HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van Plasmodium Rhoptry Eiwitten
June 10th, 2015
Expressie van malaria eiwitten in cellen gebaseerde systemen blijft uitdagend. We tonen twee stappen en een stap IVT (in vitro translatie) celvrije expressiesystemen voor het uitdrukken van malaria rhoptry recombinante eiwitten uit HeLa-cellen. We maken gebruik van een Ni-gebaseerde hars affiniteit zuiveringssysteem de rhoptry eiwitten te zuiveren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om plasmodium-eiwitten te vertalen met behulp van Hela-gebaseerde celvrije expressiesystemen en om de eiwitten te zuiveren uit microvolumes van het vertaalde product. Dit wordt bereikt door plasmodiumgenen te klonen om recombinante plasmiden voor twee-stappen en een-staps in vitro translatie te bereiden, celvrije expressie van malaria recombinante RT-boomeiwitten. Om de recombinante eiwitten te vertalen, wordt het bereide plasmide geïncubeerd met transcriptiemix.
Bij gebruik van het twee-stappen expressiesysteem, dat mRNA transcribeert, wordt het resulterende mRNA vervolgens toegevoegd aan het translatiemengsel voor eiwittranslatie. Bij gebruik van het een-stappen expressiesysteem wordt het recombinante plasmide geïncubeerd met hela-cellysaat voor transcriptie en translatie van recombinante eiwitten. Recombinante eiwitten worden vervolgens gezuiverd uit microvolumes van translatieproduct.
De resultaten tonen succesvolle expressie en zuivering op basis van western blotting-analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van anderen, zoals het tarwekiem expressiesysteem en het rabberreticulocytenlysaatsysteem, is dat dit systeem eiwitten in drie uur kan uitdrukken. Er is geen coderingoptimalisatie vereist.
Het is betaalbaar en gemakkelijk te gebruiken. Meerdere antigenen kunnen worden getest op microarrays, waardoor de detectie van antigenen voor therapie en diagnose mogelijk wordt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het celvrije expressie is, die eiwitten in microvolumes tot expressie brengt, waardoor eiwitzuivering uiterst moeilijk wordt.
We hadden eerst het idee om dit systeem te gebruiken omdat we geen eiwitten konden explo-expresseren met e coli en andere expressiesystemen te duur en tijdrovend vonden. We besloten om het Hela-gebaseerde celvrije expressiesysteem als een alternatief systeem te verkennen. Bereid 20 microliter transcriptiemengsel met recombinant plasmide vector DNA zoals beschreven in het tekstprotocol voor twee-stappen humane in vitro-eiwitexpressie.
Gebruik DNA-sjablonen. Meng de componenten in een microcentrifugebuisje en incubeer gedurende 75 minuten bij 30 graden Celsius in een waterbad. Neem vervolgens twee microliter van het transcriptiemengsel en voeg het toe aan 23 microliter van het translatiemengsel dat hela-cellysaat bevat.
Incubeer het resulterende mengsel gedurende 90 minuten bij 30 graden Celsius. Bewaar de vertaalde producten bij min 20 graden Celsius. Bereid vervolgens 25 microliter van het transcriptie- en translatiemengsel met het recombinante plasmide vector, DNA en hela-lysaat, zoals beschreven in het tekstprotocol voor een-stappen humane gekoppelde in vitro-eiwitexpressie voor DNA-sjablonen.
Incubeer dit reactiemengsel gedurende 90 minuten tot zes uur bij 30 graden Celsius en bewaar de translatieproducten bij min 20 graden Celsius. Om de tot expressie gebrachte recombinante eiwitten te zuiveren, voegt u 75 microliter een X-zuiveringsbuffer toe aan 25 microliter translatieproduct om 100 microliter zuiveringsmengsel te maken. Was de nikkelhars twee keer door 300 microliter gedistilleerd water en 300 microliter bindingsbuffer toe te voegen.
Resuspendeer de hars en centrifugeer gedurende één minuut bij 14.000 Gs om overtollig ethanol te verwijderen. Voeg vervolgens 100 microliter van de bereide zuiveringsoplossing toe aan 100 microliter nikkelchelaathars en incubeer het mengsel op een eind-tot-eind shaker gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
Centrifugeer het mengsel gedurende één minuut bij 14.000 Gs en verzamel het supernatant in een vers buisje gelabeld als flow-through. Was de hars met 100 microliter een X-wasbuffer, centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 14.000 Gs en verzamel het supernaat in een vers buisje gelabeld was. Herhaal deze stap twee keer na de was.
Voeg 100 microliter een X-elutiebuffer toe aan de hars en incubeer gedurende 15 minuten op een eind-tot-eind shaker. Centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 14.000 Gs. Voer de Ellucian-stap twee keer uit.
Verzamel het supernatant in een vers microcentrifugebuisje en label als eluaat na ellucian. Was de hars twee keer zoals eerder en bewaar deze vervolgens bij vier graden Celsius. Bewaar de flow-through-was en elutiemonsters bij min 20 graden Celsius of lager om western blotting uit te voeren.
Bereidt eerst afzonderlijke buisjes van schon-extracten van P falsy parum e coli, tot expressie gebracht recombinant R drie-eiwitten, de bereide recombinante eiwitten en de eiwitproducten gezuiverd met behulp van de affiniteitsmethode. Voeg vervolgens elektroforese-monsterbuffer met mercaptoethanol toe aan elk buisje voor een eindvolume van 20 microliter. Om gesolubiliseerde eiwitmonsters te maken, kookt u de buisjes gedurende twee minuten.
