Detectie van doelgerichte veranderingen bij niet-kleincellige longkanker met behulp van sequencing van de volgende generatie

Mijn onderzoek ontdekt genetische mutaties bij kanker om de diagnose en behandeling te verbeteren. Om te beginnen registreert u de monsterinformatie in het Laboratory Information Management System en vult u het informed consent-formulier in voor genmutatietests. Met wegwerp-microtome messen werden secties gesneden van de niet-kleincellige longkanker, formeel en vast paraffine-ingebed monster.

Vervolgens voert u routinematige hematoxyline- en eosinekleuring uit om de tumorcelinhoud te evalueren. Voor nucleïnezuurextractie snijd je met een microtoom het formele en vaste paraffine-ingebedde blok om een lint te verkrijgen, en plaats je het lint in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Breng de buis over naar de aangewezen ingangslocatie van het monster op het geautomatiseerde extractie-instrument.

Gebruik vervolgens een automatisch extractie-instrument met een automatische extractiekit. Vervang handmatige pipetstappen door een automatisch magnetisch kralenextractiesysteem. Selecteer vervolgens het C1102-programma op het instrument.

Kies de incubatietijd voor het ontwaxen van het monster als 16 uur en stel het elucian-volume in op 100 microliter. Gebruik spectrofotometrie om de zuiverheid van DNA te verifiëren. Gebruik vervolgens een detectiekit met sequentie-specifieke fluorescerende kleurstoffen om een fluorometrische test uit te voeren voor nauwkeurige DNA-concentratiemeting.

Om gefragmenteerd genomisch DNA met ultrasoon geluid te bereiden, mengt u 200 nanogram genomisch DNA in 50 microliter low tris-EDTA buffer. Plaats het monsterbuisje in een voorgekoeld monsterrek, gehouden op acht graden Celsius. Stel de instrumentparameters in volgens het protocol en start DNA-fragmentatie.

Om geautomatiseerde bibliotheekvoorbereiding te starten, druk je op de aan/uit-knop om het systeem te activeren en wacht je tot de initialisatie voltooid is. Navigeer naar de programma-instelling, selecteer 'run protocol' en kies protocol BurningRock HS. Stel het monstertype in op hoogwaardige DNA, invoerhoeveelheid nanogram op 50, pre-PCR-cycli op 12 en post-PCR-cycli op 12. Klik dan op Ren om verder te gaan.

Vervolgens steek je de voorverpakte reagenscartridge in de aangewezen sleuf van het instrument, die automatisch de plaatsing en status van het reagens valideert. Na het laden van de monsters druk je op start om de autonome run te starten. Let op de LED-indicatoren op het systeem om de voortgang te volgen.

Na afloop van het programma klik je op OK om te bevestigen en het systeem zal automatisch de laatste bibliotheek overzetten naar de bibliotheekbuis, waarmee de bibliotheekvoorbereiding wordt voltooid. Meet de concentratie van zowel pre-library als totale library met fluorometrie. Verdunn de sequencingbibliotheek tot 1,6 picomolar en 1300 microliter voor sequencing-operaties.

Beheers de sequencing-omgeving door een binnentemperatuur en binnenluchtvochtigheid te behouden. Volledige kwaliteitscontrole van de instrumentuitvoergegevens door de basiskwaliteit boven Q 30 te verifiëren en het cluster density passing filter te controleren. De geoptimaliseerde detectieworkflow identificeerde betrouwbaar verschillende klinisch bruikbare genomische veranderingen in representatieve tumormonsters.

De sequencingresultaten toonden een hoogfrequente EGFR p. L858R missense-mutatie, vergezeld van een significante EGFR-genkopienummer-amplificatie. Matige amplificatie van het MET-gen werd waargenomen en een laag-niveau amplificatie van het BRAF-gen.

Het monster vertoonde een gemiddelde tumormutatielast en een microsatellietstabiele status. Alle gerichte genloci, waaronder ALK, BRAF, KRAS en ROS1, behaalden een detectiepercentage van 100% in vier replicatieve experimenten. Elke mutatie werd consequent gedetecteerd in alle vier de herhaalde experimenten, waarbij de verwachte abundantie binnen het normale fluctuatiebereik bleef; NJS biedt een compressief genetisch profiel voor niet-kleincellige longkanker door gelijktijdig gemeenschappelijke en nieuwe genen te detecteren.

Ons toekomstig onderzoek zal zich richten op het combineren van moleculaire pathologie met kunstmatige intelligentie om nieuwe biomarkers voor longkanker te onderzoeken.