Name: Een In Vitro Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Leer de transformatie van microglia naar globoïde cellen in Krabbe-ziekte met cycline-behandeling en immunofluorescentie. Deze methode biedt inzicht in celinteracties en mogelijke therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 naar S.J.C.), de National Institutes of Health (NS065808 naar E.R.B.; NS078392 naar S.J.C.), start-up fondsen van het UConn Health Center (naar SJC) en het Kim Family Fund (UCHC ter ondersteuning van K.I.C.).

Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid op Humanitaire Zorg en gebruik van proefdieren uiteengezet door het Office of Laboratory Animal Welfare (NIH) en alleen met toestemming van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Connecticut Health Center. 1 Voorbereiding van de Gemengde glialculturen <ol><li> Steriliseer alle instrumenten voor gebruik. Voeg 3 ml ijskoude steriele Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) die geen kationen (Mg2 + of Ca2 +) drie steriele 60 mm petrischaaltjes op ijs koud houden. </li><li> Isoleer de cortices van postnatale P0-P2 muis pups, zoals eerder beschreven 17,18. OPMERKING: Subcorticale structuren, zoals zeepaardjes, zijn niet inbegrepen in deze culturen. </li><li> Verwijder voorzichtig de hersenvliezen en breng de geïsoleerde cortex frisse HBSS en distantiëren de weefsels enzymatisch, met behulp van een neural weefsel dissectie kit volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Plaat de cellen in steriele T-175 kolven en incubeer overnacht in medium [Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS) bevattende 1 x penicilline / streptomycine]. </li><li> Vervang alle media de volgende dag met verse media. Blijven culturen broeden, met reguliere media veranderingen, voor ongeveer 3 weken of tot een cellulaire monolaag is gevestigd. Opmerking: Deze monolaag zal bestaan ​​uit astrocyten en microglia met een ongeveer 10: 1 verhouding 19. </li></ol> 2 globoid Cell Inductie in Gemengde glialculturen <ol><li> Bereid de ECM-gecoate dekglaasjes. <ol><li> Opnemen ronde dekglaasjes met steriele 1 N zoutzuur (HCl) in een steriele petrischaal gedurende 30 minuten. Was coverslips met steriel water 3x en dan laten weken in 95% EtOH gedurende tenminste 20 minuten. en dan laten drogen aan de lucht. </li><li> Plaats druppels verdund extracellulaire matrix (ECM) eiwitten bekledingsmaterialen op een stuk Parafilm (bijvoorbeeld 150-250 gl / druppel laminine 10 ug / ml opgelost in steriele fosfaatbuffer [PBS]). Verdeel de druppels zodat coverslips toen geplaatst op deze druppeltjes niet zal raken. Plaats voorzichtig elke gedroogde dekglaasje op een druppel behulp van een tang. </li><li> Laat de dekglaasjes op de druppels ca.. 4-6 uur in de cultuur kap met het raam dicht. </li><li> Plaats de ECM-gecoate dekglaasjes (ECM-gecoate kant naar boven) in elk van de wells van een 24-well plaat. Was elk putje met steriel PBS 3x en bewaar bij 4 ° C totdat het nodig is. </li></ol></li><li> Voorbereiding Gliale Cellen voor Plating op Coverslips. <ol><li> Zuig het materiaal uit de gliale culturen en voorzichtig te wassen de gliale monolaag 3x met 10 ml steriele PBS. Voeg daarna 8-10 ml trypsine-EDTA oplossing van het T-175, en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Wanneer de meeste van de monolaag is losgemaakt, voeg 20 ml van complete medianaar de kolf met trypsine te stoppen. Verzamel de media die het losgemaakte cellen in een 50 ml conische buis en draaien voor 10 min bij 300 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het supernatans zonder de pellet te verstoren, en vervolgens opnieuw op te schorten van de cellen in 2 ml verse complete media door de pipet voorzichtig de oplossing om met een P1000 pipet. </li><li> Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer en resuspendeer cellen in compleet medium op de gewenste dichtheid (bijvoorbeeld 10 5 cellen / ml). Plaat de cellen op de ECM beklede dekglaasjes (bijvoorbeeld 500 pl in elk putje van de 24-well plaat). Voeg extra vers compleet medium aan elk putje gedurende 3-5 dagen incubatie bij 37 ° C, of ​​totdat de cellen groeien tot de gewenste visuele samenvloeiing. </li></ol></li><li> Behandeling met Psychosine. <ol><li> Reconstitueer de psychosine een voorraadconcentratie (108,3 mM) in dimethylsulfoxide (DMSO). Verdun deze voorraad in 100% EtOH een werkvoorraad maken dat kan den wordt toegevoegd aan elke well