Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA
25 juni 2014
Lineaire amplificatie-gemedieerde (LAM)-PCR is een methode ontwikkeld om de exacte positie van integratie virale vectoren in het genoom te identificeren. De techniek heeft zich ontwikkeld tot de superieure methode om klonale dynamiek in gentherapie patiënten, bioveiligheid van nieuwe vector technologieën, diversiteit T-cel, kanker stamcellen modellen, enz. te bestuderen
Het algemene doel van het volgende experiment is om de exacte posities van integrerende virale vectoren in het genoom te identificeren. Dit wordt bereikt door een initiële lineaire PCR-reactie met gebiotineerde primers om vector-genoomverbindingssequenties uit genomisch DNA op vaste fase te verrijken in een reeks reacties, dubbelstrengs DNA met bekende DNA-sequenties aan beide uiteinden van het product wordt gegenereerd, wat exponentiële amplificatie van vector-genoomverbindingen mogelijk maakt. Vervolgens worden sequencing adapters ingebouwd om PCR-producten te lammen.
Om de onbekende flankerende DNA met diepe sequencing te sequencen en te karakteriseren, onthullen deze fragmenten de exacte posities van vectorintegraties. Het resultaat is een diversiteit aan geamplificeerde verbindingen zoals bekeken door gelelektroforese. Deze methode biedt inzicht in de distributie van virale vectorintegratieplaatsen bij klinische gentherapiepatiënten.
Het kan ook worden toegepast op andere studies zoals insertional, mutagenese, screenings, virusinfectie, kanker en stamcelclonaliciteit of T-celdiversiteit. De procedure zal worden gedemonstreerd door ina RA, een technicus uit mijn laboratorium Voor deze procedure, bereidt u eerst de linker cassettes mix 40 microliter van elk van de twee LCO Legos met 110 microliter tris hydrochloride en 10 microliter magnesiumchloride in een microcentrifugebuisje. Zet vervolgens het mengsel gedurende vijf minuten in een 95 graden Celsius hitteblok en laat het vervolgens langzaam afkoelen tot kamertemperatuur overnacht.
De volgende dag, voeg 300 microliter water toe aan het voorbereide dubbelstrengs linker, DNA en filter ze over een microcentrifugebuisje. Spuit het filter naar beneden om het geconcentreerde linker DNA in de ouit te verzamelen. Herstel vervolgens de ouit van het filter.
Voeg 80 microliter water toe aan de ouit en pipetteer. 10 microliter aliquoten in PCR-buisjes. Gebruik PCR om de vector-genoomverbindingen in 50 microliter reactiebuisjes voor lammen vooraf te amplificeren.
Voeg tussen een nanogram en een microgram monster-DNA per 50 microliter reactie toe. Voor NR lammen, gebruik minimaal 100 nanogram DNA. Voeg niet meer dan 25 microliter toe om de PCR uit te voeren volgens tabel twee in de tekst.
En wanneer voltooid, voeg een extra 0,5 microliter tech toe aan elke reactie en voer het PCR-programma een tweede keer uit. Bereid eerst de magnetische kralen voor. Voeg 20 microliter van strept ENC gecoate magnetische kralen toe aan een 1,5 milliliter buisje en plaats ze gedurende één minuut op de magnetische kralenscheider bij kamertemperatuur.
Gooi vervolgens het supernatant weg. Suspendeer de kralen in 40 microliter PBS met BSA en plaats de kralen weer op de scheider gedurende nog een minuut. Vervang het supernatant met een 20 microliter wassing van drie molar lithiumchloride-oplossing.
En plaats de kralen weer op de scheider gedurende een minuut. Voltooi door het supernatant te vervangen door 50 microliter zes molar lithiumchloride-oplossing. Voeg nu het magnetische kralenmengsel toe aan het product van de PCR-reactie en laat dit mengsel gedurende twee uur tot een nacht incuberen bij kamertemperatuur met zacht schudden.
De gebiotineerde DNA en strip tava en gecoate kralen zullen complexen vormen die tot vier dagen bij vier graden Celsius kunnen worden bewaard. Ga verder met lammen of NR lammen Vanwege zijn hoge gevoeligheid. L-A-M-P-C-R is vatbaar voor besmetting als het aandachtig wordt uitgevoerd.
Dat is een PCR-kwaliteits omgeving. En speciale aandacht voor de reinheid is van het grootste belang. Om het onbekende flankerende DNA succesvol te amplificeren zonder de monsters te besmetten, stel de complexen eerst gedurende een minuut bloot aan de scheider en suspendeer de DNA-kralen opnieuw in 100 microliter water.
Blootstel vervolgens de complexen gedurende een minuut aan de scheider. En suspendeer deze keer de DNA-kralencomplexen in een mengsel met 8,25 microliter water. Eén microliter van HEXA nucleotide buffer, een kwart microliter van D DN NTPs en een halve microliter van cano polymerase.
Incubeer dit mengsel gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 90 microliter water toe en stel de reactie gedurende nog een minuut bloot aan de scheider. Resuspendeer vervolgens de DNA-kralencomplexen in een 100 microliter wassing van water.
Gebruik de scheider gedurende nog een minuut en bereid de restrictie-enzymreactie voor. Na het verwijderen van het supernatant. Voeg 8,5 microliter water toe, een microliter restrictie-enzym buffer en een halve microliter van het restrictie-enzym.
Bij het selecteren van het restrictie-enzym, zorg ervoor dat het geen sites heeft in of stroomafwaarts van de primaire bindingsplaats die wordt gebruikt in de preem-amplificatiereactie. Nadat de enzymen een uur bij de ideale temperatuur hebben gereageerd, voegt u 90 microliter water toe. Gebruik een scheider gedurende een minuut en suspendeer de BDNA-complexen in een wassing van 100 microliter water.
