Name: Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Leer hoe je sandwich-achtige celculturen assembleert om gedrag in 3D-microomgevingen te bestuderen. Deze methode maakt dubbele stimulatie en wondheling-assays mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De steun van ERC via HealInSynergy (306990) en het FPU-programma AP2009-3626 wordt erkent.

1. De productie van Dorsale Substrates <ol><li> Productie van een vlakke film van PLLA door oplosmiddel gieten. <ol><li> Werk in een zuurkast aan een oplossing van 2% (w / v) PLLA in chloroform (2 g PLLA in 100 ml chloroform) te bereiden door roeren bij kamertemperatuur (KT) tot het volledig is opgelost (ongeveer 3 uur). </li><li> Leg de ringen op een glazen petrischaal. Opmerking: Gebruik roestvrij stalen ringen met een inwendige diameter van 10,5 mm (iets kleiner dan de ventrale sample diameter) zodat de ring bovenop het ventrale substraat wordt geplaatst. Andere materialen zoals polytetrafluorethyleen (PTFE) of glazenreiniger kunnen eveneens worden gebruikt. </li><li> Voeg 200 ul van de PLLA oplossing in de wasmachine en laat verdampen langzaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Om de langzame verdamping van het oplosmiddel mogelijk te maken, sluit de petrischaal met aluminiumfolie met een paar gaten. </li><li> Verwarm de monsters bij 120 ° C gedurende 5 min teneinde het oplosmiddel te verdampen sporen. </li><li> Laat monsters koel te doenwn bij KT. </li><li> Zodra monsters afgekoeld (30 min ongeveer), dek af met 18,2 MQ · cm water in de petrischaal en incubeer gedurende 8 min bij RT. Opmerking: als monsters worden niet volledig afgekoeld, kunnen ze duren 18.2 MQ · cm water en neemt een rubberachtige toestand. Bovendien incuberen bij 18,2 MQ-cm water gedurende minder dan 8 min kan leiden tot onjuiste onthechting, en meer dan 8 minuten in onthechting van de wasmachine. </li><li> Met een scheermesje, wrikken de ringen om ze te pellen de petrischaal. </li><li> Verwijder eventuele onvolkomenheden van de rand van de ring met een pincet en laat de monsters lucht drogen. </li><li> Bewaar de monsters in een vacuüm exsiccator (80 mbar) tot de dag van het experiment omdat PLLA afbreekbaar door hydrolyse. </li></ol></li><li> Productie van PLLA vezels door electrospinning. <ol><li> Werk in een zuurkast met een oplossing van 8% (w / v) PLLA in hexafluorisopropanol (8 g PLLA in 100 ml hexafluorisopropanol) door oproeren voorbereidinging bij RT totdat het volledig is opgelost (3 uur ongeveer). </li><li> Plaats de polytetrafluorethyleen (PTFE) ringen op een aluminium plaat of een trommel voor het electrospinning om willekeurige of uitgelijnde vezels respectievelijk krijgen. Opmerking: Gebruik polytetrafluorethyleen (PTFE) ringen met een inwendige diameter van 10,5 mm (iets kleiner dan de ventrale sample diameter) zodat de ring bovenop het ventrale substraat wordt geplaatst. Andere materialen zoals roestvrij staal of glas ringen kunnen ook worden gebruikt. De trommel moet draaien met een hoeksnelheid van 160,7 sec -1 (radius = 7 cm) teneinde uitgelijnde vezels te verkrijgen. Een lagere snelheid kan glasvezel uitlijning niet leiden en een hogere snelheid zal resulteren in gebroken vezels. </li><li> Laad de spuit met het polymeer-oplossing en plaats het op de injectiepomp. </li><li> Electrospin de PLLA oplossing met een 0,9 ml / uur stroomsnelheid een spanning van 30 kV en een collector afstand van 12 cm. </li><li> Stop de elektrospinproces achterdeker 20-30 min, tot er een goede vezeldichtheid wordt bereikt (omdat cellen tegelijkertijd communiceren met een aantal vezels). </li><li> Verwarm de monsters bij 120 ° C gedurende 5 min teneinde het oplosmiddel te verdampen sporen. </li><li> Bewaar de monsters in een vacuüm exsiccator (80 mbar) tot de dag van het experiment omdat PLLA afbreekbaar door hydrolyse. </li></ol></li></ol> 2. Sandwich Cultuur <ol><li> Monteer de sandwich-achtige cultuur eenmaal cellen worden nageleefd het ventrale 2D-substraat. <ol><li> Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min. </li><li> Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in Dulbecco&#39;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2 + en Mg2 + (200 ul / svoldoende) gedurende 1 uur. Opmerking: Als gevolg van het fabricageproces, dorsale substraten aangewezen boven- en onderzijde, omdat het oplosmiddel gegoten film en electrospun vezels bevestigd aan één van de zijden van de ring. Deze zijde is daarom één op de cellen (Figuur 3). <ol><li> Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBS om eiwit te verwijderen boven. