Name: Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Leer geautomatiseerde celkwantificering met ImageJ-plugins voor hemocytometer- en migratieassays. Deze methode biedt snelle, nauwkeurige tellingen met meerdere analysefuncties voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Canadian Institute of Health Research aan CP (OR 142730 en OR 89931). We willen Jelena Brkic bedanken voor haar oorspronkelijke idee van binaire deeltjeanalyse in ImageJ.

<ol><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752(2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016).</li>
<li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coulter+principle%3A+foundation+of+an+industry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li>
<li>Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Animal+Cell+Culture%22">Animal Cell Culture</a>. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLouis%2C+KS+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).</li>
<li>Scott, W. N. Invasion and motility assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScott%2C+WN+%22Cancer+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Cell Culture: Methods and Protocols</a>. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-378a-5p+promotes+trophoblast+cell+survival%2C+migration+and+invasion+by+targeting+Nodal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal.</a> J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).</li>
<li>Adorno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutant-p53%2FSmad+Complex+Opposes+p63+to+Empower+TGFbeta-Induced+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis.</a> Cell. 137, 87-98 (2009).</li>
<li>Chung, T. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+microRNA-204+mediates+migration+and+invasion+of+endometrial+cancer+by+regulating+FOXC1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1.</a> Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%2FRev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">et al. In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+cell-counting+algorithm+for+fluorescently-stained+cells+in+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays.</a> Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Intern%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Grishagin, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cell+counting+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Automatic cell counting with ImageJ.</a> Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).</li>
<li>Thomas, C. R., Paul, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+image+analysis+in+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Applications of image analysis in cell technology.</a> Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appreciating+data%3A+warts%2C+wrinkles+and+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop%5BTitle%5D)+AND+%22Helpx.adobe.com%22%5BJournal%5D)">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html">https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html</a> (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Kritische Stappen, problemen oplossen, en beperkingen De aard van geautomatiseerde rekenmethoden, bijzonder diegenen van deeltjesanalyse, vereist de wiskundige mogelijkheid om deze deeltjes te bepalen. Bijgevolg is de nauwkeurigheid van beide Cell Concentratie Calculator en migratie test teller is majorly afhankelijk van het trouw, dat wil zeggen, hoe nauw het opgenomen beeld lijkt op de cel monster of migratie assay membraan. Het is daarom van het grootste belang om microscoop en de bijbehoren...