van 24-well plaat tot een eindconcentratie van 10 uM. </li><li> Op het moment van toevoegen van de psychosine, draai voorzichtig met de cultuur plaat om de psychosine in de cultuur media mix. Vul het psychosine door toevoeging van het equivalent van 10 uM om de dag gedurende een week. </li></ol></li><li> Na 7 dagen psychosine behandeling, verzamel de media en pipet 500 pi koude 4% paraformaldehyde (PFA) in elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de cellen te repareren. Vervolgens was elk putje 3x met PBS en vervolgens houden platen bij 4 ° C totdat bewerkt voor immunocytochemie (zie hieronder). OPMERKING: celkweek media kunnen worden verzameld voor enzymatische of ELISA assay op dit moment indien gewenst. </li></ol> 3 Immunocytochemie (ICC) om globoid Cells Visualiseer <ol><li> Vervang PBS met blokkerende buffer [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normaal geit serum (NGS)] en incubeer de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Incubate de gefixeerde cellen in primaire antisera tegen Iba-1 [(1: 1000) verdund in PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] minimaal 1 uur bij kamertemperatuur geroerd, daarna wassen elk putje met PBS 3 x 5 min / wassen. </li><li> Voeg de juiste secundaire fluorescentie-geconjugeerd antilichaam aan het primaire antilichaam labeling en contra-vlek identificeren met 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1: 1000) kernen identificeren. Incubeer in secundair antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en wassen met PBS 3 x 5 min. </li><li> Monteer elke dekglaasje om dia&#39;s met behulp van een montage medium microscoop. Bekijk dia&#39;s op een fluorescentiemicroscoop voor visuele en kwantitatieve analyses. </li></ol> 4 Analyse en karakterisering van globoid Cellen in het jeugdwerk Cultuur <ol><li> Gebruik de volgende drie morfologische criteria een globoid cel te identificeren in de cultuur: <ol><li> Identificeer globoid cellen met behulp van fluorescentie microscopie door immunopositieve etikettering voor de microglia marker, Iba-1 +. </li><li> Identificeergloboid cellen als polynucleated (dwz met twee of meer DAPI positieve kernen). </li><li> Identificeer globoid cellen door een afgeronde morfologie verschilt van de sterk vertakte weergave van rustende microgliale cellen. OPMERKING: Cellen kunnen ook worden verzameld celoppervlak marker-analyse en kwantificering door flow cytometrie uit deze culturen. </li></ol></li><li> Het meten van de fagocytaire activatie van microglia en globoid cellen <ol><li> Om de fagocytische activiteit van psychosine behandelde microglia beoordelen, commentaar FITC-gemerkte latex bolletjes aan de putjes volgens de instructies van de fabrikant. Voeg TL-geconjugeerde latexparels 48 uur voorafgaand aan de fixatie met PFA. Fix cellen behandeld met kralen (zoals vermeld in paragraaf 2.4), en het proces voor immuuncytochemie (zoals beschreven in paragraaf 3). </li><li> Selecteer fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen, zodat zij de fluorescentie emissiespectra van de fluorofoor gemerkte korrels overlappen. </li><li> Analyze fagocytotische de profielen van Iba-1 + microglia door het identificeren van die cellen die co-lokaliseren met fluorescent-gelabelde beads. OPMERKING: Psychosine zal microglia activeren. Gefagocyteerde kralen worden geïdentificeerd binnen mononucleaire en meerkernige Iba-1 + cellen in deze cultuur instelling. </li></ol></li></ol> 5 Inductie van globoid Cellen uit Gezuiverd Microgliale Cultures OPMERKING: Een alternatieve benadering intercellulaire signalering tussen astrocyten en microglia ontcijferen is een ander voordeel van deze in vitro globoid celmodel. Zuivering van primaire microgliale cellen voor replating of co-kweek kan worden bereikt door hun lagere hechting eigendom in kweek, zoals beschreven in de volgende stappen (zie paragraaf 5.2). <ol><li> Verzamel het materiaal uit de samenvloeiing gemengde glialculturen in 50 ml conische buis en onderhouden bij 37 ° C in de incubator. </li><li> Microglia Isolatie van primaire Mixed glialculturen.