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zorgt ervoor eiwit denaturalisatie. Gebruik DPBS met Ca 2+ en Mg 2+ sinds divalente kationen reguleren eiwitvouwing. </li></ol></li><li> Zaad cellen op de dekglaasjes 13. Opmerking: Als de sandwich-achtige cultuur gebaseerd 2D substraten zal zaaien van cellen op soortgelijke wijze worden uitgevoerd als een 2D monster. Zo worden C2C12 myoblast gezaaid met 17.500 cellen cm -1 differentiatie experimenten en NIH3T3 fibroblasten worden uitgezet met 7000 cells cm -1 voor geïsoleerde culturen naar cel morfologie en de hechting te bestuderen. </li><li> Plaats de monsters in een incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 en laat cellen hechten aan de ventrale substraat voor 3 uur. </li><li> Plaats de ventrale gezaaide substraat in een nieuw putje van een 12 plaat met meerdere holtes (indien sluitringen past). Opmerking: Montage van de sandwich-achtige cultuur in een nieuwe put is een manier om zich te ontdoen van de cellen die zijn toegetreden tot de bodem van de put na het zaaien, omdat deze voedingsstoffen verbruikt en scheiden groeifactoren en afval dat cellen gekweekt in het beïnvloeden sandwich-achtig systeem. Dit is ook een must voor mobiele extracties om alleen de cellen gekweekt in de sandwich-achtige omgeving lyseren. </li><li> Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen. Bijvullen medium (1 ml) en incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2. Opmerking: Het gewicht van de ring wordt voorkomen dat de dorsale subStrate drijven. </li><li> Verander het medium tweemaal per week in standaard 2D kweken. Verplaats de dorsale substraat omdat dit kan leiden tot beschadiging van cellen. </li></ol></li><li> Monteer de sandwich-achtige cultuur net na cel zaaien. <ol><li> Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min. </li><li> Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in DPBS bevat Ca2 + en Mg2 + (200 ul / monster) gedurende 1 uur. <ol><li> Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBS om eiwit te verwijderen boven. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zorgt ervoor eiwit denaturalisatie. Gebruik DPBS met Ca 2+ en Mg <sup&gt; 2+ sinds divalente kationen reguleren eiwitvouwing. </li></ol></li><li> Zaad cellen op dekglaasjes in een putje van een 12 multi-well plaat (waar ringen past). Om dit te doen, gebruik maken van een zeer geconcentreerd cellulaire schorsing naar cel verlies na het leggen van de dorsale substraat te vermijden. </li><li> Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen. Bijvullen medium (1 ml) en incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2. Opmerking: Het gewicht van de ring voorkomt dat de dorsale ondergrond drijven. </li><li> Verander het medium tweemaal per week in standaard 2D kweken. Opmerking: Verplaats de dorsale substraat omdat dit kan leiden tot beschadiging van cellen. </li></ol></li></ol> 3. Analyse Opmerking: sandwich-achtige cultures op basis van 2D-substraten, en zo kunnen gezamenlijk worden geanalyseerd door reeds ontwikkeld voor standaard 2D-kweken procedures. Bijvoorbeeld, omdat PLLA transparant en CELls worden gedwongen om te verhuizen binnen het xy-vlak, wordt microscopie gedaan Op 2D substraten. Celmigratie kan derhalve worden opgevat als 2D kweken, zonder het bijhouden cellen in de z-as als voor 3D-culturen, waarbij het experiment en beeldanalyse vereenvoudigt. Om de wondgenezing assay bestuderen door een kras-test volgt dit protocol: <ol><li> Studie celmigratie (wondgenezing assay) binnen de sandwich-achtige cultuur. <ol><li> Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min. </li><li> Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in Dulbecco&#39;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2 + en Mg2 + gedurende 1 uur. <ol><li> Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBSom eiwitten te verwijderen in overmaat. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zou kunnen eiwit denaturalisatie veroorzaken. Gebruik DPBS met Ca 2+ en Mg 2+ sinds divalente kationen reguleren eiwitvouwing. </li></ol></li><li> Zaad cellen op de dekglaasjes bij een hoge dichtheid 13. </li><li> Plaats de monsters in een incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 en laat cellen confluentie bereiken. </li><li> Gebruik een pipet om krassen op de cel monolaag om 2 celpopulaties gescheiden door een spleet te krijgen. </li><li> Plaats de ventrale geplaatste substraat in een nieuw goed geschikt is voor de time-lapse acquisitie en waar de dorsale substraten passen (dwz 12 multi-well plaat). </li><li> Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen en vervolgens vullen met medium (1 ml van een 12 multi-well plate). Opmerking: Het gewicht van de ring voorkomt tHij dorsale ondergrond drijven. </li><li> Het monster wordt in de time-lapse microscoop (ingesteld op 37 ° C en 5% CO2) en neemt beelden van de gap closure elke 20 min. </li><li> Analyseer de gap closure met behulp van specifieke software zoals de plugin MiToBo van ImageJ. 