Een volgende generatie Tissue microarray (ngTMA) Protocol voor Biomarker Studies
23 september 2014
Het protocol is gericht op het optimaliseren van de bouw en de kwaliteit van het weefsel microarrays voor biomarker onderzoek. Het omvat aspecten van de planning en het ontwerp, digitale pathologie, virtuele dia annotatie, en geautomatiseerde weefsel arraying.
Het doel van de volgende procedure is om optimale of gerichte weefsel-microarrays te construeren voor later gebruik in biomarkeronderzoek. Eerst wordt een digitaal dia-archief gegenereerd van representatieve weefseldia's. Histologische gebieden van belang worden op de digitale dia's geannoteerd om de exacte regio's van de corresponderende donorblokken te specificeren die naar de weefselmicroarray-blok moeten worden overgebracht.
Nadat het weefsel-microarray-ontwerp en de lay-outs zijn gemaakt, worden de donorblokken automatisch geponst en worden de blokken geladen in de weefsel-microarrays. Met behulp van deze nauwkeurige, snelle en geautomatiseerde next-generation-aanpak kunnen nauwkeurige histologische gebieden of zelfs specifieke groepen cellen nauwkeurig worden vastgelegd en overgebracht naar een weefsel-microarray. Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van bestaande methoden van weefsel-microring, zoals het gebruik van een zelfgemaakte of semi-automatische inrichting, is duidelijk de histologische nauwkeurigheid.
Dit wordt bereikt door de sterke punten van digitale pathologie te combineren met histologische expertise en ook geautomatiseerde weefsel-microring die de procedure vandaag demonstreren zijn Kalin Hamman en Jose Galvan. Twee technische assistentie van ons lab Gebruik de scansoftware. Selecteer eerst de automatische modus voor brightfield-scanning.
Klik vervolgens op scanopties om de diakwaliteitsparameters aan te passen. Kies nu om de dia-scans lokaal op te slaan of op het web en werk af door op serverparameters te klikken en de scanbestemming in te stellen naar het case center. Bereid nu de dia's voor voordat u de dia's in het tijdschrift laadt. Controleer voor de scanner of de dia's schoon zijn.
Indien nodig kunt u ze schoonmaken. Er kunnen maximaal 25 dia's in elk tijdschrift worden geladen en de scanner kan worden geladen met maximaal 10 tijdschriften. Meerdere tijdschriften worden gestapeld wanneer ze worden geladen. Zodra de dia's zijn geladen, geef alle dia's, bestandsnamen en stel de opslagmap in het case center in.
Start nu met het scannen van de dia door op de groene pijl te klikken. In deze sectie worden de locaties waaruit weefselmonsters op de dia worden geponst ingesteld door annotaties op de digitale dia. Begin met het openen van de digitale dia-map.
In de weergavesoftware kunnen wijzigingen worden aangebracht in de map zelf. Notities kunnen worden toegevoegd, de dia's kunnen worden geherrangschikt en gebruikersrechten kunnen worden ingesteld, evenals bijlagen. Begin nu met het annoteren van de dia's door erop te klikken.
Het verschijnt in de viewer. In de viewer. Gebruik de vergrotingstool om de dia te evalueren en de gebieden van belang te vinden voor integratie in de next-generation TMA.
Gebruik de TMA-annotatietool om de grootte van de gewenste core en de kleur van de annotatie te selecteren. Bevestig deze annotatie aan een dia door erop te klikken. Verplaats vervolgens de annotatie naar de gewenste histologische structuren.
Deze annotaties markeren de ponslocaties op het corresponderende weefselblok. Herhaal dit proces totdat alle dia's zijn geannoteerd. Een alternatieve optie voor de weefseloorzaak is om ze naar een PCR-buis van 0,2 milliliter te sturen voor moleculaire analyse.
Annoteer de dia's met een andere kleurenmarkering om deze punten te onderscheiden van die welke de TMA zijn. Nadat alle annotaties zijn gemaakt, slaat u een spreadsheetbestand op dat een lijst bevat van alle dia's met hun bijbehorende annotaties en de annotatieskleuren. Begin met de weefselmicro-reconstructie door de corresponderende paraffineweefselblokken voor alle geannoteerd digitale dia's op te halen, vanaf nu.