<ol><li> Nadat de inhoud van een confluente gemengde gliale cultuur T175 kolf, voeg warm schudden media [bestaande uit compleet medium + 25 mM 4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) + 25 mM natriumbicarbonaat (Sigma)]. Schud de kolven gedurende 3-4 uur in een orbitale schudder bij 100 rpm (37 ° C). Verzamel het materiaal uit deze geschud kolven in 50 ml conische buizen. OPMERKING: Dit medium zal het minder aanhangend microglia van de kolven. </li><li> Spin de media bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 ml van de astrocyt-geconditioneerde media (verzameld in stap 5.1). </li><li> Vaststellen van het aantal cellen verkregen met behulp van een hemocytometer en vervolgens bord van de microglia cellen op-substraat gecoate dekglaasjes (zie paragraaf 2.1) voor immunocytochemie, of plaat op Ultralow therapietrouw en platen voor de toekomstige collectie van globoid cellen voor co-cultuur met andere celtypes, zoals oligodendrocyten (als described in de volgende paragraaf). Opmerking: Als de geplateerde microglia worden behandeld met psychosine (10 uM) zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 2.3). </li></ol></li><li> Co-cultuur met primaire oligodendrocyten voor Analyse van de cytotoxiciteit. OPMERKING: Verzameling van psychosine behandelde microglia van de lage hechting platen voor daaropvolgende co-kweek op primaire kweken van oligodendrocyten of oligodendrocyt progenitorcellen, kunnen worden gebruikt om de mogelijke cytotoxische functie van deze globoid-achtige cellen in vitro onderzoeken. <ol><li> Ontwikkelen culturen van primaire oligodendrocyten met aanvaarde methoden 18,20. Om de psychosine behandelde microglia verzamelen voorzichtig pipet de losjes hechtende cellen los van de bodem van de putjes. Verzamel de cellen gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 10 min, en vervolgens voorzichtig resuspenderen in oligodendrocyten differentiatie media [samengesteld Neurobasal media, L-glutamine (1x), B-27 supplement (1x) en Triiodothyronine (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Tel het aantal cellen met een hemocytometer en zaad de microglia op de oligodendrocyt kweek bij 1 x 10 5 cellen / ml, resulterend in een ongeveer 1: 2 microglia / oligodendrocyt verhouding. Incubate als een co-cultuur voor maximaal 3 dagen. </li><li> Fixeer de cellen voor immunocytochemie (zie paragraaf 2.4). Verzamel celkweekmedium voor ELISA of chemische analyses nodig. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li>
<li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease%3A+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).</li>
<li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hunter%27s+Hope+Krabbe+family+database%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li>
<li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+screening+for+Krabbe+disease%3A+the+New+York+State+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li>
<li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+familial%2C+infantile+form+of+brain+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li>
<li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globoid+cell+leukodystrophy%3A+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li>
<li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li>
<li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li>
<li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li>
<li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglial+cytoskeleton%3A+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li>
<li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li>
<li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li>
<li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li>
<li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation%3A+Implications+for+leukodystrophy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li>
<li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage%2Fmicroglia+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li>
<li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li>
<li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+%28TIMP-1%29+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li>
<li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De hierin beschreven protocol verschaft een nieuw modelsysteem waarin de ontwikkeling en functionele karakterisatie van geactiveerde microglia en globoid cellen te bestuderen. Eerder werk door Im et al. Gebruik een HEK293 cellijn voorzien in een matrijs voor de ontwikkeling van de onderhavige protocol voor de studie van globoid celvorming 21. Het is ook belangrijk erop te wijzen dat de globoid cellen, afkomstig van het model afwijken van de inheemse globoid cellen herkenbaar in GLD. Zo hebben we rout...