14 </li></ol></li></ol> Opmerking: Eiwit en nucleïnezuur extractie wordt op soortgelijke wijze uitgevoerd als 2D substraten. Er is maar één extra stap die bestaat uit het demonteren van de sandwich-achtige cultuur aan de lysis buffer direct aan de cellen toe te voegen om de extractie-efficiëntie te verhogen. Bijvoorbeeld voor mRNA extractie: <ol start="2"><li> Uittreksel mRNA van Sandwich-achtige culturen <ol><li> Bereid de buffers van de commerciële kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Neem de sandwich-achtige cultuur uit de incubator. </li><li> Verwijder het kweekmedium van de monsters. </li><li> Was de monsters eenmaal met DPBS bevattende Ca2+ en Mg 2+ (1 ml) en verwijder alle oplossing. </li><li> Met behulp van een pincet, verwijder de dorsale substraat en voeg de lysis buffer (350 pl) aan de ventrale substraat. Overlay opnieuw de dorsale substraat op de ventrale substraat teneinde ook lyseren van de cellen gehecht aan de dorsale substraat. </li><li> Verwijder de dorsale substraat om de lysisoplossing isoleren. </li><li> Volg de instructies van de fabrikant om het mRNA te krijgen. </li></ol></li></ol> Opmerking: Immunodetectie van eiwitten kan ook worden uitgevoerd vanaf Op 2D substraten. Aangezien sandwich-achtige culturen juiste verspreiding van de antilichamen en buffers kunnen belemmeren, incubatietijden worden verhoogd. Ook kan de sandwich worden gedemonteerd alvorens de kleuringsprotocol maar in dit laatste geval enige cellen blijven aan de dorsale substraat en een aantal op de ventrale substraat. <ol start="3"><li> Immunodetect eiwitten binnen een sandwich-achtige cultuur <ol&gt; <li> Was eenmaal het monster met DPBS en bevestig met 4% formaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Opmerking: dorsale substraat gedurende het fixatieproces zodat diffusieprobleem vermeden worden verwijderd. </li><li> Spoelen met DPBS (1 ml) en vervolgens doorlaatbaar met 0,5% Triton X-100 in DPBS (1 ml) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 1% albumine in DPBS (1 ml) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer met primaire antilichaam (2 ug / ml, 1 ml) in blokkerende oplossing gedurende 3 uur bij KT. </li><li> Was 3 maal gedurende 10 min met DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml). </li><li> Incubeer 2 uur met secundaire antilichamen (2 gg / ml) en 1 ug / ml DAPI in blokkeeroplossing (1 ml) bij RT. </li><li> Was 3 maal gedurende 10 min in DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml). </li><li> Was in DPBS. Opmerking: Monsters kunnen op een dia met Vectashield gemonteerd worden en verzegeld met nagellak wanneer dorsale substraten voorafgaand worden verwijderd van de immunodetectie. </li><li> Let op onder de fluorescentie microtoepassingsgebied voor standaard 2D substraten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).</li>
<li>Ruffner, H., Lichtenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems--towards+primary+drug+discovery+platforms%3A+an+interview+with+Heinz+Ruffner+%28Novartis%29+and+Jan+Lichtenberg+%28InSphero%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero).</a> Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).</li>
<li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).</li>
<li>Schor, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%27sandwich%27+assay+for+quantifying+chemo-regulated+cell+migration+within+3-dimensional+matrices%3A+wound+healing+cytokines+exhibit+distinct+motogenic+activities+compared+to+the+transmembrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).</li>
<li>Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+system+for+the+assessment+of+cell+migration+on+3D+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).</li>
<li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+and+ventral+stimuli+in+sandwich-like+microenvironments.+Effect+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions%3A+effect+on+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39(2012).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Glaß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Migration+Analysis%3A+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recogn%22%5BJournal%5D)">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell%2Fmatrix+interface+to+control+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulatory+effects+of+a+three-dimensional+microenvironment+on+cell-mediated+fibronectin+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Tegenwoordig 3D cultuur is een belangrijk onderwerp voor de farmaceutische en biotechnologische industrie, alsmede onderzoek in de celbiologie, met inbegrip van kanker en stamcellen. Bijgevolg meerdere 3D kweeksystemen ontwikkeld. Helaas, de verschillen tussen de 3D-systemen meestal resulteren in verschillende cel gedrag, belemmeren het begrip van cel lot. Trouwens, experimentele procedures zijn meestal niet zo eenvoudig als voor 2D kweeksystemen. Vandaar ontwikkeling van nieuwe kweeksystemen die overwinnen sommige van ...

