Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA

Het algemene doel van het volgende experiment is om de exacte posities van geïntegreerde virale vectoren in het genoom te identificeren. Dit wordt bereikt door een initiële lineaire PCR-reactie met gebiotineerde primers om vector-genoomovergangsequenties uit genomisch DNA op een vaste fase in een reeks reacties te verrijken; hierbij worden dubbelstrengs DNA-fragmenten gegenereerd met bekende DNA-sequenties aan beide uiteinden van het product, wat exponentiële amplificatie van de vector-genoomovergangen mogelijk maakt. Vervolgens worden sequencing-adapters ingebouwd in de LAM-PCR-producten.

Om het onbekende flankerende DNA via deep sequencing te sequensen en te karakteriseren, onthullen deze fragmenten de exacte posities van de vectorintegraties. Het resultaat is een diversiteit aan geamplificeerde juncties, zoals weergegeven via gelelectroforese. Deze methode biedt inzicht in de distributie van integratieplaatsen van virale vectoren bij patiënten in klinische gentherapie.

Het kan ook worden toegepast op andere studies, zoals insertionele mutagenese-screens, virusinfecties, kanker, en stamcelclonaliteit of T-celdiversiteit. De procedure zal worden gedemonstreerd door een RA, een technicus uit mijn laboratorium. Bereid voor deze procedure eerst de linker-cassettes voor: meng 40 µL van elk van de twee LCO Legos met 110 µL tris-hydrochloride en 10 µL magnesiumchloride in een microcentrifugebuisje. Laat het mengsel vervolgens vijf minuten incuberen op een warmteblok van 95 °C en laat het daarna gedurende de nacht langzaam afkoelen tot kamertemperatuur.

Voeg de volgende dag 300 microliter water toe aan de voorbereide dubbelstrengse linker-DNA en filtreer deze via een microcentrifugebuisje. Centrifugeer het filter om het geconcentreerde linker-DNA in de buis op te vangen. Herstel vervolgens de buis uit het filter.

Voeg 80 µL water toe aan de output en pipetteer aliquots van 10 µL in PCR-buisjes. Gebruik PCR om de vectorgenoomovergangen voor te amplificeren in reactiebuisjes van 50 µL voor lamb.

Voeg tussen één nanogram en één microgram monster-DNA toe per reactie van 50 microliter. Gebruik voor NR-lamten minstens 100 nanogram DNA. Voeg niet meer dan 25 microliter toe; voer de PCR uit volgens tabel twee in de tekst.

Wanneer dit voltooid is, voeg dan nog 0,5 µL tech toe aan elke reactie en voer het PCR-programma voor een tweede maal uit. Bereid eerst de magnetische korrels voor. Voeg 20 µL strept ENC-gecoate magnetische korrels toe aan een 1,5 mL buis en plaats deze gedurende één minuut bij kamertemperatuur op de scheider voor magnetische korrels.

Verwijder vervolgens de bovenstaande supernatant. Suspendeer de beads in 40 µL PBS met BSA en plaats de beads opnieuw op de separator voor nog een minuut. Vervang de supernatant door een wasstap van 20 µL drie molar lithiumchloride-oplossing.

Plaats de beads vervolgens opnieuw gedurende één minuut op de separator. Sluit af door het supernatant te vervangen door 50 µL van een zes molar lithiumchloride-oplossing. Voeg nu de magnetic bead-mix toe aan het product van de PCR-reactie en laat dit mengsel twee uur tot overnacht incuberen bij kamertemperatuur onder matig schudden.

Het gebiotineerde DNA en de strip-tava en gecoate beads zullen complexen vormen die tot vier dagen bij vier graden Celsius bewaard kunnen worden. Ga verder met lamb of NR lamb. Vanwege de hoge gevoeligheid is L-A-M-P-C-R gevoelig voor contaminatie als het onvoorzichtig wordt uitgevoerd.

Dit is een PCR-grade omgeving. Hierbij is speciale aandacht voor hygiëne van het grootste belang. Om het onbekende flankerende DNA succesvol te amplificeren zonder de monsters te contamineren, worden de complexen eerst een minuut lang blootgesteld aan de separator, waarna de DNA-beads worden resuspenderd in 100 µL water.

Stel de complexen vervolgens gedurende één minuut bloot aan de separator. Resuspendeer de DNA-beadcomplexen deze keer in een mengsel met 8,25 µL water, 1 µL HEXA-nucleotidebuffer, 0,25 µL D DN NTP's en 0,5 µL cano-polymerase.

Incubeer dit mengsel gedurende een uur bij 37 °C. Voeg vervolgens 90 µL water toe en stel de reactie nog een minuut lang bloot aan de separator. Resuspendeer daarna de DNA-beadcomplexen in een wasstap van 100 µL water.

Gebruik de separator nog een minuut en bereid de restrictie-enzymreactie voor. Voeg, na het verwijderen van het supernatant, 8,5 µL water, 1 µL restrictie-enzymbuffer en 0,5 µL restrictie-enzym toe.