Globoid cel leukodystrofie (GLD), ook bekend als de ziekte van Krabbe, een dodelijke demyeliniserende aandoening als gevolg van verlies van functie mutaties in het galatocerebrosidase (GalC) gen 1. De meest voorkomende vorm van GLD is de infantiele variant die wordt gekenmerkt door het begin in de vroege kinderjaren en gekenmerkt door een agressief klinisch beloop van motorische en cognitieve achteruitgang leidt tot een voortijdige dood vaak voor vijf jaar 2,3. Genetische tests worden gebruikt om de diagnose GLD 4 verifiëren. Neuropathologie van GLD onthult wijdverspreide demyelinisatie, neuronale atrofie, astrogliose en aanwezigheid van volgezogen met meerdere kernen microglia genaamd globoid cellen 5-7. De identificatie van globoid cellen, vaak met tubulous insluitsels in hun cytoplasma, is een typisch kenmerk van GLD geweest voor de afgelopen 97 jaar, hoewel de specifieke functie van deze opvallende cellen ongrijpbaar is gebleven. De betrokkenheid van niet-MYELsprong uit glia (microglia en astrocyten) in de pathogenese van GLD is lang beschouwd als een secundaire respons op de diepe demyelinisatie in deze ziekte 8. Interessant is de eerste beschrijving van deze ziekte, door Knud Krabbe in 1916 5, rapporteerde vorming van meerkernige fagocyten lipide bevattende resten die zijn genoemd &#39;globoid cellen en zijn een kenmerk van deze ziekte. Globoid cellen zijn het belangrijkste kenmerk is van GLD pathologie, hoewel hun rol in de GLD is lange tijd genegeerd. Interessant is dat deze cellen tot de vroegste kenmerkende veranderingen in CNS weefsel van GLD. Dit gebrek aan kennis kan veroorzaakt zijn door de aanname dat de vorming van meerkernige fagocyten, genaamd reuzencellen in andere ziekten, worden kenmerkend beschouwd als gevolg van pathologie dan een eerste pathogene motor 9. Daarom zijn er weinig studies die het mechanisme whi geweestch globoid cellen worden gevormd uit fagocyten, met name in het CZS van GLD. De in dit rapport beschreven procedure richt zich op het belang van globoid vorming cel in het CZS en onze vorige demonstratie die-psychosine geïnduceerde multinucleation van microglia in vitro en deze cellen vertoonden hogere niveaus van fagocytose. Consistent met deze waarnemingen, globoid cellen in vogelaar hersenen bevatten vaak PAS-positieve puin, wat suggereert een hoge mate van fagocytose. Globoid cellen zijn ook gevonden immunopositieve voor ferritine te zijn (een microglia marker) 10, KP-1 / CD68 (een monocyt marker), en sommige zijn ook positief voor vimentine (een intermediair filament eiwit en marker van astrocyten en geactiveerde microglia) 11, HLA-DRA (een MHCII oppervlak receptor) en TNF-α 7 en Iba-1 (a calcium bindend eiwit gebruikt voor het identificeren microglia) 12. Op basis van deze verzameling van markers, globoid cellen afkomstig van microglia die zich ontwikkeleneen unieke fenotype. Ondanks hun uniciteit, heeft de specifieke functie en de bijdrage van de GC te GLD pathogenese grotendeels over het hoofd gezien. Globoid cellen zijn gericht op een secundair gevolg van chronische demyelinisatie. Echter, eerdere studies onderzoeken van de tijdelijke vereniging van globoid cellen aan de witte stof pathologie van GLD de aanwezigheid van globoid cellen in de late embryonale om vroege postnatale periodes geïdentificeerd; tijden voorgaande oligodendrocyte apoptose en openlijke demyelinisatie 13. Aldus, de temporele opeenvolging van ontwikkeling van de neuropathologie in GLD stelt globoid cellen worden gevormd vóór demyelinisatie in deze ziekte 14. Dit leidde tot onze hypothese dat de vroege vorming van globoid cellen in GLD een bepalend pathogene evenement plaats kan vertegenwoordigen dan een secundaire, reactieve reactie op oligodendrocyte schade 15. Daarnaast heeft ontregeling van microgliale activiteit GLD beschouwd een factor het beperken van de lange-termijn effectiviteit van hematopeotic stamcel therapieën voor de behandeling van deze ziekte 16. Aldus onderzoeken van de cellulaire functies en regulering van microglia en globoid cellen in respons op psychosine verwachting nieuwe inzichten in de pathogenese van GLD verschaffen. Tot voor kort was het ontbreken van een geschikt model om globoid celvorming bestuderen begrip van de precieze functie en de bijdrage van deze cellen aan de pathologie van GLD beperkt. In recente studies werd vastgesteld dat globoid-achtige cellen worden gevormd in directe reactie op psychosine, een pathogeen toxine lipide dat zich ophoopt in GLD. We vonden dat microglia, maar niet macrofagen, worden geactiveerd en omgezet in globoid cellen in primaire gliale culturen in reactie op psychosine 15. Deze transformatie in globoid cellen bleek te zijn gemedieerd door de extracellulaire protease, matrix metalloproteïnase (MMP) -3 15. Meer recent, wehebben deze bevindingen uitgebreid en vastgesteld dat psychosine-geactiveerde microglia en globoid cellen die in dit in vitro model systeem krachtig giftig voor oligodendrocyten en oligodendrocyt progenitorcellen. Vandaar dat, wanneer beschouwd in de context van GLD, het begin van de accumulatie van psychosine en de vorming van globoid cellen voorafgaand aan demyelinisatie zou een opkomende primaire en mogelijk pathogene rol voor microglia bij deze ziekte te steunen. Wij stellen voor dat de studie van globoid vorming cel zal nieuwe informatie over de pathogenese van GLD, dat zal bijdragen aan ons begrip van deze ziekte te onthullen. Bovendien kan deze nieuwe cellulaire model van GLD een nieuw formaat van waaruit nieuwe therapeutische benaderingen te pakken pathologische veranderingen in deze ziekte zou kunnen worden getest bieden. Vandaar dat in dit rapport geven we een gedetailleerd protocol voor de in vitro ontwikkeling van psychosine geïnduceerde globoid cellen uit primaire kweken van niet myeliniserende glia.

