Een In Vitro Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy

Het algemene doel van deze procedure is om de unieke transformatie van microglia naar GLO-cellen aan te tonen in aanwezigheid van de toxine cycline. Dit wordt bereikt door eerst dekglasjes te coaten met extracellulaire matrix-eiwitten. In de tweede stap worden gliacellen op de dekglasjes geplaatst en vervolgens worden cycline en latexkraaltjes toegediend aan de culturen.

In de laatste stap worden de cellen gekleurd door middel van immunochemie. Uiteindelijk kunnen de effecten van de cycline op de nucleatie en fagocytische capaciteit van de microgliacellen worden geëvalueerd door immunofluorescente microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals het gebruik van microgliale cellijnen, is dat het gebruik van primaire gliacellencultuur de veronderstelde interacties tussen I-astrocyten en microglia in de hersenen van individuen met GLO void cell leukodystrofie of GLD nabootst, waardoor de procedure zal worden uitgevoerd door KO Claycomb, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.

Om de extracellulaire matrix of ECM-gecoate dekglasjes voor te bereiden, weekt u eerst ronde dekglasjes in steriel zoutzuur in een steriele Petri-schaal. Was de dekglasjes na 30 minuten drie keer met steriel water en week ze vervolgens minimaal 20 minuten in 95% ethanol. Laat de dekglasjes aan de lucht drogen, voeg vervolgens druppels van 150 tot 250 microliter verdunde ECM-eiwitcoatingmaterialen toe op een vel paraform en verdeel de druppels zodat de dekglasjes na plaatsing niet overlappen.

Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig een dekglasje op elke druppel te plaatsen en plaats de paraform vervolgens in een celcultuurkap met de kap gesloten. Na vier tot zes uur, plaatst u de dekglasjes ECM-gecoate zijde omhoog in afzonderlijke putjes van een 24-welplate. Was vervolgens elke put drie keer met steriel PB S en bewaar de dekglasjes bij vier graden Celsius. Om de gliacellen voor te bereiden voor het plaatsen op de dekglasjes, aspireer het medium uit de gliacellenculturen en was vervolgens de monolaag drie keer met 10 milliliter steriel PBS.

Los de cellen na vijf tot 10 minuten met acht tot 10 milliliter trypsine EDTA. Bij 37 graden Celsius, voegt u 20 milliliter compleet medium toe aan de flacon om de reactie te stoppen. Breng vervolgens de celsuspensie over naar een 50 milliliter conische buis en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten.

Bij 300 Gs en kamertemperatuur, gebruikt u een P 1000 om de palat voorzichtig te resuspenderen in twee milliliter vers, compleet medium. Na het tellen, verdunt u de cellen tot ongeveer een keer 10 tot de vijfde cel per milliliter. Beplaat vervolgens 500 microliter van de cellen op elk van de ECM-gecoate dekglasjes.

Voeg aan elk putje vers compleet medium toe en incubeer vervolgens de plaat gedurende drie tot vijf dagen bij 37 graden Celsius. Zodra de cellen de gewenste confluentie hebben bereikt, voegt u vers bereidde cycline toe aan elk putje en schudt u de kweekplaat voorzichtig om te mengen. Na een week van cyclinebehandeling, verzamelt u het medium en fixeert u de cellen in 500 microliter koud 4% paraformaldehyde per putje bij kamertemperatuur.

Was vervolgens elk putje drie keer met PBS en bewaar de platen bij vier graden Celsius. Om de GLO-cellen te visualiseren door middel van immunocytochemie, vervangt u eerst het PBS door blokkeerbuffer en incubeert u de cellen bij kamertemperatuur. Na een uur, incubeert u de cellen in primaire antisera tegen de microglia-marker IO een voor minimaal een uur bij kamertemperatuur en was vervolgens elk putje drie keer gedurende vijf minuten met PBS.

Na het incuberen van de cellen met de juiste fluorescentie geconjugeerde secundaire antilichamen, contra-kleurt u de cellen met DAPI om de kernen te identificeren. Na het wassen van de cellen zoals net gedemonstreerd, gebruikt u montagemedium om elk dekglas op individuele microscoopglazen te monteren en bekijkt u de glazen op een fluorescerende microscoop voor visuele en kwantitatieve analyse. Om de fagocytische activiteit van de cycline-behandelde microglia na cyclinebehandeling, maar vóór fixatie te beoordelen, voegt u FITC-gelabelde latexkraaltjes toe aan elke G OID-celcultuur in overeenstemming met de instructies van de fabrikant.

Na 48 uur, fixeert u de cellen in PFA zoals net gedemonstreerd, en verwerkt u vervolgens de cellen voor immunochemie zoals getoond. Beoordeelt u ten slotte het aantal IBO een positieve microglia dat co-lokaliseert met de fluorescentie gelabelde kraaltjes door middel van fluorescentiemicroscopie immunochemisch. Kleuring van microglia met behulp van IO een in combinatie met een nucleaire tegenkleuring maakt de identificatie van grote afgeronde multinucleaire cellen mogelijk.

Merk op dat in veel gevallen de grove vergroting van de kerngrootte de multinucleaire status van deze cellen weerspiegelt, zoals waargenomen in deze afbeelding, cyclinebehandeling veroorzaakt ook een gegeneraliseerde activering van de microglia die meetbaar is door een toename in de PHA zure activiteit van de mononucleaire microglia, evenals de multinucleaire GLO-cellen. Zoals waargenomen in deze representatieve afbeelding, kunnen de PHA zuur actieve profielen van IBO een positieve microglia gemakkelijk worden geïdentificeerd tijdens co-cultuur met oligodendrocyt-progenitorchellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van GLD, aangezien de vorming van deze multinucleaire cellen als reactie op cyclinebehandeling een bepalende kenmerken is van de neuropathologie van GLD en de bijdrage van deze cellen aan deze pathologie is nog niet eerder op deze manier onderzocht.