Geroep de donorblokken. Sorteer de blokken in dezelfde volgorde als de digitale dia's. Controleer of elke blok minimaal vier millimeter dik is.
Zo niet, het weefsel moet op de computer opnieuw worden uitgevonden. Open de weefselmicroarray van software en geef een naam voor het project. Ga naar de tool-wijziging en selecteer de vereiste gereedschapdiameter.
Laad nu maximaal 12 ontvangende blokken in de machine. Let op de bloknamen. Ze moeten allemaal worden gelabeld met behulp van hetzelfde nummersysteem voor consistentie.
Vervolgens wijst u in de software de juiste naam toe aan elk van de blokken om een TMA-lay-out te maken. Maak eerst een nieuw TMA-ontwerp door het aantal rijen, kolommen, lege regels en de afstand van de ponsen toe te wijzen. Sla de lay-out op en wijs deze toe aan de blok.
Herhaal vervolgens het proces voor de volgende blok. Met een nieuwe lay-out of dezelfde lay-out kunnen de kerngrootten variëren tussen ontvangende blokken. Laad vervolgens maximaal 60 donorblokken in de machine.
Er passen maximaal 10 blokken in elke rij. A tot en met F. Overige donorblokken worden later in de software geladen. Geef elk donorblok een identificerende naam.
Er wordt automatisch een afbeelding van elke blok verkregen. Lijn nu de digitale dia's uit met hun corresponderende donorblokken. Selecteer eerst een blok.
Klik vervolgens op dia en vergelijk de dia- en blokbeelden zij aan zij. Selecteer referentiepunten op het donorblokbeeld die overeenkomen met specifieke punten op de corresponderende digitale dia. Klik vervolgens op volgende en de annotaties verplaatsen zich naar de afbeelding van het donorblok.
Als de annotaties correct zijn, klikt u er elke op om de locatie te bevestigen. Klik vervolgens op start. Dit prompt de microarray om een gat te boren op het referentiepunt in de ontvangende blok, en vervolgens een gat te ponsen vanuit het donorblok op dezelfde locatie en overbrengt de core naar de ontvangende blok.
Om cores te verzamelen naar Een PCR-buis, klikt u op het PCR-gereedschap voor de blok. Er kunnen maximaal vier annotaties worden gebruikt om weefsel naar de buis te leveren. Zodra ze zijn ingesteld, klikt u op start en de donor wordt opgeroepen en de buis wordt geladen.
Nadat de machine de kernen heeft geboord en geponst, werkt u het beeld van het donorblok bij. Ga door met het herhalen van het uitlijnen en annoteren voor de volgende blok. Ponsten dan.
Blijf dit doen voor elke donorblok. Dat zal in de TMA zijn. Wanneer de eerste set van 60 donorblokken is voltooid, ontlast u ze en laadt u er 60
Overzicht
Dit protocol beschrijft de constructie en optimalisatie van weefsel-microarrays voor biomarkeronderzoek. Het integreert digitale pathologie en geautomatiseerde weefselmatrixvorming om de histologische nauwkeurigheid te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomarkeronderzoek
- Tissue microarray-technologie
- Digitale pathologie
Achtergrond
- Tissue microarrays zijn essentieel voor biomarkeranalyse met een hoge doorvoer.
- Digitale slide-archieven vergemakkelijken de nauwkeurige annotatie van histologische gebieden.
- Geautomatiseerde processen verbeteren de efficiëntie en nauwkeurigheid bij het bemonsteren van weefsels.
- Histologische expertise is cruciaal voor een optimale weefselselectie.
Doel van de studie
- Om gerichte weefselmicroarrays te construeren voor biomarkeronderzoek.
- Om de nauwkeurigheid van weefselbemonstering te vergroten door automatisering.
- Om het proces van digitale dia-annotatie en weefseloverdracht te stroomlijnen.