<table><tbody><tr><td>Hank&rsquo;s balanced salt solution (HBSS) bevattende geen kationen (Mg2+ en Ca2+).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s balanced salt solution (HBSS) bevattende kationen (Mg2+ en Ca2+).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA oplossing</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor geconjugeerd antiserum</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

een in vitro model voor de studie van cellulaire pathofysiologie in globoid cell leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

De exacte functie van meerdere kernen microglia, genaamd globoid cellen, die uniek overvloedig in het centrale zenuwstelsel van globoid cel leukodystrofie (GLD) is onduidelijk. Deze kloof in kennis is gehinderd door het ontbreken van een geschikt in vitro model voor onderzoek. Hierin beschrijven we een primaire murine gliale kweeksysteem waarin behandeling met psychosine leidt multinucleation van microglia lijkt het kenmerk globoid cellen in GLD. Met behulp van deze nieuwe systeem, hebben we overeenstemming over de voorwaarden en de wijze van analyse voor de studie van globoid cellen. Het potentiële gebruik van dit modelsysteem werd gevalideerd in onze eerdere studie, die een mogelijke rol voor matrix metalloproteïnase (MMP) -3 geïdentificeerd in GLD. Deze nieuwe in vitro systeem kan een nuttig model waarin de vorming en functie, maar ook de potentiële therapeutische manipulatie van deze unieke cellen te bestuderen.

Dit protocol, zoals geschreven, zal naar verwachting ongeveer 36 dagen in beslag van begin tot eind (Zie Figuur 1: Experimentele Workflow Scheme). Het is onze ervaring dat de ontwikkeling van &quot;globoid-achtige &#39;cellen in deze primaire kweeksysteem zowel betrouwbaar en reproduceerbaar: de vorming van meerkernige cellen in reactie op psychosine consistent waargenomen bij 7 dagen behandeling. Immunocytochemische kleuring van microglia met Iba-1 in combinatie met een nuc...

Globoïde cellen zijn een typerend pathologisch kenmerk van de ziekte van Krabbe, een leukodystrofie waarvoor momenteel geen effectieve langetermijntherapie bestaat. We hebben een celkweekmodel ontwikkeld om de intrinsieke biologie en het pathogene potentieel van geactiveerde microglia en hun transformatie in globoïde cellen te bestuderen.

