horizontale shaker</td></tr><tr><td>PCR softtubes 0,2 ml</td><td>Biozym Scientific GmbH</td><td>711082</td><td>of andere 0,2 ml PCR-buisjes</td></tr><tr><td>1,5 ml buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>12682</td><td>of andere 1,5 ml buisjes</td></tr><tr><td>Gel documentatie systeem</td><td>PeqLab</td><td></td><td>of enige andere gel documentatie systeem</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000 spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Spreadex EL1200 voorgevormd gel</td><td>Elchrom Scientific</td><td>3497</td><td></td></tr><tr><td>Gesubmergeerde gelelektroforese apparaat SEA 2000&nbsp;</td><td>Elchrom Scientific</td><td>2001E</td><td></td></tr><tr><td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr></tbody></table>

lineaire versterking mediated pcr - lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van onbekende flankerend dna

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Lineaire-amplificatie gemedieerde PCR (LAM-PCR) is ontwikkeld om hematopoëse te bestuderen in gengecorrigeerde cellen van patiënten die behandeld zijn met gentherapie met integrerende vectorsystemen. Vanwege de stabiele integratie van retrovirale vectoren, kunnen integratieplaatsen worden gebruikt om het clonale lot van individuele cellen en hun nakomelingen te bestuderen. LAM-PCR leverde voor het eerst bewijs dat leukemie bij patiënten die met gentherapie zijn behandeld, ontstond door provirus geïnduceerde overexpressie van een naburig proto-oncogen. De hoge gevoeligheid en specificiteit van LAM-PCR vergeleken met bestaande methoden zoals inverse PCR en ligatie-gemedieerde (LM)-PCR wordt bereikt door een initiële pre-amplificatiestap (lineaire PCR van 100 cycli) met behulp van biotinylerde vectorspecifieke primers die toekomstige reactiestappen mogelijk maken op vaste fase (magnetische kralen). LAM-PCR is momenteel de meest gevoelige methode die beschikbaar is om onbekend DNA te identificeren dat zich in de nabijheid van bekend DNA bevindt. Onlangs is een variant van LAM-PCR ontwikkeld die restrictiedigestie omzeilt, waardoor de ophaalbias van integratieplaatsen wordt afgeschaft en een uitgebreide analyse van proviruslocaties in gastheergenomen mogelijk wordt. Het volgende protocol legt stap voor stap uit hoe beide 3’- en 5’-sequenties aangrenzend aan de geïntegreerde lentivirale vector worden geamplificeerd.

LAM-PCR resulteert in amplificatie van vector genoom kruispunten met een bepaald fragment grootte voor elke kruising. De afzonderlijke PCR-fragmenten afhankelijk van de afstand tussen de locatie van de bekende DNA in het genoom en de dichtstbijzijnde restrictie-enzym herkenningsplaats. Dit maakt het visualiseren van de diversiteit van geamplificeerde verbindingen in monsters geanalyseerd door gelelektroforese zoals. Als eenmalig (monoklonale), verscheidene (oligoclonale), of meervoudige (polyklonale) groepen aa...

Lineaire amplificatie-gemedieerde (LAM)-PCR is een methode ontwikkeld om de exacte positie van integratie virale vectoren in het genoom te identificeren. De techniek heeft zich ontwikkeld tot de superieure methode om klonale dynamiek in gentherapie patiënten, bioveiligheid van nieuwe vector technologieën, diversiteit T-cel, kanker stamcellen modellen, enz. te bestuderen

Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de exacte posities van geïntegreerde virale vectoren in het genoom te identificeren. Dit wordt bereikt door een initiële lineaire PCR-reactie met gebiotineerde primers om vector-genoomovergangsequenties uit genomisch DNA op een vaste fase in een reeks reacties te verrijken; hierbij worden dubbelstrengs DNA-fragmenten gegenereerd met bekende DNA-sequenties aan beide uiteinden van het product, wat exponentiële amplificatie van de vector-genoomovergangen mogelijk maakt. Vervolgens worden sequencing-adapters ingebouwd in de LAM-PCR-producten.Om het onbekende flankerende DNA via deep sequencing te sequensen en te karakteriseren, onthullen deze fragmenten de exacte posities van de vectorintegraties. Het resultaat is een diversiteit aan geamplificeerde juncties, zoals weergegeven via gelelectroforese. Deze methode biedt inzicht in de distributie van integratieplaatsen van virale vectoren bij patiënten in klinische gentherapie.Het kan ook worden toegepast op andere studies, zoals insertionele mutagenese-screens, virusinfecties, kanker, en stamcelclonaliteit of T-celdiversiteit. De procedure zal worden gedemonstreerd door een RA, een techn

linear-amplification-mediated-pcr-localization-genetic-elements

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genetische associaties blijven vaak onverklaarbare op een functioneel niveau. Deze methode heeft tot doel het effect van de fenotype-geassocieerde genetische markers te beoordelen op gen-expressie door het analyseren van cellen heterozygoot voor getranscribeerd SNPs. De technologie maakt het mogelijk nauwkeurig te meten door middel van MALDI-TOF massaspectrometrie om allel-specifieke primer extension producten te kwantificeren.

Een allel-specifieke genexpressie Assay aan de functionele basis van genetische associaties Test

De bijbehorende chromosoom val (ACT) assay is een nieuwe onpartijdige methode voor het identificeren van lange-afstands-DNA interacties. De karakterisering van de lange reeks DNA-interacties zal ons toelaten om de relatie van de nucleaire architectuur vast te stellen om genexpressie in zowel de normale fysiologie en in zieke staten.

Associated Chromosoom Trap voor het vaststellen van lange afstand DNA-interacties

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

This video describes BiFC-PALM ― a combination of photoactivated localization microscopy and bimolecular fluorescence complementation ― to assess protein-protein interactions. BiFC involves the fusion of two fluorescent protein fragments with two interacting proteins of interest. When the two proteins interact, the fragments are brought into proximity, which allows the two parts to come together and reconstitute a functional fluorescent protein. The fluorescence of a single fluorophore is...

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Hier beschrijven we een optimale en efficiënte verwijdering strategie voor het verzamelen van onderhavige bio-deeltjes "raken DNA" monsters, tezamen met een verbeterde amplificatieprotocol waarbij in één stap 5 gl micro-volume lysis / STR amplificatie, het herstel van mogelijk short tandem repeat (STR) profielen van de bio-deeltje donor (en).

Verbeterde Genetische analyse van Single Human Bioparticles Hersteld door vereenvoudigd Micromanipulatie uit Forensisch &#39;Touch-DNA&#39; Evidence

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Hier, werd de kracht van een transposon-gemedieerde willekeurige invoeging van een niet-coderende DNA element gebruikt om op te lossen zijn optimale chromosomale positie.

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

We klonen en analyseren reporter genen die circulaire RNA's genereren. Deze reporter genen zijn groter dan constructies om lineaire splicing te analyseren en Alu-elementen bevatten. Om de cirkelvormige RNAs te onderzoeken, worden de constructies omgezet in cellen en wordt resulterend RNA geanalyseerd met behulp van RT-PCR na verwijdering van lineair RNA.

Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren

Leer LAM-PCR voor nauwkeurige lokalisatie van virale vectorintegratie in het genoom. Deze methode verbetert de biosafety en efficiëntie van gentherapie door exacte integratieposities te onthullen.

Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA

Meer video's verkennen