Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue
8 oktober 2016
Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.
Het algemene doel van deze procedure is om twee discrete populaties van multipotente perivasculaire voorlopercellen te isoleren uit menselijk hartweefsel. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van hartregeneratie te beantwoorden, zoals de bijdrage die subsets van de perivasculaire celpopulatie leveren aan dit proces. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het resulteert in populaties van voorlopercellen met verminderde heterogeniteit en verbeterde levensvatbaarheid van een selectie van belangrijke ex-adhesietechniek.
Deze techniek kan implicaties hebben in de therapie van ischemische hartziekte omdat perivasculaire stamcelsubtypen zijn aangetoond cardiomyogene potentie te hebben. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de rol van perivasculaire cellen in hartregeneratie, kan deze ook worden toegepast op het onderzoek naar andere aspecten van hartziekte, zoals myocardfibrose. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege het gebruik van levensvatbare cellen als gevolg van de versheid van het weefsel.
Om deze procedure te beginnen, plaats na het verwijderen van het pericardium, de grote vaten en de atria, het monster in wasmedium in een petrischaal. Snijd vervolgens het ventrikelmyocard in kleine stukjes van ongeveer één kubieke millimeter en verwerk ze onmiddellijk om de hoogste celafgifte te verkrijgen. Maak vervolgens een verse verteringsoplossing en verwarm deze tot 37 graden Celsius in een waterbad.
Filter daarna de gesuspendeerde weefselstukken door een 100 micron zeef en was ze twee keer met PBS. Breng de weefselstukken over in een steriele 30 milliliter container met een goed afgesloten deksel. Voeg de verteringsoplossing toe en plaats de container in een verzegeld plastic zak in een 37 graden Celsius schuddend waterbad ingesteld op 120 RPM.
Na 15 minuten draai de container drie keer om. Plaats het vervolgens nogmaals in het waterbad voor een extra 15 minuten. Vervolgens verwijderen en blus de collagenases met vijf milliliter DMEM gesupplementeerd met 20% FBS.
Tritureer vervolgens het verteerde weefsel door voorzichtig 10 tot 20 keer te pipetteren met een 10 milliliter serologische pipette om eventuele weefselklitten te breken. Filter vervolgens de suspensie sequentieel door 100 micron, 70 micron en ten slotte 40 micron celzeef om een enkele celafgifte te verkrijgen. Centrifugeer vervolgens de celafgifte gedurende vier minuten bij 200 x g.
Decanteer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter rode cel lyseringsbuffer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur voordat het wordt verdund met vier milliliter wasmedium. Herhaal de centrifugeerstap en resuspendeer de pellet in één milliliter wasmedium. Verdun 10 microliters van de celafgifte met 90 microliters wasmedium om een een-op-tien verdunning van de celafgifte te maken.
Meng 10 microliters van de verdunde celafgifte met 10 microliters trypanblauw kleurstof en plaats 10 microliters van het mengsel op een standaard hemocytometer voor celaftelling. Voeg in deze procedure 50 microliters muizenserum toe aan de celafgifte en incubeer deze gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren. Centrifugeer vervolgens de celafgifte gedurende vier minuten bij 200 x g.
Verwijder het supernatant en resuspendeer het in wasmedium. Pipetteer vervolgens 50 microliters van de celafgifte in elk van de twee polystyreen ronde bodem flowcytometriebuizen voor de isotype en ongekleurde controles en plaats het resterende volume in een derde buis voor meerkleurig kleuring. Voeg vijf antilichamen toe aan de enkele celafgifte voor meerkleurig kleuring.
Pipetteer voorzichtig om de antilichamen met de cellen te mengen en incubeer alle buizen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Bereid de compensatiecontrolekralen voor door een druppel positieve kralen toe te voegen aan 100 microliters wasmedium in vijf flowcytometriebuizen. Voeg de antilichamen afzonderlijk toe aan elk van de vijf buizen.
Incubeer vervolgens alle buizen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Bereid ondertussen celcollectiebuizen, elk met 500 microliters EGM-2 kweekmedium, en plaats ze bij vier graden Celsius. Voeg na de antilichaamincubatie vijf milliliter wasmedium toe om de cellen en kralen te wassen om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen.
Centrifugeer alle buizen gedurende vier minuten bij 200 x g. Herhaal de was- en centrifugeerstappen en decanteer voorzichtig het supernatant. Resuspendeer vervolgens de cellen in wasmedium bij een concentratie van één maal 10 tot de 6de cellen per 250 microliters.
Resuspendeer vervolgens de kralen in 100 microliters wasmedium. Breng de cel- en kralensuspensies over naar de celsorteerder op ijs in het donker. Voeg een druppel negatieve kralen toe aan de positieve kralen compensatiecontrolebuizen en gebruik deze om de fluorescentiecompensatie in te stellen.
