Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions
4 augustus 2015
Het volgende protocol beschrijft de procedure om sandwich-achtige culturen te assembleren die kunnen worden gebruikt als een tussenstadium tussen bi-dimensionele (2D) en driedimensionale (3D) cellulaire omgevingen. De ontworpen systemen kunnen toepassingen hebben in microscopie, biomechanica, biochemie en celbiologie assays.
Het algemene doel van deze procedure is om sandwich-achtige culturen samen te stellen om celgedrag te bestuderen in een fysiologisch relevantere 3D-omgeving. Dit wordt bereikt door eerst de ventrale en dorsale substraten voor te bereiden en te coaten met eiwitten zoals fibronectine. Vervolgens worden de cellen geplaatst, vergelijkbaar met een standaard 2D-cultuur.
Vervolgens wordt het dorsale substraat over de cellen gelegd, zodat ze zowel ventriculair als dorsaal gestimuleerd worden. Ten slotte kunnen experimenten zoals een wondgenezingsassay worden uitgevoerd. Uiteindelijk worden sandwich-achtige culturen geanalyseerd door procedures die al ontwikkeld zijn voor standaard 2D-culturen, zoals live beeldvorming, immunofluorescentie of cellulaire extractie.
Voor verdere analyse. Het belangrijkste voordeel van deze kweektechniek ten opzichte van bestaande driedimensionale systemen is dat het de studie van verschillende parameters in materiaalinteracties zoals topografie, chemie, stijfheid en eiwitgehalte mogelijk maakt op zowel de ventrale als dorsale locaties, wat een hoge mate van veelzijdigheid biedt. Naast experimentele procedures die voor sommige driedimensionale systemen zoals lipine, immunofluorescentie en cellulaire extracties kunnen worden belemmerd, worden ze gemakkelijk uitgevoerd. Om een vlakke film van polymelkzuur of PLLA te produceren door solvent casting in een afzuigkap te werken, voegt u twee gram PLLA toe aan 100 milliliter chloroform en roert u ongeveer drie uur op kamertemperatuur of tot het volledig is opgelost.
Plaats roestvrijstalen onderleggers op een glazen petrischaal. Voeg vervolgens 200 microliter van de PLLA-oplossing toe aan de onderleggers. Gebruik aluminiumfolie met een paar gaatjes om de schaal af te dekken en laat de PLLA gedurende 30 minuten op kamertemperatuur langzaam verdampen.
Verwarm vervolgens de monsters gedurende vijf minuten op 120 graden Celsius om eventuele sporen van oplosmiddel te verdampen. Nadat de monsters gedurende ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur zijn afgekoeld, gebruikt u 18,2 mega ohm centimeter water om de monsters in de schaal te bedekken en incubeert u op kamertemperatuur gedurende acht minuten. Gebruik na de incubatie een scheermes om de onderleggers van de petrischaal te pellen.
Gebruik vervolgens een pincet om eventuele onvolkomenheden van de rand van de onderleggers te verwijderen en laat de monsters aan de lucht drogen. Omdat PLLA afbreekbaar is door hydrolyse, bewaar de monsters in een vacuüm droogkast tot de dag van het experiment. Bovendien kunnen ELLA-vezels worden geproduceerd volgens het tekstprotocol en worden gebruikt als dorsaal substraat onder een steriele kweekkap.
Voeg 20 microgram per milliliter van FI nin in docos PBS of DPBS met calcium en magnesium toe aan de monsters en incubeer op kamertemperatuur gedurende één uur na de eiwitcoating. Gebruik DPBS om de monsters twee keer te wassen en bewaar in DPBS met P calcium en magnesium tot ze klaar zijn om te gebruiken. Zaai vervolgens cellen op glasdekjes en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende drie uur om de cellen te laten hechten aan het ventrale substraat. Breng vervolgens de monsters over naar nieuwe putjes van een 12-puttenplaat.
Gebruik een pincet om voorzichtig het dorsale substraat op de cellen te leggen. Voeg vervolgens één milliliter medium toe. Het gewicht van de onderlegger zal voorkomen dat het dorsale substraat drijft.
Breng de monsters terug naar 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide, ververs het medium twee keer per week om celmigratie binnen de sandwich-achtige cultuur te bestuderen. Na het coaten van de ventrale en dorsale substraten met fibronectine zoals eerder aangetoond, zaai cellen op glasdekjes met een hoge dichtheid, incubeer de monsters en laat de cellen confluentie bereiken. Gebruik vervolgens een pipetpunt om de cellage te krabben om twee celpopulaties te creëren die gescheiden zijn door een opening.
