Detectie van doelgerichte veranderingen bij niet-kleincellige longkanker met behulp van sequencing van de volgende generatie
10 oktober 2025
Dit protocol beschrijft een geautomatiseerde, door de ISO15189 geaccrediteerde sequencing-workflow van de volgende generatie voor het detecteren van doelgerichte genomische veranderingen in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels.
Mijn onderzoek ontdekt genetische mutaties bij kanker om de diagnose en behandeling te verbeteren. Om te beginnen registreert u de monsterinformatie in het Laboratory Information Management System en vult u het informed consent-formulier in voor genmutatietests. Met wegwerp-microtome messen werden secties gesneden van de niet-kleincellige longkanker, formeel en vast paraffine-ingebed monster.
Vervolgens voert u routinematige hematoxyline- en eosinekleuring uit om de tumorcelinhoud te evalueren. Voor nucleïnezuurextractie snijd je met een microtoom het formele en vaste paraffine-ingebedde blok om een lint te verkrijgen, en plaats je het lint in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Breng de buis over naar de aangewezen ingangslocatie van het monster op het geautomatiseerde extractie-instrument.
Gebruik vervolgens een automatisch extractie-instrument met een automatische extractiekit. Vervang handmatige pipetstappen door een automatisch magnetisch kralenextractiesysteem. Selecteer vervolgens het C1102-programma op het instrument.
Kies de incubatietijd voor het ontwaxen van het monster als 16 uur en stel het elucian-volume in op 100 microliter. Gebruik spectrofotometrie om de zuiverheid van DNA te verifiëren. Gebruik vervolgens een detectiekit met sequentie-specifieke fluorescerende kleurstoffen om een fluorometrische test uit te voeren voor nauwkeurige DNA-concentratiemeting.
Om gefragmenteerd genomisch DNA met ultrasoon geluid te bereiden, mengt u 200 nanogram genomisch DNA in 50 microliter low tris-EDTA buffer. Plaats het monsterbuisje in een voorgekoeld monsterrek, gehouden op acht graden Celsius. Stel de instrumentparameters in volgens het protocol en start DNA-fragmentatie.
Om geautomatiseerde bibliotheekvoorbereiding te starten, druk je op de aan/uit-knop om het systeem te activeren en wacht je tot de initialisatie voltooid is. Navigeer naar de programma-instelling, selecteer 'run protocol' en kies protocol BurningRock HS. Stel het monstertype in op hoogwaardige DNA, invoerhoeveelheid nanogram op 50, pre-PCR-cycli op 12 en post-PCR-cycli op 12. Klik dan op Ren om verder te gaan.
Vervolgens steek je de voorverpakte reagenscartridge in de aangewezen sleuf van het instrument, die automatisch de plaatsing en status van het reagens valideert. Na het laden van de monsters druk je op start om de autonome run te starten. Let op de LED-indicatoren op het systeem om de voortgang te volgen.
Na afloop van het programma klik je op OK om te bevestigen en het systeem zal automatisch de laatste bibliotheek overzetten naar de bibliotheekbuis, waarmee de bibliotheekvoorbereiding wordt voltooid. Meet de concentratie van zowel pre-library als totale library met fluorometrie. Verdunn de sequencingbibliotheek tot 1,6 picomolar en 1300 microliter voor sequencing-operaties.
Beheers de sequencing-omgeving door een binnentemperatuur en binnenluchtvochtigheid te behouden. Volledige kwaliteitscontrole van de instrumentuitvoergegevens door de basiskwaliteit boven Q 30 te verifiëren en het cluster density passing filter te controleren. De geoptimaliseerde detectieworkflow identificeerde betrouwbaar verschillende klinisch bruikbare genomische veranderingen in representatieve tumormonsters.
De sequencingresultaten toonden een hoogfrequente EGFR p. L858R missense-mutatie, vergezeld van een significante EGFR-genkopienummer-amplificatie. Matige amplificatie van het MET-gen werd waargenomen en een laag-niveau amplificatie van het BRAF-gen.
Het monster vertoonde een gemiddelde tumormutatielast en een microsatellietstabiele status. Alle gerichte genloci, waaronder ALK, BRAF, KRAS en ROS1, behaalden een detectiepercentage van 100% in vier replicatieve experimenten. Elke mutatie werd consequent gedetecteerd in alle vier de herhaalde experimenten, waarbij de verwachte abundantie binnen het normale fluctuatiebereik bleef; NJS biedt een compressief genetisch profiel voor niet-kleincellige longkanker door gelijktijdig gemeenschappelijke en nieuwe genen te detecteren.
Ons toekomstig onderzoek zal zich richten op het combineren van moleculaire pathologie met kunstmatige intelligentie om nieuwe biomarkers voor longkanker te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een geautomatiseerde, ISO15189-geaccrediteerde next-generation sequencing-workflow voor het detecteren van targetbare genomische alteraties in formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefsels van niet-kleincellige longkanker (NSCLC). Het proces omvat monsterregistratie, coupesnijden en extractie van nucleïnezuren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Oncologie
- Genomics
- Pathologie
Achtergrond
- Niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) is een veelvoorkomend type longkanker.