In vitro celtelling is een belangrijke basistechniek in uiteenlopende weefselkweek experimenten. Het nauwkeurig bepalen van het aantal cellen in een cultuur essentieel voor experimentele reproduceerbaarheid en standaardisatie 1,2. Celtelling kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van een hemocytometer en met behulp van verschillende geautomatiseerde methoden, elk met hun eigen voordelen en nadelen 3,4,5. De meeste geautomatiseerde werkwijzen voor celtelling behoren tot een van twee klassen, die de Coulter-principe gebruikt of flowcytometrie. Coulter tellers profiteer van cellen elektrische weerstand naar cel aantal en de grootte te bepalen. Ze zijn snel, nauwkeurig en goedkoper dan flowcytometers. Ze worden echter zelden gebruikt alleen celtelling vanwege de aanzienlijke kosten dan bij handmatige telling 3. Stromingscytometers, daarentegen, zijn duur, maar ze hebben vele toepassingen zoals celtelling analyse van de vorm cellen, structure en het meten van de interne cel markers 4,5. Machines die een van deze twee principes gebruiken zijn verkrijgbaar bij vele fabrikanten. Handmatige telling is betaalbaar maar tijdrovend en onder voorspanning terwijl de geautomatiseerde methoden hebben een fractie van de tijd die de handmatige telling maar het gebruik van dure machines 6. Andere veel voorkomende celcultuur procedures zijn in vitro cel beweeglijkheid assays, namelijk cel migratie en invasie 7. Migratie en invasie assays worden vaak gebruikt om celmotiliteit en invasiviteit onderzoeken reactie op een chemotactische respons. Bovendien worden ze veel gebruikt embryonale ontwikkeling, differentiatie, ontstekingsreactie, en metastase van verschillende celtypen 7-11 bestuderen. Cellen die gemigreerd of binnengedrongen door het poreuze membraan van een migratie assay kan worden gekwantificeerd op twee verschillende manieren. Ten eerste door het kleuren van de cellen met een fluorescerende kleurstof, dissociatie from het membraan en kwantificering met een fluorescerende reader 12. Een beperking van deze methode is dat kwantificering geen record kan worden behouden de membranen en er geen mogelijkheid voor verdere analyse 13. De tweede methode is kwantificering gemigreerde / binnengedrongen cellen worden gefixeerd en gekleurd met fluorescente kleurstof of vaker met cytologische kleurstoffen zoals kristalviolet, toluidine blauwe kleurstof of hematoxyline; dan cellen worden gekwantificeerd handmatig met behulp van omgekeerde microscopische beelden van deze membranen dat is een zeer tijdrovende taak 12,13. Om de nadelen van handmatige celtelling overwinnen, werden twee betrouwbare en nauwkeurige geautomatiseerde celtellers voor celconcentratie en de migratie assay ontwikkeld. Deze geautomatiseerde celgetalmeter algoritmes werden ontwikkeld voor ImageJ als een plugin met behulp van Oracle&#39;s Java programmeertaal. ImageJ is een publiek en veel gebruikte beeldverwerking tool ontwikkeld door het Nationaal Instituut voor HeaLTH (NIH) 14,15; dus, het schrijven van deze plugins voor ImageJ vergemakkelijkt de integratie in de biologische gemeenschap. Automatisering van de cel tellen zorgt voor een hoge doorvoersnelheid en reproduceerbaarheid in vergelijking met handmatige telling. Hoewel andere beschikbare software en plugins kunnen worden gebruikt om celconcentratie berekenen met beeldanalyse 5,16,17, celconcentraties Calculator plug is snel en kan ook overweg verdunningen van cellen en behandelingen. Bovendien kunnen alle resultaten en berekeningen van deze twee tellers worden opgeslagen en uitgevoerd. De twee plugins in dit document beschreven zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van een fasecontrastmicroscoop voor live cell imaging en groot gezichtsveld (gehele membraan capture) beeldvorming voor migratieanalyse membranen met behulp van een dissectie scope. De plugins zijn vrij beschikbaar voor download met installatie-instructies uit: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Cell culturing media&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovian serum (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Media suppliment</td></tr><tr><td>HTR8/SVneo trophoblast cell line</td><td>Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen&rsquo;s University, Kingston, Canada)</td><td></td><td>Software is designed to work with any cell line.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Prepared as 0.20% (w/v) in 10 &micro;M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture plates</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Any tissue culture treated plates will be suitable</td></tr><tr><td>Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0&nbsp;&micro;m Pore size</td><td>Costar 3422 ordered from Fisher Scientific</td><td>7200150</td><td>For 24-well plates; Pore size: 8.0 &micro;m; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area</td></tr><tr><td>HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 &amp; 3</td><td>EMD Millipore and ordered from VWR</td><td>65044A, B, &amp; C</td><td>Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles &amp; includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicator</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Single-edge industrial razor blades</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Thickness: 0.30 mm (0.012")</td></tr><tr><td>Microscope Slides - Precleaned/Plain</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereo dissecting microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD &amp; camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:&nbsp; LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90&nbsp;mm Model: MOB306 &amp; Objective achromat 0.32X, WD=303&nbsp;mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Assistant Germany&nbsp;</td><td></td><td>0.100 mm Depth - 0.0025 mm2</td></tr><tr><td>Olympus inverted light microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41SF</td><td>The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera &amp; camera software is Infinity analyze Version 6.5.2</td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet 1300 Series A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Model: 1375</td><td>Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable&nbsp;</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Model: 370</td><td>Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Version 1.50e</td><td>Minimum version required</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Version 1.8.0_66</td><td>Minimum version required</td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde kwantificering en analyse van cell counting procedures met behulp van imagej plugins

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Het National Institute of Health ImageJ is een krachtige, vrij beschikbare software voor beeldverwerking suite. ImageJ heeft uitgebreide deeltjes algoritmes die effectief kan worden gebruikt om verschillende biologische deeltjes tellen. Bij het tellen van een groot aantal van de cel monsters, de hemocytometer presenteert een knelpunt met betrekking tot de tijd. Ook het tellen van membranen van migratie / invasie assays met de ImageJ plugin Cell Counter, hoewel nauwkeurige, is bijzonder arbeidsintensief, subjectief en berucht voor het veroorzaken van pols pijn. Om aan deze behoefte te pakken, ontwikkelden we twee plugins in ImageJ voor de enige taak van geautomatiseerde hemocytometer (of bekende volume) en migratie / invasie cel tellen. Beide plugins berusten op het vermogen om hoge kwaliteit microfoto verkrijgen met minimale achtergrond. Ze zijn gemakkelijk te gebruiken en geoptimaliseerd voor snelle telling en analyse van grote aantallen individuen met ingebouwde analyse-instrumenten kalibratie tellingen helpen. Door de kernbeginsels Cell Counter met een geautomatiseerde telling algoritme en na telling analyse Dit verhoogt het gemak waarmee migratie assays zonder verlies aan nauwkeurigheid kan worden verwerkt.

