Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van twee discrete populaties multipotente perivasculaire precursorcellen uit menselijk hartweefsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van cardiale regeneratie, zoals de bijdrage van subpopulaties van de perivasculaire celpopulatie aan dit proces. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het resulteert in populaties progenitorcellen met een verminderde heterogeniteit en een verbeterde levensvatbaarheid in vergelijking met een selectie van gangbare ex-adhesietechnieken.

Deze techniek kan implicaties hebben voor de therapie van ischemische hartziekten, aangezien is aangetoond dat subtypen van perivasculaire stamcellen cardiomyogeen potentieel hebben. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de rol van perivasculaire cellen bij hartregeneratie, kan deze ook worden toegepast voor het onderzoek naar andere aspecten van hartaandoeningen, zoals myocardiale fibrose. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege het gebruik van levensvatbare cellen als gevolg van de versheid van het weefsel.

Om deze procedure te starten, plaatst u de monster in een petrischaal met wasmedium, nadat het pericard, de grote vaten en de atria zijn verwijderd. Snijd vervolgens het ventriculaire myocardium in kleine stukjes van ongeveer één kubieke millimeter en verwerk deze onmiddellijk om de hoogste celopbrengst te verkrijgen. Maak daarna een verse digestiesolution en verwarm deze in een waterbad tot 37 °C.

Filter daarna de gesuspendeerde weefselstukjes door een zeef van 100 micron en was ze tweemaal met PBS. Overbreng de weefselstukjes naar een steriele container van 30 milliliter met een stevig sluitende dop. Voeg de digestie-oplossing toe en plaats de container in een afgesloten plastic zak in een schuddend waterbad van 37 graden Celsius, ingesteld op 120 RPM.

Keer de container na 15 minuten drie keer om. Plaats deze vervolgens opnieuw in het waterbad voor nog eens 15 minuten. Verwijder de container daarna en quench de collagenases met vijf milliliter DMEM aangevuld met 20%FBS.

Tritureer vervolgens het verteerde weefsel door 10 tot 20 keer voorzichtig te pipetteren met een serologische pipette van 10 milliliter om eventuele weefselklonten af te breken. Filter de suspensie daarna opeenvolgend door celzeven van 100 micron, 70 micron en tot slot 40 micron om een enkelcellususpensie te verkrijgen. Centrifugeer de celsuspensie vervolgens gedurende vier minuten bij 200 x g.

Decanteer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter rode cel-lysebuffer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur voordat u dit verdunt met vier milliliter wasmedium. Herhaal de centrifugatiestap en resuspendeer de pellet in één milliliter wasmedium. Verdun 10 microliter cel-suspensie met 90 microliter wasmedium om een verdunning van 1 op 10 van de cel-suspensie te maken.

Meng 10 µL van de verdunde cel-suspensie met 10 µL trypaanblauw-kleurstof en breng 10 µL van het mengsel aan op een standaard hemocytometer voor het tellen van de cellen. Voeg in deze procedure 50 µL muizenserum toe aan de cel-suspensie en incubeer deze gedurende 20 minuten bij 4 °C om aspecifieke antilichaambinding te blokkeren. Centrifugeer vervolgens de cel-suspensie 4 minuten lang bij 200 x g.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in wasmedium. Aliquoteer vervolgens 50 µL van de cel-suspensie in elk van de twee polystyrene flowcytometrie-buisjes met ronde bodem voor de isotype- en ongekleurde controles en plaats het resterende volume in een derde buisje voor multicolor kleuring. Voeg vijf antilichamen toe aan de single-cell suspensie voor multicolor kleuring.

Pipetteer voorzichtig om de antilichamen met de cellen te mengen en incubeer alle buisjes 20 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Bereid de compensatiecontrole-beads voor door één druppel positieve beads toe te voegen aan 100 microliters wasmedium in vijf flowcytometrie-buisjes. Voeg de antilichamen individueel toe aan elk van de vijf buisjes.

Incubeer vervolgens alle buizen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Bereid ondertussen cellenopvangbuizen voor, elk met 500 µL EGM-2 kweekmedium, en plaats deze bij vier graden Celsius. Voeg na de antilichaamincubatie vijf milliliter wasmedium toe om de cellen en beads te wassen en zo eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen.

Centrifugeer alle buisjes 4 minuten bij 200 x g. Herhaal de was- en centrifugatiestappen en schenk het supernatant zorgvuldig af. Resuspendeer de cellen vervolgens in wasmedium bij een concentratie van 1 x 10⁶ cellen per 250 µL.

Resuspendeer de kraaltjes vervolgens in 100 µL wasmedium. Verplaats de cel- en kraaltjessuspensies op ijs en in het donker naar de cel sorter. Voeg één druppel negatieve kraaltjes toe aan de buisjes voor de positieve kraaltjescompensatiecontrole en gebruik deze om de fluorescentiecompensatie in te stellen.

Run vervolgens de ongekleurde controlecellen om de achtergrondfluorescentie vast te stellen en de voltages in te stellen. Run daarna de controle-isotypen om de drempelwaarden voor achtergrondfluorescentie met betrekking tot aspecifieke binding vast te stellen. Run het meerkleurig gekleurde monster en verzamel de pericyten- en adventitiële celpopulaties in de opvangbuisjes.

Voeg bij deze procedure 100 µL steriele 0,2% gelatine-oplossing toe per vierkante centimeter groeioppervlak en schud handmatig om de wells volledig te coaten. Incubeer de platen daarna 10 minuten bij 4 °C. Verwijder vervolgens de gelatine-oplossing volledig.

Houd de verzamelde cellen op ijs terwijl de kweekplaten worden voorbereid. Centrifugeer vervolgens de vers verzamelde cellen gedurende vier minuten bij 200 x g en resuspendeer de celpellet voorzichtig in een passende hoeveelheid EGM-2. Zaai daarna de cellen uit op de met gelatine gecoate platen.

In deze figuur werden levende cellen eerst gegated om CD45-positieve cellen uit te sluiten, gevolgd door CD56-positieve cellen. CD144-positieve endotheelcellen werden vervolgens verwijderd uit de CD56-negatieve fractie. Uit deze uiteindelijke populatie werden CD146-positieve, CD34-negatieve pericyten en CD146-negatieve, CD34-positieve adventitiële cellen geselecteerd en vervolgens verzameld.

Beide culturen van FACS-gezuiverde myocardiale pericyten en adventitiële cellen vertonen een spoelvormige tot stervormige celmorfologie. Zodra deze techniek onder de knie is, zal het ongeveer vijf uur duren, mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de meest verse monsters de beste opbrengst aan levensvatbare cellen zullen geven.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cellulaire cardiomyoplastiek, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de geschiktheid van deze cellen bij de behandeling van ischemische hartaandoeningen.