Controleer bij de selectie van het restrictie-enzym of er geen herkenningsplaatsen aanwezig zijn in of stroomafwaarts van de primaire bindingsplaats die wordt gebruikt in de preem-amplificatiereactie. Nadat de enzymen een uur hebben kunnen reageren bij de optimale temperatuur, voegt u 90 µL water toe. Gebruik gedurende één minuut een separator en resuspendeer de BDNA-complexen in een wasstap met 100 µL water.

Herhaal de scheiding en bereid de ligatiereactie voor. Voeg aan de beads vijf microliters water, één microliter 10 x fast link buffer, één microliter van een TP, één microliter fast link DNA ligase en één microliter van de linker-cassette toe die aan het begin van de procedure is gemaakt.

Laat deze reactie vijf minuten duren bij kamertemperatuur. Beëindig de reactie door 90 µL water toe te voegen en de beads te scheiden, gevolgd door een wasstap in 100 µL water. Voer vervolgens opnieuw een scheiding uit om het gesynthetiseerde DNA te denatureren; resuspendeer de beads in vijf µL 0,1 normaal natriumhydroxide en laat het mengsel vijf minuten schudden bij kamertemperatuur.

Scheid vervolgens de complexen gedurende één minuut en verzamel het supernatant, dat de vooraf geamplificeerde vectorgenoomovergang bevat. Ga direct over tot de exponentiële amplificatie of bewaar het bij -20 °C. Begin met het blootstellen van de complexen aan de separator gedurende één minuut.

Resuspendeer de DNA-beads in 100 µL water. Scheid ze vervolgens opnieuw en verwijder het supernatant. Voeg voor de ligatiereactie 6,5 µL water, 1 µL circ Ligase en 10 x reactiebuffer toe.

Een halve microliter magnesiumchloride, een halve microliter TP, één microliter SS-linker-oligo's en een halve microliter cir-ligase. Beëindig na een uur bij 60 °C de reactie met 90 microliter water; gebruik de bead-separator om de beads te resuspenderen in nog eens 100 microliter water, gebruik de separator opnieuw en verzamel de wascomplexen in 10 microliter water. Begin met het bereiden van een PCR-mastermix zoals beschreven in tabel drie van de tekst.

Voeg 48 µL mastermix toe aan twee µL lam- of NR-lamproducten in 200 µL PCR-buisjes en voer de PCR uit zoals beschreven in de tekst; bereid vervolgens meer streptavidine-beads voor en resuspendeer deze in 6 M lithiumchloride. Gebruik 20 µL voor lam of 50 µL voor NR-lam. Voeg daarna de beads toe aan hetzelfde volume PCR-reactieproducten en incubeer deze op een schudplaat bij 300 RPM gedurende twee uur tot overnacht bij kamertemperatuur, verzamel het DNA-beadcomplex en was dit met 100 µL water zoals eerder gedemonstreerd.

Suspendeer het complex nu in 0,1 normaal natriumhydroxide en incubeer de kraaltjes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat. Stel de kraaltjes vervolgens gedurende een minuut bloot aan de separator en verzamel het supernatant met het geamplificeerde DNA in een nieuwe buis. Gebruik het geamplificeerde DNA als template; gebruik hiervan 2 µL om een PCR uit te voeren zoals beschreven in tabel vier van de tekst.

Visualiseer de producten via gelelektroforese om de producten te zuiveren. Meng 40 µL hiervan met 44 µL am pure XP magnetische beads op kamertemperatuur en laat dit vijf minuten incuberen. Scheid vervolgens de beads gedurende twee minuten met de magneet.

Verwijder het supernatant, was de beads tweemaal met 200 µL 70% ethanol en resuspendeer de beads vervolgens in 30 µL water met 40 ng DNAA fusieprimer. PCR kan worden gebruikt om sequencing-specifieke adapters toe te voegen. De details hiervan zijn opgenomen in tabel vijf.

Controleer de producten op een gel. Het visualiseren van de resultaten van de lamb PCR via hoge-resolutie gelelektroforese is de beste keuze voor diagnostische analyse door middel van vergelijking. Hoewel 2% agarose ook werkt, is dit minder effectief.

De clonaliteit van NR LAMB-PCR-producten kan niet visueel worden gediagnosticeerd. Een 2% agarosegel is echter uitstekend geschikt om het succes van het protocol te bepalen. Na sequencing van de PCR-producten kan de locatie van de vectoren in het genoom van de gastheer worden bepaald.

Op basis van deze gegevens is het mogelijk om, na de ontwikkeling, de locaties van de insertieplaatsen in coderende regio's en nabij transcriptiestartplaatsen vast te leggen. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van gentherapie om de biosafety van gentransfervectoren te onderzoeken, zowel in preklinische modellen als in klinische gentherapiestudies.