Plaats het ventrale gezette substraat in een nieuw putje dat geschikt is voor time-lapse acquisitie en groot genoeg is om dorsale substraten erin te passen. Gebruik vervolgens, zoals eerder aangetoond, een pincet om het dorsale substraat op de cellen te leggen en vul het bij met medium. Plaats het monster onder een time-lapse microscoop en leg beelden vast van de sluiting van de opening elke 20 minuten.
Gebruik software zoals mito BO van Image J om de sluiting van de opening in de sandwich te analyseren. De sulfaat is sterk afhankelijk van het moment waarop de dorsale receptoren worden gestimuleerd en door de eigenschappen van de dorsale interactie.
Net als bij andere 3D-systemen zoals hydrogels, zoals hier te zien is, leiden dorsaal elektrogesponnen PLLA-vezels tot celuitlijning wanneer ze zijn gecoat met fibronectine, maar niet wanneer ze zijn gecoat met een niet-klevend eiwit zoals BSA. Bovendien veroorzaakten sandwich-achtige culturen met een gewoon dorsaal PLLA een toename van het niveau van myogenese met behulp van C twee C 12-cellen. Dit hangt ook af van de dorsale biologische stimuli.
Omdat de interactie met verschillende dorsale eiwitten resulteert in verschillende differentiatiesnelheden zoals aangetoond in deze video, nemen fibroblasten die migreren binnen de sandwich-achtige cultuur in een wondgenezingsassay een langwerpige morfologie aan en migreren over kortere afstanden vergeleken met cellen. Gecultiveerd op 2D-substraten, vergelijkbaar met 3D fibronectine en collageengels. Sandwich-achtige cultivering verhoogt celgemedieerde ECM-reorganisatie in vergelijking met 2D-condities.
Dit proces is afhankelijk van de dorsale mechanische stimuli en cytoskeletstabiliteit. Omdat het gebruik van contractiliteitremmers zoals BLEs, statin de processen heeft belemmerd, is het duidelijk dat na het bekijken van deze video, u een duidelijk begrip moet hebben van hoe u sandwich-achtige culturen kunt assembleren. Deze methode kan een 3D-achtig micro-omgeving ontwerpen voor reactief medicijn en kanker, inclusief toepassingen in ziektemodellen, ontwikkelingsstudies en medicijntesten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de assemblage van sandwich-achtige culturen om 2D- en 3D-cellulaire omgevingen met elkaar te verbinden. Deze ontwikkelde systemen zijn toepasbaar in diverse biologische assays.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Biochemie
- Microscopie
Achtergrond
- Sandwich-achtige culturen bieden een fysiologisch relevantere omgeving voor het bestuderen van celgedrag.
- Deze culturen maken dubbele stimulatie van cellen mogelijk, zowel vanaf de ventrale als de dorsale zijde.
- Standaard 2D-cultuurtechnieken kunnen worden aangepast voor deze systemen.
- Toepassingen omvatten wondgenezingsassays en live-imaging.
Doel van de studie
- Om een relevantere 3D-omgeving te creëren voor cellulaire studies.
- Om het celgedrag onder dubbele stimulatiecondities te analyseren.
- Om het gebruik van gevestigde 2D-analysetechnieken in een 3D-context te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding en coating van substraten met proteïnen zoals fibronectine.
- Uitplaten van cellen vergelijkbaar met standaard 2D-culturen.
- Het overdekken met het dorsale substraat om de cellen te stimuleren.
- Het uitvoeren van assays zoals wondgenezing en live imaging.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle assemblage van sandwich-achtige culturen.
- Aantoonde effecten van dubbele stimulatie op het celgedrag.
- Adaptatie van 2D-analysemethoden voor 3D-culturen.
- Inzichten in cellulaire responsen in een complexere omgeving.
Conclusies
- Sandwich-achtige culturen verbeteren de studie van celgedrag.
- Deze systemen kunnen de kloof tussen 2D- en 3D-omgevingen overbruggen.