Een In Vitro Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Het algemene doel van deze procedure is om de unieke transformatie van microglia naar GLO-cellen aan te tonen in aanwezigheid van de toxine cycline. Dit wordt bereikt door eerst dekglasjes te coaten met extracellulaire matrix-eiwitten. In de tweede stap worden gliacellen op de dekglasjes geplaatst en vervolgens worden cycline en latexkraaltjes toegediend aan de culturen.In de laatste stap worden de cellen gekleurd door middel van immunochemie. Uiteindelijk kunnen de effecten van de cycline op de nucleatie en fagocytische capaciteit van de microgliacellen worden geëvalueerd door immunofluorescente microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals het gebruik van microgliale cellijnen, is dat het gebruik van primaire gliacellencultuur de veronderstelde interacties tussen I-astrocyten en microglia in de hersenen van individuen met GLO void cell leukodystrofie of GLD nabootst, waardoor de procedure zal worden uitgevoerd door KO Claycomb, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.Om de extracellulaire matrix of ECM-gecoate dekglasjes voor te bereiden, weekt u eerst ronde dekglasjes in steriel zoutzuur in een steriele Petri-schaal. Was de dekglasjes na 30 minuten drie keer met steriel water en week ze vervolgens minimaal 20 minuten in 95% ethanol. Laat de dekglasjes aan de lucht drogen, voeg vervolgens druppels van 150 tot 250 microliter verdunde ECM-eiwitcoatingmaterialen toe op een vel paraform en verdeel de druppels zodat de dekglasjes na plaatsing niet overlappen.Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig een dekglasje op elke druppel te plaatsen en plaats de paraform vervolgens in een celcultuurkap met de kap gesloten. Na vier tot zes uur, plaatst u de dekglasjes ECM-gecoate zijde omhoog in afzonderlijke putjes van een 24-welplate. Was vervolgens elke put drie keer met steriel PB S en bewaar de dekglasjes bij vier graden Celsius. Om de gliacellen voor te bereiden voor het plaatsen op de dekglasjes, aspireer het medium uit de gliacellenculturen en was vervolgens de monolaag drie keer met 10 milliliter steriel PBS.Los de cellen na vijf tot 10 minuten met acht tot 10 milliliter trypsine EDTA. Bij 37 graden Celsius, voegt u 20 milliliter compleet medium toe aan de flacon om de reactie te stoppen. Breng vervolgens de celsuspensie over naar een 50 milliliter conische buis en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten.Bij 300 Gs en kamertemperatuur, gebruikt u een P 1000 om de palat voorzichtig te resuspenderen in twee milliliter vers, compleet medium. Na het tellen, verdunt u de cellen tot ongeveer een keer 10 tot de vijfde cel per milliliter. Beplaat vervolgens 500 microliter van de cellen op elk van de ECM-gecoate dekglasjes.Voeg aan elk putje vers compleet medium toe en incubeer vervolgens de plaat gedurende drie tot vijf dagen bij 37 graden Celsius. Zodra de cellen de gewenste confluentie hebben bereikt, voegt u vers bereidde cycline toe aan elk putje en schudt u de kweekplaat voorzichtig om te mengen. Na een week van cyclinebehandeling, verzamelt u het medium en fixeert u de cellen in 500 microliter koud 4% paraformaldehyde per putje bij kamertemperatuur.Was vervolgens elk putje drie keer met PBS en bewaar de platen bij vier graden Celsius. Om de GLO-cellen te visualiseren door middel van immunocytochemie, vervangt u eerst het PBS door blokkeerbuffer en incubeert u de cellen bij kamertemperatuur. Na een uur, incubeert u de cellen in primaire antisera tegen de microglia-marker IO een voor minimaal een uur bij kamertemperatuur en was vervolgens elk putje drie keer gedurende vijf minuten met PBS.Na het incuberen van de cellen met de juiste fluorescentie geconjugeerde secundaire antilichamen, contra-kleurt u de cellen met DAPI om de kernen te identificeren. Na het wassen van de cellen zoals net gedemonstreerd, gebruikt u montagemedium om elk dekglas op individuele microscoopglazen te monteren en bekijkt u de glazen op een fluorescerende microscoop voor visuele en kwantitatieve analyse. Om de fagocytische activiteit van de cycline-behandelde microglia na cyclinebehandeling, maar vóór fixatie te beoordelen, voegt u FITC-gelabelde latexkraaltjes toe aan elke G OID-celcultuur in overeenstemming met de instructies van de fabrikant.Na 48 uur, fixeert u de cellen in PFA zoals net gedemonstreerd, en verwerkt u vervolgens de cellen voor immunochemie zoals getoond. Beoordeelt u ten slotte het aantal IBO een positieve microglia dat co-lokaliseert met de fluorescentie gelabelde kraaltjes door middel van fluorescentiemicroscopie immunochemisch. Kleuring van microglia met behulp van IO een in combinatie met een nucleaire tegenkleuring maakt de identificatie van grote afgeronde multinucleaire cellen mogelijk.Merk op dat in veel gevallen de grove vergroting van de kerngrootte de multinucleaire status van deze cellen weerspiegelt, zoals waargenomen in deze afbeelding, cyclinebehandeling veroorzaakt ook een gegeneraliseerde activering van de microglia die meetbaar is door een toename in de PHA zure activiteit van de mononucleaire microglia, evenals de multinucleaire GLO-cellen. Zoals waargenomen in deze representatieve afbeelding, kunnen de PHA zuur actieve profielen van IBO een positieve microglia gemakkelijk worden geïdentificeerd tijdens co-cultuur met oligodendrocyt-progenitorchellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van GLD, aangezien de vorming van deze multinucleaire cellen als reactie op cyclinebehandeling een bepalende kenmerken is van de neuropathologie van GLD en de bijdrage van deze cellen aan deze pathologie is nog niet eerder op deze manier onderzocht.