Cell Concentratie Calculator Figuur 1 toont het totale proces van CCC kalibratie en telbare beeldacquisitie. Figuur 1A en 1B tonen de P-vierkant beeld kalibratie en berekening van de P-square lengte in pixels. CCC bepaalt celconcentratie in een bepaald volume met de formule: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq1.jpg" /><p ...

Dit artikel beschrijft de kwantificering van hemocytometer- en migratie/invasie-micrografieën via twee nieuwe open-source ImageJ-plugins Cell Concentration Calculator en migration assay Counter. Verder beschrijft het protocollen voor beeldverwerving en kalibratie en bespreekt het in detail de inputvereisten van de plugins.

Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Het algemene doel van dit protocol is om digitale analyse-instrumenten te gebruiken om snel nauwkeurige tellingen te maken van cellen in een suspensie of van een migratie op een invasie-assaymembraan. Dit protocol kan onderzoekers helpen bij het kwantificeren van het aantal cellen dat nodig is voor gangbare technieken en in vitro celmotiliteitsassays. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het snelle en nauwkeurige celtellingen biedt, terwijl er meerdere filters en analyse-instrumenten worden geïntegreerd.Begin met het instellen van de microscoopverlichting op maximum. Schakel over naar het 4x objectief en zorg ervoor dat de fasecontrastfilters worden gebruikt. Stel vervolgens, binnen de microscoopsoftware, de instellingen voor beeldvastlegging in op de standaardwaarden.Plaats nu een standaard hemocytometer op de objecttafel van de microscoop en maak een afbeelding voor de kalibratiestap van het beeldvolume. Pas de belichtingstijd naar behoefte aan. Open in ImageJ, onder de celconcentratiecalculator, de afbeelding en klik op de knop Get Image Dimension.Bij deze actie worden de tekstvakken voor de breedte en hoogte van de afbeelding ingevuld met de beeldresolutie in pixels. Selecteer vervolgens de tool voor rechte lijnen en trek een rechte lijn over de volledige lengte van het primaire p-vierkant van de hemocytometer door de cursor te klikken en te slepen. Druk daarna op de M-toets om het resultatenvenster weer te geven.Typ nu de waarde uit de kolom lengte in het tekstvak voor de lengte van het p-vierkant in de celconcentratiecalculator. Klik vervolgens op de knop Bereken Beeldvolume om het beeldvolume in het tekstvak voor het beeldvolume weer te geven. Klik tot slot op de knop Opslaan om de kalibratie van de plug-in te voltooien.Laad voor monsteranalyse 10 µL cellen in beide kamers van een hemocytometer-objectglas en stel de focus zo in dat het binnenste van de cellen donkerder is dan het celmembraan, zodat de focus in de centrale doorsnede van de cel ligt en niet bij de polen. Pas vervolgens de belichting verder aan zodat de cellen niet overbelicht raken. Licht zichtbare hemocytometerlijnen zijn acceptabel.Maak nu vijf tot tien niet-overlappende afbeeldingen van het centrale gebied van de hemocytometer. De resolutie en vergroting van elke afbeelding moeten gelijk zijn aan die van de afbeelding voor de volumekalibratie. Klik vervolgens in de celconcentratiecalculator op Count Cells en selecteer in het pop-upvenster een map die geteld moet worden.Voer vervolgens in het invoerveld voor het aantal monsters het aantal gemaakte afbeeldingen per kamer in en klik op OK. De plug-in zal nu de gegevens verzamelen. Zie de tekst voor meer details. Zet ter beginstadium in de microscoopsoftware de instellingen voor beeldopname op hun standaardwaarden.Gebruik voor de tafel van de dissectiescoop een effen witte achtergrond en een lichtbron boven de tafel, bij voorkeur twee flexibele LED-lampen. Plaats nu een voltooid migratie-assay membraanpreparaat op de tafel. Pas de vergroting handmatig aan terwijl u naar het real-time beeld kijkt dat door de software wordt weergegeven, zodat de randen van een enkel membraan precies binnen het gezichtsveld van de camera vallen.Pas vervolgens de posities van de lichtbron en de belichtingstijden aan om zo nauwkeurig mogelijk het ideale beeld te reproduceren, met een minimale achtergrondkleur en een uniform verlicht membraan. De nauwkeurigheid van de celtelling is afhankelijk van een hoogwaardige beeldacquisitie.Het is daarom belangrijk om het beste beeld vast te leggen dat mogelijk is met de camera van de gebruiker voor een zo efficiënt mogelijk gebruik van de plug-ins. Verwijder nu het preparaat en voer de witbalans van het beeld uit in de microscoopsoftware om de kalibratie te voltooien. Vlak elk membraan direct voor het beelden af door druk uit te oefenen op het dekglas om zoveel mogelijk ingesloten luchtbellen te verwijderen.Stel nu in de software de locatie van de map voor de opnames in. Neem vervolgens één afbeelding per membraan op en sla de afbeeldingsbestanden op als TIF-bestanden, gebruikend de naamconventie 'sample 001', waarbij het nummer voor elke afbeelding opeenvolgend wordt verhoogd. Deze naamconventie is vereist