- Verdere toepassingen in diverse biologische assays zijn veelbelovend.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Sandwich-achtige culturen overbruggen de translationele kloof tussen oversimplificeerde 2D-modellen en complexe 3D-systemen door tweezijdige receptorstimulatie mogelijk te maken. Deze aanpak verhoogt de fysiologische relevantie terwijl de compatibiliteit met gevestigde 2D-analytische workflows behouden blijft. Het ondersteunt het vroegtijdig verminderen van mechanistische risico's bij targetvalidatie en fenotypische screening door instelbare micro-omgevingen te bieden die in vivo interacties met de extracellulaire matrix nabootsen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door gelijktijdige ventrale en dorsale receptorstimulatie, waardoor pathway-specifieke signaleringsbijdragen worden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij functionele targets door micro-omgevingsvariabelen die het celgedrag beïnvloeden te isoleren in een gecontroleerd, reproduceerbaar formaat.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-engagement door het celgedrag te verschuiven naar 3D-achtige fenotypen, wat de overeenstemming met in vivo responsen verbetert.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt systematische screening van materiaaleigenschappen (topografie, stijfheid, eiwitcoating) op zowel ventrale als dorsale oppervlakken mogelijk om optimale bioactieve interfaces te identificeren.
- Operationele waarde: Faciliteert standaardisatie van assays door gebruik te maken van bestaande 2D-compatibele read-outs (bijv. wondgenezing, immunofluorescentie) zonder dat gespecialiseerde 3D-beeldvormings- of extractieprotocollen vereist zijn.
- Schaalbaarheid: Maakt parallel testen van variaties in het dorsale substraat onder consistente ventrale condities mogelijk, wat medium-throughput screeningcampagnes ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en preklinische stadia door analytische consistentie te waarborgen van 2D-screening tot fenotypische beoordeling die relevant is voor 3D.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit in studies naar targetmodulatie door te controleren voor dorsale micro-omgevingsinvloeden die de interpretatie van stimuli die enkel ventraal zijn kunnen bemoeilijken.
- Relevantie voor ziektemodellen: Ondersteunt de modellering van stromale-epitheliale interacties bij fibrose of kanker, waarbij bidirectionele signalering de fenotypische uitkomsten beïnvloedt.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode integreert in vroege discovery-workflows door targetvalidatie-assays te verbeteren en structure-activity relationship-studies naar biomateriaal-celinteracties mogelijk te maken voorafgaand aan de leadidentificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen met betrekking tot integrine-signalering, mechanotransductie en matrixremodellering door ventrale en dorsale signalen onafhankelijk af te stemmen.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare fenotypische resultaten (bijv. migratiesnelheid, uitlijning, ECM-reorganisatie) die compatibel zijn met high-content imaging-platforms.
- Analytics: Genereert meetbare afhankelijke variabelen, zoals gap-sluitingssnelheden en cytoskeletale organisatie, die statistische vergelijkingen tussen verschillende materiaalomstandigheden mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Bevordert de continuïteit met preklinisch werk door cel-fenotypen te produceren (bijv. verlengde morfologie, gerichte migratie) die worden waargenomen in 3D-matrices zoals collageengelaten.
- Enterprise-hergebruik: Functioneert als een modulair platform dat aanpasbaar is voor verschillende celtypen en eiwitcoatings, waardoor de noodzaak voor revalidatie wordt verminderd bij het verkennen van nieuwe targets of biomaterialen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door het verminderen van fout-positieven die voortkomen uit oversimplificeerde modellen met uitsluitend ventrale stimulatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door het mogelijk maken van het gebruik van gevestigde 2D-protocollen voor seeding, kleuring en imaging.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen eerder in de pipeline door micro-omgevingsafhankelijke target-effectiviteit te onthullen die in 2D over het hoofd zou kunnen worden gezien.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets of biomaterialen mogelijk op basis van hun prestaties onder dubbele stimulatiecondities die de weefselcomplexiteit beter weerspiegelen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, eiwitcoating en micro-omgevingsengineering om consistente dorso-ventrale stimulatie te waarborgen.
- Is afhankelijk van toegang tot apparatuur voor solvent casting en steriele kappen voor het vervaardigen van reproduceerbare dorsale substraten (bijv. PLLA-films of vezels).
- Vereist standaardisatie van eiwitcoatingconcentraties en incubatietijden over ventrale en dorsale oppervlakken om storende variabiliteit te voorkomen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar niet-adhesieve of snel degraderende biomaterialen die de integriteit van het dorsale substraat kunnen compromitteren.
- Wordt beperkt door de noodzaak van optische helderheid in dorsale substraten voor downstream imaging, wat het gebruik van ondoorzichtige of sterk verstrooiende materialen beperkt.
