Voorbereiding van neutraal geladen, pH-responsieve polymere nanodeeltjes voor cytosolische siRNA levering

Het huidige protocol is belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om siRNA geladen nanodeeltjes te produceren en deze nanodeeltjes adequaat te karakteriseren om hun geschiktheid voor toediening aan dieren voorafgaand aan latere studies te waarborgen. Het voordeel van deze aanpak is het produceren van nanodeeltjes die de biologische beschikbaarheid van siRNA verhogen en nanodeeltjes produceren die neutraal geladen zijn en dus geschikt zijn voor systemische toediening. Deze techniek is impactful omdat siRNA nanodeeltjes kunnen worden toegepast voor de behandeling van een groot aantal ziekten die systemische toediening, waaronder kanker, hart-en vaatziekten, en auto-immuunziekten, onder anderen.

Los om te beginnen polymeer op in ethanol met een concentratie van 33,3 milligram per milliliter en roer om ontbinding te garanderen. Gebruik vervolgens een pipet om polymeeroplossing over te brengen in 10 millimolar citroenzuurbuffer om een concentratie van 3,33 milligram per milliliter te bereiken. Voeg gedestilleerd water toe in een buis met klein storend RNA om een concentratie van 50 micromolar te bereiken.

Meng het polymeer en kleine storende RNA-oplossingen grondig in een buis door op en neer te pipetten om een stikstof-fosfaatverhouding van 10 te bereiken. Plaats de buis 30 minuten op omgevingstemperatuur. Voeg vervolgens een milliliter fosfaatbuffer van 10 millimolar bij pH acht aan de buis toe om een concentratie van 0,28 milligram per milliliter te bereiken en meng voorzichtig door de buis te pipetten of om te keren.

Om te bevestigen dat de uiteindelijke pH neutraal is, rond 7,2 tot 7,5, pipette 10 microliters van de kleine storende RNA nanodeeltjes oplossing op de pH-teststrips. Bereid eerst een dynamisch lichtverstrooiingsmonster voor door een milliliter kleine storende RNA-nanodeeltjes te filteren met een concentratie van 0,28 milligram per milliliter tot 0,45 micrometer poriegroottespuitfilters in een vierkant kwarts of polystyreen cuvette. Noteert vervolgens maat- en oppervlakteladingmetingen met behulp van een dynamisch lichtverstrooiingsinstrument volgens de specificaties van de fabrikant.

Om de grootte en morfologie van kleine storende RNA nanodeeltjes met behulp van transmissie elektronen microscopie eerst vijf microliters van gefilterde kleine storende RNA nanodeeltjes oplossing op 0,28 milligram per milliliter toe te voegen aan elk TEM-raster. Plaats de roosters gedurende 60 seconden op omgevingstemperatuur. Dep drie seconden droog met filterpapier.

Voeg vervolgens vijf microliters van 3% uranylacetaatoplossing toe aan elk raster en broed gedurende 20 seconden in. Dep drie seconden droog. Plaats vervolgens de rasters in een desiccator om 's nachts te drogen voordat beeldvorming onder transmissie elektronenmicroscopie.

Om agarose gel retardatie uit te voeren, voeg eerst twee gram elektroforese-grade agarose poeder aan 100 milliliter 1x Tris-paraceaat-EDTA buffer bij pH acht in een beker om 2%agarose gel te produceren. Roer om de agarose op te schorten. Plaats de beker onbedekt in een magnetron te verwarmen voor een tot drie minuten totdat alle agarose is opgelost.

Eenmaal afgekoeld, voeg vijf microliter ethidium bromide bij de concentratie van 10 milligram per milliliter in het bekerglas en meng goed. Giet vervolgens de agarose in een gellade en plaats kam om putten te produceren. Laat de gel 30 minuten drogen.

Verwijder voorzichtig de kam om laadputten achter te laten en giet 1X Tris-acetaat-EDTA buffer in de gellade om te vullen tot de maximale vullijn. Plaats vervolgens twee microliter aliquots van ladingskleurstof zonder SDS of het verminderen van agenten op paraffinefilm voor elke kleine storende RNA nanodeeltjesformulering bij verschillende stikstof-fosfaatverhoudingen. Pipette om 10 microliters van kleine storende RNA nanodeeltjesoplossing te mengen met het laden van kleurstof op paraffinefilm.

