Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

Dit protocol integreert AI-gestuurde beeldanalyse voor weefselsegmentatie. Met histologie selectieve oogst door laser microdissectie en brengt ons dichter bij de realiteit van Pathomics. Het vooraf definiëren van weefsel ROI met behulp van AI, beperkt de verblijftijd van weefselglijbanen bij omgevingstemperatuur, vermindert de inspanning van de mankracht om deze oogsten uit te voeren en vermindert de variabiliteit van de operator.

Deze techniek is breed toepasbaar op elk op ziekte of pathologie gebaseerd onderzoek waarbij specifieke cellulaire populaties uit weefselspecimens worden verzameld of verrijkt. Deze methode is eenvoudig voor gebruikers met basiskennis van histopathologie en LMD-ervaring. De sleutel is om ervoor te zorgen dat u de kalibrator voor de cellen schoon snijdt en om de classificator goed te trainen.

Zorg er om te beginnen voor dat de dia volledig droog is voordat u de referentiekalibratiefiducials snijdt. Open de Laser Microdissection-software en open het standaard kalibratiepunt-sld-bestand onder de optie shapes importeren. Laad de dia met het weefsel naar beneden gericht en de labelzijde dichter bij de operator.

Selecteer in de diahouder op de lasermicrodissectiefase de optie autofocus voordat u knipt. Snijd met behulp van de lasermicroscoop en het standaard kalibratiepuntsld-bestand kalibratiefiducials in het PEN-membraan. Alleen voor met lasermicrodissectie verrijkte collecties opent u de beeldanalysesoftware.

Selecteer geopende afbeeldingen en selecteer in het pop-upvenster het dot svs-afbeeldingsbestand dat is gegenereerd door de dia te scannen. Navigeer naar het tabblad Annotaties, selecteer en gebruik het gereedschap rechthoekannotatie om een vak rond het weefsel te tekenen. Selecteer de annotatie van het vak en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding.

Selecteer het geavanceerde vervolgkeuzemenu en klik vervolgens op de partitioneringsoptie. Stel de tegelgrootte en -ruimte in tussen respectievelijk 500 en 40 en selecteer OK om de tegels te genereren. Selecteer en verwijder de annotatie van het omtrekvak die wordt gebruikt om de tegels te genereren.

Selecteer het vervolgkeuzemenu laagacties en klik vervolgens op exporteren om de betegelde annotaties op te slaan als een puntannotatiebestand. Plaats een opgeslagen kopie van het Python dapa-algoritme, ontwikkeld om de AI-geclassificeerde annotatielagen samen te voegen in dezelfde map als het betegelde annotatiesbestand. Kopieer de naam van het betegelde annotatiebestand.

Open het Python-programma met behulp van de inactieve geïntegreerde ontwikkelomgeving en plak de naam van het betegelde annotatiebestand tussen de aanhalingstekens onder aan het programma. Selecteer het vervolgkeuzemenu Uitvoeren en klik vervolgens op module uitvoeren. Wacht tot er een paar bestanden zijn gegenereerd waarin alle betegelde annotaties onder één laag zijn samengevoegd.

Open de software voor beeldanalyse en navigeer naar het tabblad Annotaties. Selecteer het vervolgkeuzemenu laagacties en klik vervolgens op Alle lagen verwijderen om alle annotaties uit de afbeelding te verwijderen. Selecteer het vervolgkeuzemenu laagacties en klik vervolgens op Lokaal annotatiebestand importeren.

Selecteer in het pop-upvenster het samengevoegde puntannotatiebestand dat door het script is gegenereerd. Zorg ervoor dat alle geïmporteerde tegels zich onder dezelfde annotatielaag bevinden. Volg op het tabblad classificator de instructies van de fabrikant om representatieve gebieden van de tumor, stroma en lege glazen dia-achtergrond-ROI's te markeren.

Voordat u de classifier uitvoert, klikt u op geavanceerde classificatieopties en selecteert u de gewenste annotatielaag door het vakje ROI of de vakjes op het tabblad annotaties in te schakelen. Gebruik de optie annotatielaag in het menu classifieracties om de classifier uit te voeren. Zodra de classifieranalyse is voltooid, navigeert u naar het tabblad Annotaties en selecteert u de annotatielaag die uit de analyse is gegenereerd.

Selecteer het vervolgkeuzemenu laagacties en klik vervolgens op Alle lagen behalve huidige verwijderen om alle andere annotatielagen uit de afbeelding te verwijderen. Selecteer vervolgens het vervolgkeuzemenu laagacties en klik vervolgens op exporteren om de annotaties op te slaan als een puntannotatiebestand. Maak een map voor de sessie of het project en sla het puntannotatiebestand op in een submap.

Gelabeld met de unieke id voor de dia. Navigeer naar het tabblad Annotaties, selecteer de vervolgkeuzelijst laagacties en klik vervolgens op Alle lagen verwijderen om alle annotaties uit de afbeelding te verwijderen. Selecteer het pengereedschap en teken een korte lijn van elke kalibratiefiducial.

