Een volgende generatie Tissue microarray (ngTMA) Protocol voor Biomarker Studies
September 23rd, 2014
Het protocol is gericht op het optimaliseren van de bouw en de kwaliteit van het weefsel microarrays voor biomarker onderzoek. Het omvat aspecten van de planning en het ontwerp, digitale pathologie, virtuele dia annotatie, en geautomatiseerde weefsel arraying.
Het doel van de volgende procedure is om optimale of gerichte weefsel-microarrays te construeren voor later gebruik in biomarkeronderzoek. Eerst wordt een digitaal dia-archief gegenereerd van representatieve weefseldia's. Histologische gebieden van belang worden op de digitale dia's geannoteerd om de exacte regio's van de corresponderende donorblokken te specificeren die naar de weefselmicroarray-blok moeten worden overgebracht.
Nadat het weefsel-microarray-ontwerp en de lay-outs zijn gemaakt, worden de donorblokken automatisch geponst en worden de blokken geladen in de weefsel-microarrays. Met behulp van deze nauwkeurige, snelle en geautomatiseerde next-generation-aanpak kunnen nauwkeurige histologische gebieden of zelfs specifieke groepen cellen nauwkeurig worden vastgelegd en overgebracht naar een weefsel-microarray. Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van bestaande methoden van weefsel-microring, zoals het gebruik van een zelfgemaakte of semi-automatische inrichting, is duidelijk de histologische nauwkeurigheid.
Dit wordt bereikt door de sterke punten van digitale pathologie te combineren met histologische expertise en ook geautomatiseerde weefsel-microring die de procedure vandaag demonstreren zijn Kalin Hamman en Jose Galvan. Twee technische assistentie van ons lab Gebruik de scansoftware. Selecteer eerst de automatische modus voor brightfield-scanning.
Klik vervolgens op scanopties om de diakwaliteitsparameters aan te passen. Kies nu om de dia-scans lokaal op te slaan of op het web en werk af door op serverparameters te klikken en de scanbestemming in te stellen naar het case center. Bereid nu de dia's voor voordat u de dia's in het tijdschrift laadt. Controleer voor de scanner of de dia's schoon zijn.
Indien nodig kunt u ze schoonmaken. Er kunnen maximaal 25 dia's in elk tijdschrift worden geladen en de scanner kan worden geladen met maximaal 10 tijdschriften. Meerdere tijdschriften worden gestapeld wanneer ze worden geladen. Zodra de dia's zijn geladen, geef alle dia's, bestandsnamen en stel de opslagmap in het case center in.
Start nu met het scannen van de dia door op de groene pijl te klikken. In deze sectie worden de locaties waaruit weefselmonsters op de dia worden geponst ingesteld door annotaties op de digitale dia. Begin met het openen van de digitale dia-map.
In de weergavesoftware kunnen wijzigingen worden aangebracht in de map zelf. Notities kunnen worden toegevoegd, de dia's kunnen worden geherrangschikt en gebruikersrechten kunnen worden ingesteld, evenals bijlagen. Begin nu met het annoteren van de dia's door erop te klikken.
Het verschijnt in de viewer. In de viewer. Gebruik de vergrotingstool om de dia te evalueren en de gebieden van belang te vinden voor integratie in de next-generation TMA.
Gebruik de TMA-annotatietool om de grootte van de gewenste core en de kleur van de annotatie te selecteren. Bevestig deze annotatie aan een dia door erop te klikken. Verplaats vervolgens de annotatie naar de gewenste histologische structuren.
Deze annotaties markeren de ponslocaties op het corresponderende weefselblok. Herhaal dit proces totdat alle dia's zijn geannoteerd. Een alternatieve optie voor de weefseloorzaak is om ze naar een PCR-buis van 0,2 milliliter te sturen voor moleculaire analyse.
Annoteer de dia's met een andere kleurenmarkering om deze punten te onderscheiden van die welke de TMA zijn. Nadat alle annotaties zijn gemaakt, slaat u een spreadsheetbestand op dat een lijst bevat van alle dia's met hun bijbehorende annotaties en de annotatieskleuren. Begin met de weefselmicro-reconstructie door de corresponderende paraffineweefselblokken voor alle geannoteerd digitale dia's op te halen, vanaf nu.
Geroep de donorblokken. Sorteer de blokken in dezelfde volgorde als de digitale dia's. Controleer of elke blok minimaal vier millimeter dik is.
Zo niet, het weefsel moet op de computer opnieuw worden uitgevonden. Open de weefselmicroarray van software en geef een naam voor het project. Ga naar de tool-wijziging en selecteer de vereiste gereedschapdiameter.
Laad nu maximaal 12 ontvangende blokken in de machine. Let op de bloknamen. Ze moeten allemaal worden gelabeld met behulp van hetzelfde nummersysteem voor consistentie.
Vervolgens wijst u in de software de juiste naam toe aan elk van de blokken om een TMA-lay-out te maken. Maak eerst een nieuw TMA-ontwerp door het aantal rijen, kolommen, lege regels en de afstand van de ponsen toe te wijzen. Sla de lay-out op en wijs deze toe aan de blok.
Herhaal vervolgens het proces voor de volgende blok. Met een nieuwe lay-out of dezelfde lay-out kunnen de kerngrootten variëren tussen ontvangende blokken. Laad vervolgens maximaal 60 donorblokken in de machine.