Voeg het mengsel toe aan agarose gel putten. Sluit het elektroforesesysteem aan op een voeding en voer de spanningsbron gedurende 35 minuten op 100 volt of totdat monsters 80% van de gellengte hebben doorkruist. Breng de gel van de lade naar een UV-transilluminator en visualiseer de kleine storende RNA-banden op de UV-transilluminator volgens de specificaties van de fabrikant.

Bepaal de optimale stikstof-fosfaatverhouding op basis van het verdwijnen van kleine storende RNA-banden aan de onderkant van de gel. Om modelgen luciferase neer te halen, eerste zaad luciferase-uitdrukkende cellen in een 96-goed zwarte ommuurde plaat met DMEM in 10%FBS bij een dichtheid van 2.000 cellen per put. Plaats de plaat 's nachts in een couveuse om de cellen te laten hechten.

Verwijder 's ochtends media en voeg 10 microliter per put van kleine storende RNA-nanodeeltjes toe die in volledige serummedia worden verdund voor een laatste kleine RNA-concentratie van 100 nanomolar. Breng de putten 24 uur terug naar de couveuse om de cellen te behandelen met kleine storende RNA nanodeeltjes. De volgende dag, vervang media door volledige serum media met 150 microgram per milliliter D-luciferin.

Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten voordat u luminescentie meet op een plaatlezer. Herhaal vervolgens twee maal de mediaverfrising met verse volledige serummedia vrij van D-luciferin, gevolgd door incubatie gedurende 24 uur. Vervang de media door volledige serummedia met 150 milligram per milliliter D-luciferin en incubbate vijf minuten bij kamertemperatuur.

Meet de luminescentie op het tijdspunt van 48 uur. Voor longitudinale studies, laat deksel op de top van de put plaat wanneer buiten de biosafety kast om cellen te onderhouden onder steriele omstandigheden en de incubatie voort te zetten na het vervangen van luciferin-bevattende media met verse volledige media. Dynamische lichtverstrooiingsmetingen tonen aan dat kleine storende RNA nanodeeltjes een gemiddelde diameter van 35 nanometer heeft.

De aanwezigheid van een enkele piek met smalle piekbreedte duidt op een unimodale verdeling en een lage polydispersiteit. TEM-metingen bevestigen de groottemeting van dynamische lichtverstrooiing suggereert de aanwezigheid van een uniforme populatie van kleine storende RNA-nanodeeltjes en onthulden de bolvormige morfologie van de kleine storende RNA-nanodeeltjes. Een te hoge concentratie polymeer in de voorbereidingsstap resulteerde voor kleine storende RNA nanodeeltjes twee in ongewenste diameter van meer dan 200 nanometer, een multimodale en polydispersed populatie, en aggregaten in oplossing die geen duidelijke deeltjesmorfologie vormt.

Zowel kleine storende RNA nanodeeltjes een en twee display neutrale oppervlakte lading aangegeven door bijna nul gemiddelde zeta potentiële waarden. Agarose gel retardatie test toont het verdwijnen van kleine storende RNA banden op de gel bodem die de complexiteit van kleine storende RNA aan polymeer aangeeft. Polymeer complex kleine storende RNA is niet in staat om te migreren door de gel en is dus gevisualiseerd aan de bovenkant van de gel in de buurt van de laadputten.

Naarmate de stikstof-fosfaatverhouding wordt verhoogd, neemt de kleine storende RNA-complexatie toe, zoals blijkt uit een verminderde intensiteit van de kleine storende RNA-band aan de gelbodem. Bioactieve luciferase kleine storende RNA nanodeeltjes vertoont men aanzienlijk verminderde luciferase activiteit in vergelijking met scrambled control. In tegenstelling, luciferase kleine storende RNA nanodeeltje twee wordt niet beschouwd als bioactief.

Om consistente siRNA nanodeeltjes met de gewenste fysischchemische eigenschappen te produceren, moet men polymeeroplossingen met de juiste concentraties gebruiken en de pH van de bufferoplossingen bij elke stap van het protocol valideren. Met behulp van deze methoden in ons onderzoek hebben we in staat geweest om siRNA nanodeeltjes gebaseerde therapieën te produceren voor eerder ondruggbare kankerverwekkende genen en de werkzaamheid van deze therapieën te testen in preklinische modellen van borstkanker.