Teken lijnen uit de markeringen in de volgende volgorde. Linksboven, rechtsboven, rechtsonder. Selecteer het vervolgkeuzemenu laagacties en klik vervolgens op exporteren om de betegelde annotaties op te slaan als een do-annotatiebestand.

Voeg onderstrepingstekenscal toe aan de bestandsnaam en plaats het bestand in de submap met de coördinaten voor de betegelde vormen. Kopieer het adres voor het hoofdproject. Open de script malliator voor het genereren van XML-import met behulp van de inactieve geïntegreerde ontwikkelomgeving en plak vervolgens het adres van de projectmap tussen de aanhalingstekens onder aan het script.

Selecteer het vervolgkeuzemenu Uitvoeren en klik vervolgens op module uitvoeren om het script uit te voeren. Laad de gemarkeerde membraanschuif met het weefsel naar beneden gericht en de labelzijde dichter bij de operator in de diahouder op het lasermicroscooppodium. Selecteer shapes importeren in het vervolgkeuzemenu bestand.

Selecteer het dot XML, LMD-importbestand dat voor de dia is gegenereerd. Selecteer nee in het pop-upvenster om te voorkomen dat referentiepunten uit het bestand worden geladen en nee in het tweede pop-upvenster om te voorkomen dat eerder opgeslagen referentiepunten worden gebruikt voor kalibratie. Volg de aanwijzingen van de lasermicrodissectietoepassing en lijn het kalibratiekruis uit op elk van de drie kalibratiefiducialen op de dia.

Zoek naar kalibratiefiducials die linksboven, rechtsboven en rechtsonder in de diaafbeelding worden weergegeven. In de beeldanalysesoftware komt dat overeen met referentiepunten van de omgekeerde lasermicrodissectieglaas op het microscoopstadium. Schakel tussen het gebruik van de 5x subjectieve lens om te lokaliseren en de 63x subjectieve lens om elke kalibratiefiducial uit te lijnen.

Selecteer nee in het pop-upvenster om te voorkomen dat de referentiepunten in het bestand worden opgeslagen en ok in het tweede pop-upvenster om te bevestigen dat de dia is ingevoegd. Verplaats de 5x subjectieve lens in positie en selecteer ja in het pop-upvenster om de werkelijke vergroting te gebruiken. Zodra de geïmporteerde vormen worden weergegeven, richt u de camera op het weefsel.

Markeer en selecteer alle vormen in het lijstvenster shapes. Sleep ze op hun plaats met behulp van een of twee annotaties binnen het gezichtsveld als verwijzingen en lijn de verticale z-as uit voor het snijden met de laser. Laad de buizen in universele buishouder die is ontworpen voor PCT-microbuizen.

Bekijk de geïmporteerde vormen en wijs ze toe aan de juiste buispositie voor verzameling. Druk op start cut om de laser te starten. Verwijder en sluit de monsterbuis met LMD-weefsels en leg op droogijs.

Na thermocycling en centrifuging oogstte de LMD weefselmonsters, verwijder en gooit de microcaps van de PCT-microbuizen weg. Voeg trypsine toe, voeg een verhouding van één microgram per 30 millimeter gekwadrateerd weefsel toe. En steek een micro stamper in de microbuis met behulp van de microcap tool.

Breng de microbuizen over in een loopcycluscartridge en monteer de volledige cartridge. Plaats de patroon in de drukkamer van de loopcyclus en zet het deksel vast. Vatcyclus bij 45.000 PSI gedurende 50 seconden en atmosferische druk gedurende 10 seconden bij 50 graden Celsius gedurende 60 cycli.

Voor LC-MS MS-analyse laadt u automatische monsterflacons op de juiste posities in de vloeistofchromatografie auto sampler. Sluit de automatische sampler en analyseer afzonderlijke fracties met een geschikte gradiënt- en massaspectrometriemethode. Unsupervised hiërarchische clustering met behulp van de 100 meest variabele eiwitten.

Resulteerde in de segregatie van de hooggradige sereuze eierstokkanker en ovariële heldercellige carcinoom histotypen uit de lasermicrodissectie verrijkte en hele tumormonsters. Daarentegen verrijkte de lasermicrodissectie stromamonsters van zowel hooggradige sereuze eierstokkanker als ovarium clear cell carcinoom. Geclusterd en onafhankelijk van de laser microdissectie verrijkte tumor en hele tumor monsters.

Van de 5.971 gekwantificeerde eiwitten waren er 215 significant veranderd tussen hele tumorcollecties van hooggradige sereuze eierstokkanker en ovarium clear cell carcinoommonsters. Van de 76 kenmerkende eiwitten die Hughes überhaupt kwantificeerde, werden er 57 mede gekwantificeerd in deze dataset en waren sterk gecorreleerd Training de classificator is het meest uitdagende deel. Het volgen van de indica Lab software instructies en het verfijnen van de classifier gereproduceerde de meest nauwkeurige resultaten.

Al het andere is gestandaardiseerd. Het weefsel dat wordt geoogst met behulp van deze AI-gestuurde LMD-workflow is compatibel met een verscheidenheid aan downstream analytische toepassingen, waaronder op massaspectrometrie gebaseerde proteomics die hier worden beschreven of genomi-, transcriptomische of andere omic-analyses.