Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets
April 18th, 2016
Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.
Het algemene doel van dit protocol is om een methode met hoge efficiëntie en hoge opbrengst te ontwikkelen voor het genereren van dendritische cellen of DC's, die hun in-vivo fenotypische en functionele divergentie fataal weerspiegelen. Dendritische cellen bestaan in grote populaties in lymfoïde organen. Daarom gebruiken we filterliganden om de frequentie van deze essentiële cellen in donorweefsels te verhogen om de isolatie te vergemakkelijken.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de generatie van alle DC-subsets verwijdert in geschikte aantallen voor analyse met behulp van alleen de commercieel verkrijgbare agentia. Om flt-3-liganden tot expressie brengende B16-melanoomcellen uit een 90% confluente cultuur te oogsten, was de cellen eerst met PBS en incubeer de cultuur met 05% trypsine bij 37 graden Celsius. Na 5 minuten, doof de protease-activiteit met 20 milliliter 4 graden Celsius compleet dima-medium en los de aangehechte celmodellaag los met licht tikken en voorzichtig pipetteren.
Verzamel de cellen door centrifugatie en tel ze. Spuit vervolgens de enkele celsuspensie opnieuw op tot een 1 keer tot 8 cellen per milliliter concentratie in PBS voor hun subcutane injectie in C57 zwarte 6 ontvangende muizen. Wanneer de tumor twee tot tien milliliter in diameter bereikt, oogst de milten van de tumordragende dieren en plaats de milten in een petrischaal met vers RPMI-medium.
Snij de weefsels met een scalpel in stukken van 0,2 vierkante centimeter en incubeer vervolgens de fragmenten in tien milliliter collagenase en Dnase bij 37 graden Celsius. Giet na 30 minuten de gedeeltelijk gedigesteerde weefselslurry op een 70 micron celsifter en gebruik een vijf milliliter spuitplunger om de resterende weefselfragmenten door het gaas van de zeef te persen. Spoel de filter met 10 milliliter vers medium, verzamel het wasmiddel met de rest van de enkele celsuspensie en pellet de cellen.
We suspenderen de celpellet in 2 milliliter rode bloedcellysebuffer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Was vervolgens de cellen in 10 milliliter vers RPMI-medium en suspendeer ze opnieuw in 1 keer 10 tot 8 cellen per milliliter in celsorteerbuffer die FC-blok bevat. Om de plasmacytode DC's te isoleren, meng 300 microliters biotin-gelabelde antilichaamcocktail uit een plasmacytode DC isolatiekit grondig met 200 microliters van de splenische enkele celsuspensie.
Plaats de cellen gedurende 15 minuten in een ijswaterbad, met elke drie minuten voorzichtig tikken. Was vervolgens de cellen met 12 milliliter celsorteerbuffer en suspendeer het pellet in 500 microliters verse sorteerbuffer. Incubeer vervolgens de cellen in 300 microliters anti-biotine, antilichaam-geconjugeerde kralen gedurende nog eens 15 minuten in het ijswater met regelmatig tikken.
Na het wassen van de cellen in verse sorteerbuffer, suspendeer de pallet opnieuw in 2 milliliter celsorteerbuffer en laad een geschikt gedimensioneerde magnetische kolom op zijn overeenkomstige magneet. Equilibreer de kolom met vijf milliliter verse 4 graden Celsius celsorteerbuffer. Wanneer al het buffer van de bovenkant van de kolom is gedraind, voeg de cellen voorzichtig toe aan het centrum van het oppervlak van de kolomkop en verzamel het flow-through.
Was vervolgens de kolom met 10 milliliter vers, 4 graden Celsius sorteerbuffer en verzamel het flow-through in dezelfde buis. Na passage door een tweede magnetische kolom kan een plasmacytode dendritische celpopulatie met een zuiverheid van meer dan 94% worden verwacht. Om de CD8aplha+ en CD8alpha-DC's te isoleren, meng de rest van de splenische celsuspensie met 100 microliters biotion-geconjugeerd antilichaamcocktail uit een CD8alpha+ dendritische celisolatiekit gedurende 15 minuten op ijs met voorzichtig tikken, zoals zojuist gedemonstreerd.
Aan het einde van de incubatie, was de cellen in 12 milliliter 4 graden Celsius celsorteerbuffer en suspendeer het pellet in 150 microliters verse 4 graden Celsius celsorteerbuffer. Meng vervolgens de cellen met 100 microliters van de CD8alpha+ dendritische celisolatiekit anti-biotinekralen. Was de cellen na 15 minuten op ijs met voorzichtig tikken in 10 milliliter 4 graden Celsius celsorteerbuffer en suspendeer het pellet in 1 milliliter verse 4 graden Celsius sorteerbuffer.
Aan het einde van de incubatie, sorteer de cellen door magnetische kralenscheiding, zoals zojuist gedemonstreerd, en verzamel het flow-through en de eerste was. Draai vervolgens de cellen omlaag en suspendeer het pellet in één milliliter verse 4 graden Celsius celsorteerbuffer. Label nu de cellen met 200 microliters anti-CD8aplha geconjugeerde magnetische kralen uit de kit en laat de cellen door een nieuwe kolom gaan, waarbij het CD8alpha-dendritische cel flow-through wordt verzameld.