Traditioneel is celcultuur uitgevoerd op tweedimensionale (2D) substraten, hoewel de meeste van de in vivo cellulaire micromilieus een driedimensionale (3D) aard. Deze onnatuurlijke 2D milieu veroorzaakt veranderingen in cel gedrag als een manier van zelf-aanpassing aan een platte wereld, die rechtstreeks invloed lot van de cel 1,2. Derhalve resultaten verkregen 2D celculturen niet altijd reproduceerbaar in vivo. Dit heeft de ontwikkeling van nieuwe relevante kweeksystemen die meer fysiologische-achtige omstandigheden verder inzicht in elke dimensie afhankelijk biologisch mechanisme 3,4 krijgen verschaffen aangemoedigd. Een van de belangrijkste verschillen tussen 2D cultuur en 3D in vivo omgeving is de verdeling van celreceptoren verankerd aan de extracellulaire matrix (ECM) dat 2D substraten cellen hechten ventraal, worden de meeste cellen in vivo volledig omringd door de ECM en dus cell hechting gebeurt door middel van een 3D verdeling van de receptoren. Dit brengt verschillende celadhesie signaalwegen daardoor belangrijke processen zoals celgroei, celdifferentiatie en genexpressie moduleren. Gedurende de laatste decennia hebben veel verschillende 3D ​​kweeksystemen vastgesteld 5-8, hoewel hun variabiliteit en complexiteit belemmeren hun normalisatie in cultuur procedures gemeenschappelijke cel. Bovendien 3D systemen zijn gewoonlijk moeilijk te hanteren en de huidige experimentele procedures 2D substraten kunnen niet gemakkelijk worden vastgesteld voor 3D-kweken. Bovendien, literatuur zelden vergelijkt 3D culturen met het equivalent 2D conditie of andere 3D-systemen, belemmeren de juiste begrip van de cel gedrag in deze modellen. Eens dat de cellen gehecht aan een 2D substraat, de excitatie van de dorsale receptoren - door bedekken een laag van een nieuw materiaal (sandwich-achtige kweek) - kan leiden celreacties zowel 3D-omgevingen. De reason hierachter is de gelijktijdige activatie van beide dorsale en ventrale receptoren te houden en verspreiding in de sandwich-omgeving (figuur 1) 9,10. Bijgevolg cellen ondergaan belangrijke verandering ten opzichte 2D culturen 11,12. Zo is lot van de cel bepaald tijdens de montage vanwege de sandwich cultuur, omdat de dorsale stimulatie triggers veranderingen in de belangrijkste cellulaire routes. Derhalve is het lot van de cel sterk bepaald door het tijdstip waarop de sandwich-achtige cultuur geassembleerd 11. Vanwege de aard van het systeem, een sandwich-achtige cultuur is een eenvoudig en veelzijdig instrument dat de studie van verschillende parameters in cel / materiaal interacties zoals chemie, topografie, stijfheid en eiwitten coatings zowel de ventrale en dorsale zijde toelaat. Dit biedt een grotere mate van flexibiliteit ten opzichte van andere 3D-systemen (Figuur 2) door de onafhankelijke dorsale en ventrale combinatie van een brede variety oppervlakte condities. Bovendien kunnen verschillende cellijnen en verschillende tijdstippen de sandwich-achtige kweek monteren bestudeerd, waardoor de brede spectrum van mogelijkheden. Een standaardprotocol van de sandwich-achtige kweek, wordt hieronder beschreven hetzij poly-L-melkzuur (PLLA) electrospun vezels of films dorsale substraten dekglaasje als ventrale substraat en fibronectine als eiwitbekleding. Sandwich-achtige culturen werden geassembleerd net na cel zaaien of na 3 uur van 2D-cultuur. Echter, er rekening mee dat andere materiële systemen en eiwitten kunnen worden gebruikt; ook de sandwich-achtige cultuur kan worden gemonteerd op verschillende tijdstippen.