Er passen maximaal 10 blokken in elke rij. A tot en met F. Overige donorblokken worden later in de software geladen. Geef elk donorblok een identificerende naam.
Er wordt automatisch een afbeelding van elke blok verkregen. Lijn nu de digitale dia's uit met hun corresponderende donorblokken. Selecteer eerst een blok.
Klik vervolgens op dia en vergelijk de dia- en blokbeelden zij aan zij. Selecteer referentiepunten op het donorblokbeeld die overeenkomen met specifieke punten op de corresponderende digitale dia. Klik vervolgens op volgende en de annotaties verplaatsen zich naar de afbeelding van het donorblok.
Als de annotaties correct zijn, klikt u er elke op om de locatie te bevestigen. Klik vervolgens op start. Dit prompt de microarray om een gat te boren op het referentiepunt in de ontvangende blok, en vervolgens een gat te ponsen vanuit het donorblok op dezelfde locatie en overbrengt de core naar de ontvangende blok.
Om cores te verzamelen naar Een PCR-buis, klikt u op het PCR-gereedschap voor de blok. Er kunnen maximaal vier annotaties worden gebruikt om weefsel naar de buis te leveren. Zodra ze zijn ingesteld, klikt u op start en de donor wordt opgeroepen en de buis wordt geladen.
Nadat de machine de kernen heeft geboord en geponst, werkt u het beeld van het donorblok bij. Ga door met het herhalen van het uitlijnen en annoteren voor de volgende blok. Ponsten dan.
Blijf dit doen voor elke donorblok. Dat zal in de TMA zijn. Wanneer de eerste set van 60 donorblokken is voltooid, ontlast u ze en laadt u er 60
Overzicht
Dit protocol beschrijft de constructie en optimalisatie van weefselmicroarrays voor biomarkeronderzoek. Het integreert digitale pathologie en geautomatiseerde weefselarraying om de histologische nauwkeurigheid te verbeteren.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Biomarkeronderzoek
- Weefselmicroarraytechnologie
- Digitale pathologie
Achtergrond
- Weefselmicroarrays zijn essentieel voor hoogdoorvoerige biomarkeranalyse.
- Digitale dia-archieven vergemakkelijken nauwkeurige annotatie van histologische gebieden.
- Geautomatiseerde processen verbeteren de efficiëntie en nauwkeurigheid bij weefselbemonstering.
- Histologisch expertise is cruciaal voor optimale weefselselectie.
Doel van het onderzoek
- Om gerichte weefselmicroarrays voor biomarkeronderzoek te construeren.
- Om de nauwkeurigheid van weefselbemonstering door automatisering te verbeteren.
- Om het proces van digitale dia-annotatie en weefseloverdracht te stroomlijnen.
Gebruikte methoden
- Creatie van digitale dia-archieven van representatieve weefseldia's.
- Annotatie van histologische interessegebieden op digitale dia's.
- Geautomatiseerd ponsen van donorblokken om weefselmicroarrays te creëren.
- Gebruik van software voor TMA-ontwerp en lay-outbeheer.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle constructie van weefselmicroarrays met hoge histologische nauwkeurigheid.
- Efficiënte overdracht van gerichte weefselmonsters naar ontvangerblokken.
- Verbeterde workflow door automatisering en integratie van digitale pathologie.
- Creatie van een uitgebreid projectgegevensoverzicht voor verdere analyse.
Conclusies
- Het protocol verbetert de kwaliteit van weefselmicroarrays aanzienlijk.
- Het combineren van digitale pathologie met geautomatiseerde technieken levert nauwkeurige resultaten op.
- Deze aanpak is voordeliger dan traditionele methoden van weefselmicroarrayconstructie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Next-generation tissue microarray (ngTMA) technology addresses the critical need for precise, reproducible tissue sampling in biomarker discovery and validation. By integrating digital pathology with automated arraying, ngTMA enhances histological accuracy and throughput, directly supporting target validation and assay development workflows. This approach reduces biological noise in preclinical models, improving predictive confidence in lead identification and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing specific histological regions such as tumor center, invasion front, and metastatic sites for functional target validation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise annotation of tissue zones, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating standardized tissue spots from annotated regions, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated punching and digital slide matching, ensuring consistent sample preparation across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by incorporating multiple tissue types/histological zones (e.g., tumor, lymph node, liver metastases, normal tissue) from patient samples.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by producing multiple ngTMA copies for parallel analysis in immunohistochemistry, in situ hybridization, and special stains.
Pipeline & Workflow Integration
ngTMA integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work by providing quantitative, spatially resolved tissue outputs that support hypothesis testing and pathway clarification.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through precise capture of histological areas of interest via digital annotation.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via automated arraying of annotated regions producing standardized tissue spots.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions through digital slide annotation and project data export for further analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by enabling application of IHC, ISH, and special stains on ngTMAs to assess protein/gene expression across tissue zones.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through the production of multiple ngTMA copies and digital slide archiving for future studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, digital pathology, and tissue microarray design.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including automated tissue arrayer, slide scanner, and web-based annotation platform.
- Cross-team standardization requirements for annotation protocols, block labeling, and data management.
- Adaptation considerations across model systems such as varying tissue types, core sizes, and patient sample volumes.
- Practical limitations supported by source material including annotation time (2-3 min/case), scanning requirements (3 overnight runs for 134 patients), and arraying time (15-20 hr).
