Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array

Deze methode kan helpen bij een belangrijke vraag in het veld van stamcelengineering, zoals hoe de cellulaire micro-omgeving de cellulaire fenotypes en functie verandert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het meerdere kunstmatig gecreëerde omgevingen biedt voor de cellen op een enkele plaat, wat u niet zou kunnen uitvoeren met een conventionele methode in een micro-contact plaat. Dit proces zal worden uitgevoerd door Koki Yoshimoto en Risako Sakai, technici uit ons laboratorium. Na het maken van 3D-beelden van maskers voor nanovezelarrays en mallen uit microfluïdische structuren volgens het tekstprotocol.

Gebruik een 3D-printer om de maskers en de mal te printen. Om polymeeroplossingen voor elektroverspinnen te bereiden, verdun 13 procent PMGI-vloeistof met tetrahydrofuran tot negen procent. Los 0,08 gram PS op in een een-op-een volumeverhouding van THF naar dimethylformamide en gebruik een vloeibaar reagens om het volume op te brengen tot de uiteindelijke één milliliter van acht procent gewicht per volume PS-oplossing.

Los 0,1 gram GT op in water, azijnzuur en ethylacetaat en gebruik de gemengde oplosmiddeloplossing om het volume op te brengen tot de uiteindelijke één milliliter van 10 procent gewicht per volume GT-oplossing. Gebruik vervolgens een magnetronsputteringmachine om een vijf nanometer dikke platina-laag op een polystyreen basisplaat te deponeren, die dient als kathode in de elektrospinopstelling. Laad elke polymeeroplossing in een vijf milliliter spuit uitgerust met een 23 gauge roestvrijstalen stompe naald.

Bevestig vervolgens de spuiten op een spuitpomp op 12 centimeter afstand van de collector van het elektrospinapparaat. Verbind de spuitnaald met een hoogspanningsvoeding en stel deze in op 11 kilovolt. Stel vervolgens de pompsnelheid in op 20 milliliter per uur en houd de temperatuur en luchtvochtigheid op respectievelijk 30 graden Celsius en minder dan 30 procent in volume.

Plaats nu het masker op de basisplaat. Fabriqueer vervolgens door de gaten van het masker nanovezels op de basisplaat met verschillende dichtheden door de elektrospintijd te veranderen. Verwijder het masker van de basisplaat en herhaal de nanovezelfabricage.

Wanneer de array voltooid is, plaats deze in een exsiccator bij 25 graden Celsius gedurende 16 uur om de resterende oplosmiddel te laten verdampen. Om de GT-nanovezels te verknopen, behandel ze met 0,2 molair EDC en 0,2 molair NHS in ethanol. En incubeer de monsters bij 25 graden Celsius gedurende vier uur.

Gebruik 99,5 procent ethanol om de GT-nanovezels te spoelen, twee keer en droog de platen in vacuüm bij 25 graden Celsius gedurende 16 uur. Om microfluïdische structuren te fabriceren, meng 2 gram PDMS-hardingsmiddel en 20 gram PDMS-basis. Giet vervolgens het voor-PDMS-mengsel op de gefabriceerde mal.

Ontgast het voor-PDMS-mengsel in een exsiccator gedurende 30 minuten. Vervolgens hard de voor-PDMS-mix in een oven bij 65 graden Celsius gedurende 16 uur. Om Macme-arrays te assembleren, pel de uitgeharde PDMS-structuur van de mal en gebruik 70 procent ethanol om het schoon te maken.

Ontlaad vervolgens de atmosferische corona aan de onderkant van de PDMS-structuur. Monteer snel de PDMS-structuur met de nanovezelarray. Bak vervolgens de assemblage gedurende twee dagen in een oven bij 65 graden Celsius.

Gebruik DPBS om H9HESCs te wassen die op een 35 millimeter schaal zijn gekweekt. Voeg vervolgens 0,5 milliliter recombinante trypsinelichtprotease toe aan de schaal en incubeer deze gedurende één minuut bij 37 graden Celsius. Zuig voorzichtig het supernatant-proteasemengsel af.

Voeg onmiddellijk HPSC-medium toe en verdeel het medium voorzichtig tegen de schoteloppervlak herhaaldelijk om cellen te dissociëren. Breng vervolgens de losgekoppelde cellen over in een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de buis gedurende drie minuten bij 200 maal de zwaartekracht.

Zuig het supernatant af en suspendeer de cellen in voorverwarmd HPSC-medium. Pipetteer vervolgens 12 microliter van de celsuspensie in elke microfluïdische kamer. Nadat de cellen volgens het tekstprotocol fluorescent zijn gelabeld, pelt u de PDMS-microfluïdische structuur van de Macme-array af.

Verwijder vervolgens de resterende PBMS van de Macme-array, voeg 90 procent glycerol in PBS toe aan de gekleurde cellen en breng een dekglas aan. Zet tenslotte de plaat ondersteboven op de stage van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Gebruik de microscoopbeeldsoftware om 12-bits kleurenbeelden te verkrijgen.

Hier getoond zijn immunofluorescentiebeelden van H9HPSCs gekweekt bij hoge initiële zaaidichtheid op gelatine nanovezels en gekleurd met 3 cellulaire fenotypische markeringen. SOM-analyse werd gebruikt om hoogdimensionale multiparametrische datasets om te zetten in laagdimensionale 2D-kaarten voor het vergelijken van homogeniteit en heterogeniteit van expressieniveaus voor de vier fenotypische markeringen in elke dataset en onbegeleide hiërarchische clustering werd uitgevoerd voor de SOM-knooppunten. Zoals hier aangegeven, vertoonden alle groepen een hogere expressie van OCT4 dan waargenomen op basement membrane gel matrix, of MG. Groep één toonde hoge EdU-signalen, wat aangeeft dat de meeste cellen actief aan het prolifereren waren.

Dus, micro-omgevingen in groep één waren geschikt voor HPSC-onderhoud omdat ongedifferentieerde HPSC's snel prolifereren wanneer de fasen van de celcyclus worden ingekort. Groep twee omvatte cellen die bij een onvoldoende initiële dichtheid werden gezaaid en cellen die op 2D GT-schaluws die HPSC-zelfvernieuwing niet ondersteunden, groeiden. Bijvoorbeeld, het EdU-signaal van dit monster ging verloren en annexine V-niveaus waren licht verhoogd, wat aangeeft dat de cellen hun stamcelkarakter hadden verloren en geleidelijk aan apoptose waren geworden.

PMGI MidNF HighCD uit groep drie, die de micro-omgevingen vertegenwoordigt die bestaan uit PMGI nanovezelmatrices, vertoonde de grotere variaties in OCT4 en EdU-signalen vergeleken met de andere omstandigheden. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de