zodat de plug-in de bestanden kan vinden.Als vlakveldcorrectie gewenst is, zoek dan voor elke slide een leeg gebied en maak een blanco afbeelding. Sla het bestand op onder de naam van het monster gevolgd door 'blank'. Open daarna de TC-plugin in ImageJ.Klik in TC op de knop Flatfield en selecteer in het dialoogvenster Choose Directory de map waarin de membraanbeelden zijn opgeslagen. Open nu een membraanbeeld van een migratie-assay en selecteer Color Threshold. Stel in het venster de methode in op Shanbhag.Stel de drempelwaardekleur in op wit. Stel de kleurruimte in op RGB en vink de optie voor een donkere achtergrond uit. Pas vervolgens de bovenste schuifregelaars aan naar nul en de onderste schuifregelaars naar 255 om de afbeelding volledig wit te maken.Zodra het beeld wit is, worden de groene en rode schuifregelaars aangepast tot alleen de kernen zichtbaar zijn. Kopieer in de TC-plug-in de waarden van de RGB-schuifregelaars naar de bijbehorende tekstvakken voor de RGB-drempelwaarde in de configuratie-instellingen. Klik vervolgens op de knop Add/Modify en overschrijf de configuratie.Klik in het paneel met configuratie-instellingen op Save om de instellingen naar de harde schijf te schrijven. Klik nu op Count Folder en selecteer de map die geteld moet worden om de afbeeldingen met de TC-plugin te tellen. Het programma zal vervolgens de afbeeldingen verwerken en de gegevens automatisch aan de hoofdtafel toevoegen.In de hoofdtabel staat nu een vinkje in de kolom Kalibreren? als een afbeelding is gemarkeerd voor kalibratie op basis van de gelijkenis met de ideale metrieken. Selecteer alle monsters die zijn gemarkeerd voor kalibratie.Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer Recount and Suggested Size. Hierdoor worden de afbeeldingen opnieuw geteld met het voorgestelde minimale partikeloppervlak. Klik daarna opnieuw met de rechtermuisknop en selecteer Show Plot.Een ideaal beeld zal een grafiek vertonen die lijkt op een langsgerekt rechtsscheef normaalverdelingsmodel. Indien nodig kunnen het onderste groottebereik of de RGB-drempelwaarden worden aangepast door het monster te selecteren, met de rechtermuisknop te klikken en Recount and Manual Settings te selecteren. Voer vervolgens de gewenste instellingen in en klik op Count om het beeld opnieuw te tellen.Om de tellingen handmatig aan te passen, selecteert u de monsters, klikt u met de rechtermuisknop op de tabel en selecteert u Open image with counts. De originele afbeelding wordt geopend met rode markeringen die elk door de plug-in geteld deeltje vertegenwoordigen. Daarnaast kan de optie Show counted binary image worden gebruikt om te controleren hoe goed individuele cellen worden onderscheiden door de kleur-drempelwaarde.Om handmatig een telling toe te voegen, houdt u de Ctrl-toets ingedrukt en klikt u met de linkermuisknop. Hiermee wordt er een markering geplaatst op de positie van de cursor, die wordt toegevoegd aan het totale aantal. Om handmatig een markering te verwijderen, klikt u met de rechtermuisknop op de afbeelding; de plug-in verwijdert dan de markering die zich het dichtst bij de cursor bevindt.Om een groep markeringen te verwijderen, selecteert u een interessegebied en klikt u met de rechtermuisknop op het gebied terwijl u de Ctrl-toets ingedrukt houdt. Het proces van de celconcentratiecalculator is afhankelijk van het p-square kalibratiebeeld en de berekening van de p-square lengte en pixels. Een p-square van een hemocytometer heeft een volume van 100 nanoliters; gegeven deze constante kan het totale beeldvolume worden berekend na het converteren van pixels naar millimeters.Een vergelijking van handmatige en geautomatiseerde tellingen over 57 beelden van verschillende experimenten en celtypen laat een zeer sterke correlatie tussen beide methoden zien. Concentraties tussen vijf miljoen en 2.000 cellen per milliliter werden nauwkeurig geteld met behulp van het geautomatiseerde proces. De metriek Q representeert de algemene helderheid van de beelden op basis van de distributie van verschillende partikelgroottes.Een adequate Q is groter dan 0,5. Wanneer deze kwalificaties worden toegepast op een selectie van matige tot uitstekende beelden met betrekking tot helderheid en achtergrondruis, lagen de gekalibreerde beeldtellingen significant dichter bij de handmatige tellingen dan de ongekalibreerde beeldtellingen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cellen in suspensie en uit celmotiliteitsassays nauwkeurig en efficiënt geteld kunnen worden met behulp van de CCC- en TC ImageJ-plugins.Zodra men bedreven is met de TC-plugin, kunnen de acquisitie, kwantificering en aanpassing van celgetallen in minder dan een uur worden voltooid. Beide plugins maken gebruik van de particle counting-functie van ImageJ en kunnen worden aangepast door de door ImageJ gebruikte macro's te bewerken. Dit biedt de gebruiker meer flexibiliteit om de reikwijdte van de plugins uit te breiden naar andere deeltjes.