- Het identificeren van genomische alteraties is essentieel voor doelgerichte therapieën.
- Formaline-gefixeerd en in paraffine ingebed weefsel wordt vaak gebruikt in kankeronderzoek.
- Geautomatiseerde workflows kunnen de efficiëntie en nauwkeurigheid bij genomisch onderzoek verbeteren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare sequencing-workflow voor NSCLC-monsters vast te stellen.
- Om de detectie van targeteerbare genomische alteraties te verbeteren.
- Om naleving van de ISO15189-normen te waarborgen.
Gebruikte methoden
- Registreer de monsterinformatie in het Laboratory Information Management System.
- Snijd coupes van in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde monsters met behulp van microtoommesjes.
- Voer routine hematoxyline- en eosinekleuringen uit om het gehalte aan tumorcellen te evalueren.
- Extraheer nucleïnezuren met behulp van een geautomatiseerd extractieapparaat.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van nucleïnezuren uit NSCLC-monsters.
- Hoogwaardige genomische gegevens verkregen voor targeteerbare alteraties.
- Workflow heeft aangetoond te voldoen aan de ISO15189-accreditatie.
- Verbeterde diagnostische mogelijkheden voor de behandeling van NSCLC.
Conclusies
- De geautomatiseerde sequeneringsworkflow is effectief voor NSCLC.
- Naleving van ISO15189 verbetert de betrouwbaarheid van de resultaten.
- Dit protocol kan worden aangepast voor andere kankertypen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Uitgebreide detectie van behandelbare genomische veranderingen bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is cruciaal voor precisie-oncologie en de verdere ontwikkeling van geneesmiddelenportefeuilles. Geautomatiseerde, ISO15189-gecertificeerde workflows voor next-generation sequencing (NGS) maken een betrouwbare identificatie van mutaties, fusies en amplificaties mogelijk, wat bijdraagt aan een robuuste targetvalidatie en risico-gecorrigeerde besluitvorming. Gestandaardiseerde, reproduceerbare NGS-processen verminderen de technische variabiliteit en versnellen de integratie van translationeel onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige identificatie van drivermutaties en genamplificaties mogelijk voor functionele targetvalidatie.
- Ondersteunt biologisch de-risking door zowel veelvoorkomende als zeldzame genomische alteraties in NSCLC-monsters te detecteren.
- Verhoogt het predictieve vertrouwen bij de selectie van targets door middel van strikte kwaliteitscontrole en concordantie tussen replica's.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde genomische profielen voor voor downstream screening van verbindingen en de ontwikkeling van biomarker-assays.
- Standaardiseert monsterverwerking en bibliotheekpreparatie om reproduceerbaarheid en kwantitatieve betrouwbaarheid te waarborgen.
- Geautomatiseerde workflows minimaliseren menselijke fouten en ondersteunen de gereedheid voor schaalbare screening met een hoge doorvoer.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt moleculaire profilering uit met ziekte-relevante biomarkers voor translationele continuïteit in NSCLC-onderzoek.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door uitgebreide mutatie- en amplificatiegegevens voor preklinische modellen te leveren.
- Ondersteunt de integratie van moleculaire pathologie en de ontdekking van nieuwe biomarkers voor toekomstige translationele studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze NGS-workflow slaat een brug tussen vroege ontdekking, targetvalidatie en translationeel onderzoek door genomicadata van hoge getrouwheid te leveren uit klinische NSCLC-monsters.
- Discovery Biology: Biedt robuuste hypothesetoetsing en verduidelijking van pathways via uitgebreide mutatiedetectie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve genomische outputs die geschikt zijn voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert hoogwaardige, statistisch gevalideerde readouts voor vergelijkingen tussen condities en besluitvormingsondersteuning.
- Translationeel Onderzoek: Waarborgt biomarker-afstemming en continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie bij NSCLC.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, schaalbaar platform voor doorlopende moleculaire profilering binnen oncologieportfolio's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de selectie van targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid via automatisering en strikte QC.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door betrouwbare genomische gegevens te leveren voor portfoliotriage.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van NSCLC en andere oncologische assets mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire pathologie, NGS-instrumentatie en bio-informatische analyse.
- Vereist toegang tot geautomatiseerde extractie- en library-preparatiesystemen met gevalideerde protocollen.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor sample-input, QC-drempelwaarden en data-interpretatie.
- Protocollen moeten worden aangepast aan variërende tumorcellulariteit en FFPE-monsterkwaliteit.
- Doorlooptijd en technische complexiteit blijven praktische overwegingen voor klinische en translationele implementatie.