<table><tbody><tr><td>Ploy(melkzuur)</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Dekglasjes (12 mm&Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP)</td><td>Sigma</td><td>105228</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Spuit (1 ml)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1000</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Hoogspannings DC-voeding</td><td>Glassman High Voltage</td><td>Serie FC</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hucoa-Herl&ouml;s</td><td>3111</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Laminairstroomkast</td><td>Telstar</td><td>AV30/70</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Human Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Inverteer microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Reagens</td></tr></tbody></table>

sandwich-achtige microenvironments harness cell / material interactions

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Celcultuur is van oudsher uitgevoerd op twee-dimensionale (2D) substraten waar de cellen hechten behulp ventrale receptoren aan het biomateriaal oppervlak. Echter in vivo meeste cellen zijn volledig omringd door de extracellulaire matrix (ECM), resulterend in een driedimensionale (3D) verdeling receptoren. Dit kan leiden tot verschillen in de buiten-signaalroutes en dus celgedrag. Dit artikel laat zien dat het stimuleren van de dorsale receptoren van de cellen al tot een 2D-substraat gehandeld door overlappen een film van een nieuw materiaal (een sandwich-achtige cultuur) triggers belangrijke wijzigingen ten opzichte van standaard 2D culturen. Verder is de gelijktijdige excitatie van ventrale en dorsale receptoren verschuift celgedrag dichter bij die gevonden in 3D omgevingen. Bovendien, vanwege de aard van het systeem, een sandwich-achtige cultuur is een veelzijdig instrument dat de studie van verschillende parameters in cel / materiaal inte toelaatractions bijvoorbeeld topografie, stijfheid en ander eiwit coatings op zowel de ventrale en dorsale zijde. Ten slotte, sandwich-achtige cultures op basis van 2D substraten verscheidene analyseprocedures reeds ontwikkeld voor standaard 2D kweken kan normaal worden gebruikt, overwinnen complexere procedures die nodig zijn voor 3D-systemen.

Het stimuleren van de dorsale receptoren binnen de sandwich-achtige cultuur triggers veranderingen in de cel morfologie, celadhesie en intracellulaire signaalwegen (bijv focale adhesie kinase, FAK) 10-12. Als voorbeeld, fibroblasten gekweekt in de sandwich-achtig systeem overexpressie de α 5 integrine subeenheid vergeleken met 2D, zoals waargenomen voor andere 3D culturen 15,16. Cell lot is sterk afhankelijk van het tijdstip waarop de dorsale recepto...

Het volgende protocol beschrijft de procedure om sandwich-achtige culturen te assembleren die kunnen worden gebruikt als een tussenstadium tussen bi-dimensionele (2D) en driedimensionale (3D) cellulaire omgevingen. De ontworpen systemen kunnen toepassingen hebben in microscopie, biomechanica, biochemie en celbiologie assays.

Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Het algemene doel van deze procedure is het samenstellen van sandwich-achtige culturen om het celgedrag binnen een fysiologisch relevantere 3D-omgeving te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de ventrale en dorsale substraten voor te bereiden en te coaten met proteïnen zoals fibronectine. Vervolgens worden de cellen uitgeplaatst op een vergelijkbare wijze als bij een standaard 2D-cultuur.Vervolgens wordt het dorsale substraat erop geplaatst, zodat de cellen zowel ventraal als dorsaal worden gestimuleerd. Ten slotte kunnen experimenten, zoals een wound healing assay, worden uitgevoerd. Uiteindelijk worden sandwich-achtige culturen geanalyseerd met procedures die reeds zijn ontwikkeld voor standaard 2D-culturen, zoals live imaging, immunofluorescentie of cellulaire extractie.Voor verdere analyse. Het belangrijkste voordeel van deze kweektechniek ten opzichte van bestaande driedimensionale systemen is dat het de studie van verschillende parameters in materiaalinteracties mogelijk maakte, zoals topografie, chemie, stijfheid en eiwitgehaltes op zowel de ventrale als dorsale zijden, wat een hoge mate van veelzijdigheid biedt. Naast experimentele procedures die bij sommige driedimensionale systemen belemmerd kunnen worden, kunnen technieken zoals lipine, immunofluorescentie en cellulaire extracties eenvoudig worden uitgevoerd. Om een platte film van polymelkzuur of PLLA te produceren via solvent casting, voegt u in een zuurkast twee gram PLLA toe aan 100 milliliters chloroform en roert u dit bij kamertemperatuur gedurende ongeveer drie uur of tot het volledig is opgelost.Plaats roestvrijstalen ringen op een glazen petrischaal. Voeg vervolgens 200 µL van de PLLA-oplossing toe aan de ringen. Gebruik aluminiumfolie met enkele gaatjes om de schaal af te dekken en laat de PLLA gedurende 30 minuten langzaam verdampen bij kamertemperatuur.Verhit vervolgens de monsters gedurende vijf minuten bij 120 °C om eventuele resten oplosmiddel te verdampen. Laat de monsters daarna ongeveer 30 minuten afkoelen tot kamertemperatuur, bedek de monsters in de schaal met 18,2 MΩ·cm water en incubeer ze gedurende acht minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na de incubatie een scheermesje om de ringetjes uit de Petrischaal te pellen.Gebruik vervolgens een pincet om eventuele onvolkomenheden van de rand van de ringetjes te verwijderen en laat de monsters aan de lucht drogen. Omdat PLLA via hydrolyse afbreekbaar is, moeten de monsters in een vacuümdesiccator worden bewaard tot de dag van de experimenten. Daarnaast kunnen ELLA-vezels worden geproduceerd volgens het tekstprotocol en worden gebruikt als dorsaal substraat onder een steriele kweekkap.Voeg 20 µg/mL fibronectine in DPBS met calcium en magnesium toe aan de monsters en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur na de eiwitcoating. Gebruik DPBS om de monsters twee keer te wassen en bewaar ze in DPBS met calcium en magnesium tot het gebruik. Zaai vervolgens cellen op de glazen dekglasjes en incubeer deze gedurende drie uur bij 37 °C met 5% CO2 om de cellen aan het substraat te laten hechten. Draag de monsters daarna over naar nieuwe putjes van een 12-wells plaat.Plaats met een pincet het dorsale substraat voorzichtig bovenop de cellen. Voeg vervolgens één milliliter medium toe. Het gewicht van de ringplaat voorkomt dat het dorsale substraat gaat drijven.Breng de monsters terug naar 37 °C met 5% koolstofdioxide en ververs het medium twee keer per week om de celmigratie binnen de sandwich-achtige cultuur te bestuderen. Nadat de ventrale en dorsale substraten met fibronectine zijn gecoat zoals eerder gedemonstreerd, worden de cellen met een hoge dichtheid op glazen dekglasjes gezaaid; incubeer de monsters en laat de cellen confluente worden. Gebruik vervolgens een pipetpunt om de cellaag open te krassen, zodat er twee celpopulaties ontstaan die door een opening van elkaar gescheiden zijn.Plaats het ventraal zittende substraat in een nieuwe well die geschikt is voor time-lapse acquisitie en groot genoeg is om de dorsale substraten erin te passen. Leg vervolgens met een pincet, zoals eerder gedemonstreerd, het dorsale substraat over de cellen en vul opnieuw aan met medium. Plaats het monster onder een time-lapse microscoop en leg elke 20 minuten beelden vast van de gap closure.Gebruik software zoals mito BO van Image J om de sluiting van de opening in de sandwich-cultuur te analyseren. Sulfaat is sterk afhankelijk van het tijdstip waarop de dorsale receptoren worden gestimuleerd en van de eigenschappen van de dorsale interactie.Vergelijkbaar met andere 3D-systemen, zoals hydrogels, bijvoorbeeld zoals hier te zien is, sturen dorsale elektrogesponnen PLLA-vezels de celuitlijning wanneer ze zijn gecoat met fibronectine, maar niet wanneer ze zijn gecoat met een niet-adhesief eiwit zoals BSA. Daarnaast veroorzaakten sandwich-achtige culturen met gewone dorsale PLLA een toename in het niveau van myogenese bij gebruik van C2C12-cellen. Dit is tevens afhankelijk van de dorsale biologische stimuli.Aangezien de interactie met verschillende dorsale eiwitten resulteert in uiteenlopende differentiatiesnelheden, zoals in deze video wordt aangetoond, nemen fibroblasten die migreren binnen de sandwich-achtige cultuur in een wondgenezingsassay een langgerekte morfologie aan en migreren zij kortere afstanden in vergelijking met cellen die worden gekweekt op 2D-substraten vergelijkbaar met 3D-fibronectine- en collageengels. Sandwich-achtige kweek verhoogt de celgemedieerde ECM-reorganisatie in vergelijking met 2D-condities.Dit proces is afhankelijk van dorsale mechanische stimuli en de stabiliteit van het cytoskelet. Aangezien het gebruik van contractiliteitsremmers zoals BLE's en statines het proces belemmerde S Oké, na het bekijken van deze video zou u een duidelijk begrip moeten hebben van hoe u sandwich-achtige culturen assembleert. Met deze methode kan een 3D-achtige micro-omgeving worden gecreëerd voor regeneratieve geneeskunde en kanker, inclusief toepassingen in ziekte-modellen, ontwikkelingsstudies en geneesmiddelentesten.