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lijm micropatterns dat cellulaire architectuur normaliseren kan gebruikt worden om de gevoeligheid bij de detectie van de effecten van geneesmiddelen te verhogen, het verbeteren van de reproduceerbaarheid en vereenvoudiging van de geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse. Deze technologie zullen profiteren drug / siRNA screeningstesten, uitgevoerd op conventionele celcultuur ondersteunt en daardoor lijden aan overmatige cel-tot-cel variabiliteit.

Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Source: Dodge, R., et al. Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the quantification of colony-forming units (CFUs) of gut-associated bacteria in Drosophila flies using a serial dilution and plating approach. Homogenized fly samples containing gut bacteria are serially diluted, plated on agar, and incubated to allow colony growth. Images of the plates are then analyzed using software to align,...

Quantification of Colony-Forming Units of Gut-Associated Bacteria in Drosophila Flies

Dit protocol beschrijft de aanpasbare oppervlaktefunctionalisering van het desthiobiotine, streptavidine en APTES systeem om specifieke celtypen van belang te isoleren. Daarnaast behandelt dit manuscript de toepassingen, optimalisatie en verificatie van dit proces.

Een werkwijze van gerichte Cell Isolation via Glasoppervlak functionalisering

De sociale amoeben Dictyostelium discoideum is onlangs vastgesteld als een systeem om eiwitmisvouwen en proteostase te bestuderen. Hier beschrijven we een nieuwe op beeldvorming gebaseerde methodologie om temperatuur-geïnduceerde eiwitaggregatie en de cellulaire stressrespons in D. discoideum te bestuderen.

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van<em&gt; D. discoideum</em&gt; Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.

Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.

Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen

Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.

Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

Deze methode kwantificeert microbiële abundantie met behulp van een 96-well plaatformaat om kolonievormende eenheden (CFU's) te vergulden en wordt toegepast op het Drosophila-microbioom in hele vlieghomogenaatmonsters. CFU's worden geteld met een geautomatiseerde beeldanalysesoftware die hier wordt geleverd.

Snelle kolonievormende eenheidstelling in 96-wells plaatformaat toegepast op het Drosophila-microbioom

Dit artikel beschrijft stapsgewijze methoden om de kwantificering van beeldkernen te automatiseren met behulp van een open-source uitvoerbaar programma dat is gevalideerd voor een reeks celdichtheden. Dit programma biedt een alternatief dat barrières aanpakt met betrekking tot kosten, toegankelijkheid voor gebruikers met beperkte technologische vaardigheden en applicatiespecifieke validatie die de bruikbaarheid van bestaande technologieën kunnen beperken.

Computer vision-bibliotheken gebruiken om de kwantificering van kernen te stroomlijnen

Leer geautomatiseerde celkwantificering met ImageJ-plugins voor hemocytometer- en migratieassays. Deze methode biedt snelle, nauwkeurige tellingen met meerdere analysefuncties voor celbiologisch onderzoek.

Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins

Meer video's verkennen