Gebruikte methoden
- Aanmaak van digitale coupesarchieven op basis van representatieve weefselcoupes.
- Annotatie van histologische interessegebieden op digitale coupes.
- Geautomatiseerd ponsen van donorblokken voor het maken van tissue microarrays.
- Gebruik van software voor het ontwerp en lay-outbeheer van TMA's.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle constructie van weefselmicroarrays met een hoge histologische nauwkeurigheid.
- Efficiënte overdracht van gerichte weefselmonsters naar ontvangstblokken.
- Verbeterde workflow door automatisering en integratie van digitale pathologie.
- Creatie van een uitgebreid projectgegevensblad voor verdere analyse.
Conclusies
- Het protocol verbetert de kwaliteit van weefselmicroarrays aanzienlijk.
- De combinatie van digitale pathologie met geautomatiseerde technieken levert nauwkeurige resultaten op.
- Deze benadering is voordelig ten opzichte van traditionele methoden voor de constructie van weefselmicroarrays.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Next-generation tissue microarray (ngTMA)-technologie beantwoordt aan de cruciale behoefte aan precieze, reproduceerbare weefselbemonstering bij de ontdekking en validatie van biomarkers. Door digitale pathologie te integreren met geautomatiseerde array-vorming, verbetert ngTMA de histologische nauwkeurigheid en doorvoersnelheid, wat direct bijdraagt aan workflows voor targetvalidatie en assayontwikkeling. Deze benadering vermindert biologische ruis in preklinische modellen, waardoor het voorspellend vertrouwen bij lead-identificatie en translationele biomarkerstudies wordt vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door specifieke histologische regio's, zoals het tumorcentrum, het invasiefront en metastatische plaatsen, vast te leggen voor functionele targetvalidatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door nauwkeurige annotatie van weefselzones, waardoor mechanische ambiguïteit in studies naar target-engagement wordt verminderd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door gestandaardiseerde weefselstippen te genereren uit geannoteerde regio's, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Pakt de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays aan via geautomatiseerd ponsen en digitale slide-matching, waardoor een consistente monsterpreparatie over verschillende runs wordt gegarandeerd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers door meerdere weefseltypen/histologische zones (bijv. tumor, lymfeklier, levermetastasen, normaal weefsel) uit patiëntmonsters te betrekken.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door meerdere ngTMA-kopieën te produceren voor parallelle analyse via immunohistochemie, in situ hybridisatie en speciale kleuringen.
Pipeline- & Workflowintegratie
ngTMA integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch werk, door kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste weefseloutputs te leveren die hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden ondersteunen.
- Ontdekkingsbiologie: Legt uit hoe de methode hypothesetesten, het verduidelijken van signaalpaden of biologisch risicobeheer ondersteunt door middel van nauwkeurige vastlegging van histologische gebieden van belang via digitale annotatie.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid of kwantitatieve resultaten wanneer dit door het artikel wordt ondersteund via geautomatiseerde arraying van geannoteerde regio's die gestandaardiseerde weefselstippen produceren.
- Analytiek: Benadrukt metingen, read-outs of statistische uitkomsten die teams helpen om condities te vergelijken via digitale slide-annotatie en export van projectgegevens voor verdere analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming, enkel wanneer de bron dit ondersteunt door de toepassing van IHC, ISH en speciale kleuringen op ngTMA's mogelijk te maken om eiwit-/genexpressie in verschillende weefselzones te beoordelen.
- Enterprise-hergebruik: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek door de productie van meerdere ngTMA-kopieën en digitale slide-archivering voor toekomstige studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, target-validatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in histologie, digitale pathologie en het ontwerp van tissue microarrays.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een geautomatiseerde tissue arrayer, een slide scanner en een webgebaseerd annotatieplatform.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor annotatieprotocollen, bloketikettering en databeheer.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, zoals variërende weefseltypes, core-groottes en patiëntenstermonumes.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal, waaronder annotatietijd (2-3 min/geval), scanvereisten (3 overnight runs voor 134 patiënten) en arraying-tijd (15-20 hr).