Laad de gesolubiliseerde eiwitmonsters op 10%SDS-page-gels om de eiwitten te scheiden na het draaien van de gels. Breng de gescheiden eiwitten over van de SDS-page-gels naar nitrocellulose papier door elektroforese bij 35 milliampère stroom per gel in een semi-droog western blotting-kamer gedurende twee uur na overdracht en blokkering van het nitrocellulose papier met 2% vetvrij melk. Incubeer het nitrocellulose papier met de polyklonale antilichamen vermeld in het tekstprotocol voor negatieve controles.
Incubeer ook nitrocellulose papier in een tot 100 verdunde normale muis- en konijnen-serum en uitgeput cultuursupernaat van SB twee myelomacellen. Na incubatie van het nitrocellulose papier bij vier graden Celsius gedurende de nacht, was vier keer met blotbuffer en incubeer met soortspecifieke secundaire antilichamen, geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase, verdund een tot 1000 in 2% melk. Was vervolgens het nitrocellulose papier opnieuw vier keer met blotbuffer.
Incubeer ten slotte het gewassen nitrocellulose papier met een kleurontwikkelingsoplossing, A plus B gedurende 30 minuten in het donker, succesvolle expressie van plasmodium-eiwitten met behul
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert twee celvrije expressiesystemen voor het vertalen van malaria-recombinante rhoptry-eiwitten uit HeLa-cellen. De methoden omvatten zowel een-staps als twee-staps in vitro translatie (IVT) systemen, gevolgd door zuivering met behulp van een Ni-resin affiniteitsmethode.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Eiwitexpressie
Achtergrond
- Expressie van malaria-eiwitten is complex en uitdagend.
- HeLa-cellen worden veel gebruikt voor eiwitexpressiestudies.
- Celvrije systemen bieden voordelen in efficiëntie van eiwitvertaling.
- Affiniteitszuiveringstechnieken zijn essentieel voor het isoleren van eiwitten.
Doel van het onderzoek
- Om effectieve celvrije expressiesystemen voor malaria-eiwitten te ontwikkelen.
- Om de translatie van recombinante rhoptry-eiwitten te optimaliseren.
- Om eiwitten te zuiveren uit kleine volumes van translatieproducten.
Gebruikte methoden
- Cloning van plasmodium-genen in recombinante plasmiden.
- Implementatie van twee-staps en een-staps IVT-systemen.
- Incubatie van plasmiden met transcriptie- en translatiemengsels.
- Zuivering van eiwitten met behulp van Ni-resin affiniteitschromatografie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle translatie van recombinante rhoptry-eiwitten werd bereikt.
- Zowel een-staps als twee-staps systemen toonden effectieve eiwitexpressie.
- Zuivering leverde hoogwaardige eiwitten op uit microvolumes.
- De methoden kunnen worden toegepast op andere malaria-eiwitten voor verder onderzoek.
Conclusies
- De ontwikkelde IVT-systemen zijn levensvatbaar voor het uitdrukken van malaria-eiwitten.
- Affiniteitszuivering is effectief voor het isoleren van recombinante eiwitten.
- Deze aanpak kan onderzoek naar malaria en gerelateerde eiwitten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
HeLa-based cell-free expression systems enable rapid production of complex malarial proteins in micro volumes, addressing key bottlenecks in antigen discovery for vaccine development. By expressing proteins in three hours without codon optimization, the method supports high-throughput screening of recombinant antigens for immunogenicity and functional studies. This approach reduces reliance on problematic eukaryotic or prokaryotic systems that yield misfolded or poorly glycosylated products, improving target validation confidence in early-stage antiparasitic research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional expression of hydrophobic and hydrophilic Plasmodium proteins for immunological screening.
- Operational Value: Supports rapid testing of multiple antigens using microarrays for therapy and diagnosis applications.
- Predictive Value: Facilitates antigen-specific antibody recognition studies to validate target relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces purified recombinant proteins suitable for immunoassays and protein sequencing.
- Operational Value: Uses affinity purification to isolate proteins from 25 µL translation products, enabling low-volume workflows.
- Assay Readiness: Generates quantifiable protein yields (3.5 µg per 25 µL) detectable by Bradford assay and Western blot.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Expressed proteins can be used for immunization studies and inhibitory antibody screening.
- Disease Relevance: Directly supports malaria vaccine candidate evaluation through proper protein folding and expression.
- Preclinical Utility: Enables protein-protein interaction studies and antibody characterization in parasitology research.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by providing soluble, correctly folded malarial proteins for downstream immunological and functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via expression of full-length recombinant rhoptry and Maurer’s cleft proteins.
- Screening: Enables microarray-based antigen detection for therapy and diagnosis through microvolume expression.
- Analytics: Provides quantifiable outputs via Bradford assay and Western blot for expression confirmation and purification tracking.
- Translational Research: Connects to preclinical advancement through use in immunizations and immunoassays.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple Plasmodium antigens without reoptimization, supporting platform reuse across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by expressing natively folded proteins absent in bacterial or wheat germ systems.
- Operational Value: Affordable, easy-to-use system requiring no codon optimization and compatible with standard lab equipment.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in antigen selection by enabling rapid expression and purification of multiple candidates.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization of vaccine targets through validated immunoreactivity and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell-free expression systems and affinity purification techniques.
- Dependent on access to HeLa lysate, transcription/translation mixes, and Ni-resin chromatography columns.
- Necessitates standardization across teams for consistent microvolume handling and purification reproducibility.
- Adaptation considerations include varying protein solubility and hydrophobicity across different Plasmodium targets.
- Practical limitations include challenges in protein purification from microvolumes, particularly for users new to cell-free expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:12
Protein Expression Using In Vitro Human Cell Free Expression System
3:21
Purification of Expressed Recombinant Proteins
5:05
Western Blotting
6:52
Results: Purple Color Band on Nitrocellulose Paper During Developing Step Confirms the Successful Expression of Proteins
8:11
Conclusion