Om de CD8alpha+DC's te verzamelen, breng de kolom over in een 15 milliliter conische buis en dompel 5 milliliter verse 4 graden Celsius celsorteerbuffer door de kolom. Na het doorlopen van de cellen door een tweede kolom, kan een CD8alpha+ dendritische celpopulatie van meer dan 96% worden verwacht. Om de CD8alpha-cellen te isoleren, draai de CD8alpha-flow-through celsuspensie.
Label vervolgens de cellen met 100 microliters anti-CD11 c-magnetische kralen en verzamel de magnetische kralenpositieve celpopulatie, zoals zojuist gedemonstreerd, om een CD8alpha-dendritische celsubsetpopulatie van meer dan 97% te verkrijgen. Bepaal ten slotte het aantal levende cellen door trypanblauwe uitsluiting. Zodra de tumor voelbaar wordt, vertonen de B16 flt-3-ligandentumordragende muizen consequent een dramatische toename van de splenische cellulariteit die correleert met de expansie van de splenische dendritische celsubsets.
Interessant is dat terwijl een 15 tot 20-voudige toename in de absolute celgetallen wordt waargenomen voor de conventionele DC's bij deze dieren, slechts een ongeveer 4-voudige toename wordt waargenomen voor de plasmacytode DC-subset. De verschillende dendritische celsubsets worden gekenmerkt volgens hun B220, CD11b, CD11c en CD8alpha-expressie. De celpopulaties vertonen ook andere unieke subsetmarkers, maar met mPDCA1 exclusief op de plasma
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van dendritische cellen (DC's) uit de milt van muizen. De techniek heeft tot doel DC's te genereren die nauwkeurig hun in-vivo kenmerken weerspiegelen, waardoor immunologische studies worden vergemakkelijkt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Dendritische celbiologie
- Celisolatietechnieken
Achtergrond
- Dendritische cellen zijn cruciaal voor immuunresponsen.
- Ze bestaan als zeldzame populaties in lymfatische organen.
- Isolatie van deze cellen is uitdagend vanwege hun lage abundantie.
- Huidige methoden leveren mogelijk onvoldoende hoeveelheden op voor analyse.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van alle belangrijke subsets van dendritische cellen uit de milt van muizen.
- Om het rendement en de zuiverheid van geïsoleerde DC's te verbeteren.
- Om verdere immunologische experimenten met deze cellen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Gebruik van filterligand om de DC-frequentie in donorweefsels te verhogen.
- Oogsten van flt-3 ligand-expresserende B16 melanoomcellen.
- Wassen en incuberen van cellen met trypsine voor detachering.
- Uitschakelen van protease-activiteit en isoleren van cellen voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- De methode genereert met succes dendritische cellen in geschikte aantallen.
- Alle belangrijke subsets van DC's kunnen effectief worden geïsoleerd.
- De techniek is gebaseerd op commercieel verkrijgbare agentia.
- Geïsoleerde DC's behouden hun in-vivo fenotypische en functionele kenmerken.
Conclusies
- Deze methode biedt een significante vooruitgang in dendritische celonderzoek.
- Het maakt een betere analyse van DC-subsets in immunologische studies mogelijk.
- De aanpak kan worden aangepast aan verschillende experimentele behoeften.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of functionally distinct mouse dendritic cell subsets enables robust target validation and mechanistic de-risking in immunology-focused drug discovery. This high-yield protocol supports comparative studies of antigen presentation and immune modulation, directly impacting early discovery and translational research pipelines. Reliable access to pure DC subsets enhances predictive confidence for immunotherapeutic portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antigen presentation pathways across distinct dendritic cell subsets.
- Supports functional target validation by isolating DCs with preserved in vivo phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking for immune-modulating therapeutic hypotheses.
- Provides a platform for comparative analysis of DC subset roles in T cell activation.
Screening & Assay Development
- Delivers high-purity, functionally intact DC subsets for standardized assay development.
- Improves reproducibility and scalability of immune cell-based screening workflows.
- Enables quantitative assessment of antigen presentation and T cell priming capacity.
- Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DC subset isolation with disease-relevant immune mechanisms for translational studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on functional immune readouts.
- Provides mechanistic insight into DC subset contributions to immune responses.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality DC subsets for hypothesis testing, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of antigen presentation and immune activation pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for evaluating immune-modulating compounds.
- Analytics: Enables measurement of subset-specific antigen presentation and T cell activation.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo immune mechanisms relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for isolating DC subsets across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Standardizes DC isolation for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology and cell isolation techniques.
- Needs access to magnetic bead separation systems and flow cytometry for subset validation.
- Demands strict sterility and antioxidant-free conditions to preserve DC functionality.
- Necessitates gentle handling to avoid altering DC maturation state.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or tissue sources.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
B16.Flt.3L Melanoma Harvest
1:40
Preparation of Splenic Single Cell Suspension from Tumor-bearing Mice
2:54
Plasmacytoid Dendritic Cell (DC) Isolation
4:35
CD8alpha+ and CD8alpha- DC Isolation
7:02
Results: Representative Splenic DC Subset Analysis from B16.Flt3L Tumor-bearing Mice
8:10
Conclusion