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

The video demonstrates a protocol for differentiating oligodendrocyte precursor cells (OPCs) into oligodendrocytes and inducing myelination in a co-culture with dorsal root ganglion (DRG) neurons. The OPCs are transduced with lentiviral vectors encoding a signaling protein that regulates myelination. The transduced OPCs are co-cultured with DRG neurons to assess the differentiation into oligodendrocytes and the signaling protein-induced myelination.

An In Vitro Transduction-Induced Myelination Assay for Oligodendrocyte Precursor Cells

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Hier presenteren we protocollen die een flexibele en strategische basis bieden voor het op een virale manier manipuleren van oligodendrocytenvoorlopercellen om eiwitten van belang overexpressie te laten vertonen met als doel hun rol in oligodendrocyten specifiek te onderzoeken via het in vitro model van centrale zenuwstelsel myelinisatie.

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen

Om mechanismen van demyelinisatie en neuronale apoptose in corticale laesies van inflammatoire demyeliniserende aandoeningen aan te pakken, worden verschillende diermodellen gebruikt. We beschrijven hier een ex vivo benadering door gebruik te maken van oligodendrocyten-specifieke CD8+ T-cellen op herfsneden, wat resulteert in oligodendrogliale en neuronale dood. Potentiële toepassingen en beperkingen van het model worden besproken.

Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Hier beschrijven we een menselijk bloed-hersenbarrière model dat het mogelijk maakt om de transmigratie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken.

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

In dit verslag zijn de voordelen van organotypic culturen en gedissocieerde primaire culturen van muis-afgeleide dorsal root ganglia gemarkeerd om te onderzoeken van een breed scala van mechanismen die zijn gekoppeld aan neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, neuroinflammation, en reactie op virale infectie.

Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie

Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.

Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting

Hersenorganoïden dienen als een waardevol model voor studies naar mitochondriale encefalomyopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes (MELAS), bieden inzicht in hun onderliggende pathofysiologie en bieden een platform voor het screenen van geneesmiddelen. Organoïden afgeleid van cellijnen met verschillende niveaus van heteroplasmie van ziekteverwekkende genen vertonen significante fenotypische verschillen.

Modellering van mitochondriale ziekten met behulp van hersenorganoïden: een focus op mitochondriale encefalomyopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes

Leer de transformatie van microglia naar globoïde cellen in Krabbe-ziekte met cycline-behandeling en immunofluorescentie. Deze methode biedt inzicht in celinteracties en mogelijke therapeutische strategieën.

Een In Vitro Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy

Meer video's verkennen