Voer vervolgens de ongekleurde controlecellen uit om de achtergrondfluorescentie vast te stellen en stel de spanningen in. Voer vervolgens de controle isotypen uit om de achtergrondfluorescentiedrempels met betrekking tot niet-specifieke binding vast te stellen. Voer het meerkleurig gekleurde monster uit en verzamel de pericyaan- en adventitiële celpopulaties in de verzamelbuizen.
Voeg in deze procedure 100 microliters steriele 0,2%gelatineoplossing per vierkante centimeter groeibereik toe en agiteer handmatig om de gehele putjes te coaten. Vervolgens incubeer de platen gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens de gelatineoplossing volledig.
Bewaar de verzamelde cellen op ijs terwijl u de kweekplaten voorbereidt. Centrifugeer vervolgens de vers verzamelde cellen gedurende vier minuten bij 200 x g en resuspendeer voorzichtig het cellenpellet in een geschikte hoeveelheid EGM-2. Zaai vervolgens de cellen op de met gelatine gecoate platen.
In deze figuur werden levende cellen geselecteerd om eerst CD45-positieve cellen uit te sluiten, gevolgd door CD56-positieve cellen. CD144-positieve endotheelcellen werden vervolgens verwijderd uit de CD5
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van twee verschillende populaties van multipotente perivasculare voorlopercellen uit menselijk hartweefsel. De techniek heeft als doel het begrip van hartregeneratie en de rol van perivasculare cellen in dit proces te verbeteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hartregeneratie
- Stamcellenbiologie
- Perivasculare celpopulaties
Achtergrond
- Menselijk hartweefsel bevat multipotente perivasculare voorlopercellen.
- Deze cellen kunnen bijdragen aan myocardregeneratie.
- De studie richt zich op CD146 + CD34 - periccyten en CD34 + CD146 - adventitiële cellen.
- Begrip van deze populaties kan therapieën voor ischemische hartziekte informeren.
Doel van de studie
- Om specifieke perivasculare celpopulaties te isoleren en zuiveren.
- Om hun bijdragen aan hartregeneratie te onderzoeken.
- Om heterogeniteit te verminderen en de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van CD146 + CD34 - periccyten en CD34 + CD146 - adventitiële cellen.
- Toepassing van belangrijke ex-adhesietechnieken.
- Beoordeling van cellevensvatbaarheid en heterogeniteit.
- Mogelijke toepassing op onderzoek naar myocardfibrose.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van twee verschillende perivasculare celpopulaties.
- Verbeterde levensvatbaarheid van voorlopercellen vergeleken met traditionele methoden.
- Inzichten in de rol van perivasculare cellen bij hartregeneratie.
- Methode toepasbaar op andere onderzoeken naar hartziekten.
Conclusies
- De techniek verbetert het begrip van mechanismen van hartregeneratie.
- Het kan leiden tot vooruitgang in therapieën voor ischemische hartziekte.
- Toekomstig onderzoek kan bredere implicaties voor hartgezondheid verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating defined perivascular precursor cell populations from human myocardium enables mechanistic de-risking in cardiac regeneration research by reducing cellular heterogeneity and improving viability. This approach supports target validation and phenotypic screening for ischemic heart disease therapies by providing reproducible, disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in preclinical models through standardized isolation of CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding perivascular cell contributions to cardiac regeneration.
- Operational Value: Reduces biological noise through prospective isolation of homogeneous multipotent precursor subpopulations.
- Strategic Value: Supports target de-risking by clarifying functional roles of specific perivascular subsets in myocardial repair pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with defined surface marker profiles for consistent compound screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via FACS-based purification of pericyte and adventitial cell populations.
- Strategic Value: Facilitates scalable platform reuse for evaluating drug effects on cardiac progenitor cell function and viability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human cardiac cell models for investigating myocardial fibrosis and ischemic injury mechanisms.
- Operational Value: Enables translational continuity from discovery to preclinical validation using clinically relevant perivascular subsets.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by improving predictive value of preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying purified perivascular precursor cells for hypothesis testing in early discovery, assay-ready cells for screening applications, and translationally relevant models for preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through isolation of defined perivascular cell populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell suspensions with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of cell viability, purity, and functional readouts following isolation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human-derived, disease-relevant cardiac progenitor cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable FACS-based isolation platform applicable across cardiac disease models and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in perivascular cell function.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cardiac progenitor cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency through better target validation and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac regeneration programs based on validated precursor cell activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell sorting, and primary tissue handling.
- Dependent on access to FACS instrumentation, antibody panels, and sterile cell culture infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different tissue sources or disease models.
- Limited by tissue freshness requirements, as viable cell yield declines with sample degradation.