Herhaal de scheiding en bereid de ligatiereactie voor. Voeg aan de kralen vijf microliter water toe, een microliter van 10 x fast link buffer. Eén microliter van een TP een microliter van fast link DNA ligase en een microliter van de linker cassette die aan het begin van de procedure is gemaakt.
Laat deze reactie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur lopen. Beëindig de reactie door 90 microliter water toe te voegen en de kralen te scheiden, gevolgd door een wassing in 100 microliter water. En dan nog een scheiding om het gesynthetiseerde DNA te denatureren, suspendeer de kralen opnieuw in vijf microliter 0,1 normaal natriumhydroxide en laat het mengsel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur schudden.
Scheiden vervolgens de complexen gedurende een minuut en verzamel de SUP natin, die de preem-versterkte vector-genoomverbinding bevat. Ga onmiddellijk verder met de exponentiële amplificatie of bewaar bij minuus 20 graden Celsius. Begin met het blootstellen van de complexen aan de scheider gedurende een minuut.
En suspendeer de DNA-kralen opnieuw in 100 microliter water. En scheid ze opnieuw en verwijder het supernatant. Voor de ligatiereactie, voeg 6,5 microliter water toe, een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is een techniek die is ontworpen om de exacte locaties van integrerende virale vectoren binnen het genoom te lokaliseren. Deze methode is essentieel geworden voor het bestuderen van clonale dynamica in gentherapie, bioveiligheid van vectortechnologieën, T-cel diversiteit en kanker stamcelmodellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Gentherapie
- Integratie van virale vectoren
- Clonale dynamica
Achtergrond
- Het identificeren van integratieplaatsen van virale vectoren is cruciaal voor het begrijpen van de resultaten van gentherapie.
- Traditionele methoden bieden mogelijk niet de precisie die nodig is voor dergelijke studies.
- LAM-PCR biedt een verfijnde benadering om de nauwkeurigheid van integratieplaatsenkaart te verbeteren.
- Deze techniek heeft toepassingen in verschillende gebieden, inclusief kankeronderzoek en immunologie.
Doel van het onderzoek
- Om de posities van integrerende virale vectoren in het genoom nauwkeurig te identificeren.
- Om het begrip van de verdeling van integratieplaatsen van vectoren in klinische omgevingen te verbeteren.
- Om inzichten te bieden in de dynamica van gentherapie en de effecten ervan op patiëntresultaten.
Gebruikte methoden
- Initiële lineaire PCR-reactie met gebiotineerde primers.
- Verrijking van vectorgenoomjunctiesequenties uit genomisch DNA.
- Generatie van dubbelstrengs DNA met bekende sequenties voor amplificatie.
- Incorporatie van sequencingadapters voor diep sequencing van PCR-producten.
Belangrijkste resultaten
- Diversiteit van geamplificeerde juncties waargenomen door middel van gelelektroforese.
- Exacte posities van vectorintegraties in het genoom onthuld.
- Inzichten geboden in de verdeling van virale vectorintegratieplaatsen.
- Bijgedragen aan het begrijpen van de implicaties voor gentherapiepatiënten.
Conclusies
- LAM-PCR is een superieure methode voor het bestuderen van virale vectorintegratie.
- Deze techniek verbetert het begrip van clonale dynamica in gentherapie.
- Het biedt waardevolle inzichten voor het verbeteren van de bioveiligheid en werkzaamheid van vectortechnologieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) enables precise localization of integrating viral vectors within host genomes, directly supporting biosafety and clonal tracking in gene therapy R&D. Its high sensitivity and specificity provide critical predictive confidence for vector integration site analysis, impacting both early discovery and translational decision points. This capability is essential for risk-adjusted advancement and portfolio triage in gene and cell therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mapping of vector integration sites to clarify insertional mutagenesis risks.
- Supports functional validation of gene transfer events in disease-relevant systems.
- Facilitates mechanistic de-risking by identifying proto-oncogene activation events.
- Provides high-resolution data for target confidence in gene therapy vectors.
Screening & Assay Development
- Prepares validated genomic junction libraries for downstream sequencing workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for integration site mapping assays.
- Enables scalable screening of clonal diversity and insertional profiles.
- Supports standardization of integration site analysis across vector platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns integration site data with preclinical biosafety and efficacy models.
- Enables continuity from discovery through clinical vector safety assessment.
- Supports translational biomarker development for clonal tracking in patients.
- Provides mechanistic insights into vector-induced oncogenesis for regulatory submissions.
Pipeline & Workflow Integration
LAM-PCR is positioned from early discovery through translational research, bridging vector design, biosafety assessment, and clinical monitoring in gene therapy pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vector integration patterns and proto-oncogene activation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative integration site data for assay development.
- Analytics: Provides high-resolution mapping and statistical outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Enables preclinical-to-clinical continuity in integration site safety monitoring.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for integration site analysis across multiple gene therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vector safety and clonal fate mapping.
- Operational Value: Standardizes integration site analysis with high sensitivity and specificity.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk and informs go/no-go decisions for vector candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene therapy assets based on integration profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and PCR-based genomic analysis.
- Demands access to high-quality sequencing and magnetic bead-based enrichment infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to minimize contamination and ensure reproducibility.
- Adaptable to various vector systems and model organisms with protocol optimization.
- Contamination risk and technical complexity require strict procedural controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Preamplifying the Vector Genome Junctions
3:19
Magnetic Separation of the PCR Products
4:39
LAM PCR Preparation
7:39
Non-restrictive LAM PCR Preparation
8:38
Exponential Amplifications and Product Clean-Up
10:41
Electrophoresis Analysis and Vector Insertion Site Analysis
11:26
Conclusion