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit artikel beschrijft een experimentele benadering voor de dynamische regeling van cel-cel interacties tussen adherente cellen op een micrometer schaal. Manipulatie van intercellulaire communicatie tussen de hepatocyten en stromale cellen is aangetoond. De ontwikkelde platform maakt het onderzoek van cel-cel interacties in een verscheidenheid van biologische processen, waaronder de ontwikkeling en de pathogenese.

Silicon Microchips voor het manipuleren van Cel-cel interactie

Demonstreren we een eenvoudige methode voor het plaatsen van cellen op de gewenste locaties op een substraat. Deze methode patronen cellen door het opgooien van een siliconen chip met microwells gevuld met cellen op de ondergrond. Deze methode biedt een nieuwe manier te moduleren diffundeerbare en juxtacrine signalering tussen cellen.

Patroonvorming van embryonale stamcellen Met behulp van de Bio Flip Chip

Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo&#39;s in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

Micro-gefabriceerde apparaten geïntegreerd met vloeistofcomponenten bieden een in vitro platform voor celstudies die het in vivo micro-milieu nabootsen. We ontwikkelden op polymethylmethacrylaat gebaseerde microfluïdische chips voor het bestuderen van cellulaire reacties onder enkele of naast elkaar bestaande chemische/elektrische/schuifspanningsstimuli.

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie ter voorbereiding van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME)-array voor high-throughput manipulatie van fysische en chemische cues nabootsen in vivo cellulaire microenvironments en aan het identificeren van de optimale cellulaire omgeving voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met eencellige profilering.

Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer hoe je sandwich-achtige celculturen assembleert om gedrag in 3D-microomgevingen te bestuderen. Deze methode maakt dubbele stimulatie en wondheling-assays mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions

Meer video's verkennen