Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins
November 17th, 2016
Dit artikel beschrijft de kwantificering van hemocytometer- en migratie/invasie-micrografieën via twee nieuwe open-source ImageJ-plugins Cell Concentration Calculator en migration assay Counter. Verder beschrijft het protocollen voor beeldverwerving en kalibratie en bespreekt het in detail de inputvereisten van de plugins.
Het algemene doel van dit protocol is om digitale analysetools te gebruiken om snel nauwkeurige tellingen van cellen in een suspensie of op een migratie in een invasie-assaymembraan te maken. Dit protocol kan onderzoekers helpen bij het kwantificeren van het aantal cellen dat nodig is voor gebruikelijke technieken en in vitro celmotilitetsanalyses. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het snelle en nauwkeurige celtellingen biedt terwijl het meerdere filters en analysetools omvat.
Om te beginnen, stelt u de microscoopverlichting in op maximaal. Schakel over naar de 4x objectief en zorg ervoor dat de fasecontrastfilters worden gebruikt. Stel vervolgens in de microscoopsoftware de beeldopname-instellingen in op hun standaardwaarden.
Plaats nu een standaard hemocytometer op de microscooptafel en maak een afbeelding voor de beeldvolume-kalibratiestap. Pas de belichtingstijd indien nodig aan. In ImageJ, onder de celconcentratiecalculator, opent u de afbeelding en klikt u op de knop Afbeeldingsdimensie ophalen.
Deze actie vult de tekstvakken voor afbeeldingsbreedte en -hoogte in met de afbeeldingsresolutie in pixels. Selecteer vervolgens het gereedschap voor een rechte lijn en teken een rechte lijn over de volledige lengte van het primaire p-vierkant van de hemocytometer door op de cursor te klikken en te slepen. Druk vervolgens op de M-toets om het resultatenvenster weer te geven.
Typ nu de waarde uit de lengtekolom in het tekstvak p-vierkantlengte in de celconcentratiecalculator. Klik vervolgens op de knop Beeldvolume berekenen om het beeldvolume in het tekstvak met het beeldvolume te laten weergeven. Klik ten slotte op de knop Opslaan om de kalibratie van de plugin te voltooien.
Voor monsteranalyse, laad 10 microliter cellen in beide kamers van een hemocytometerplaat en pas de focus aan zodat het binnenste van de cellen donkerder is dan de celmembraan om focus te bieden binnen de centrale dwarsdoorsnede van de cel en niet op de polen. Pas vervolgens de belichting verder aan zodat de cellen niet overbelicht zijn. Enigszins zichtbare hemocytometerlijnen zijn acceptabel.
Vang nu vijf tot tien niet overlappende afbeeldingen van het centrale gebied van de hemocytometer. De resolutie en vergroting van elke afbeelding moet hetzelfde zijn als die van de volumekalibratie-afbeelding. Klik vervolgens in de celconcentratiecalculator op Cellen tellen en selecteer in het pop-upvenster een map om te tellen.
Vervolgens, in het invoervak voor het aantal monsters, voert u het aantal per kamer genomen afbeeldingen in en klikt u op OK. De plugin verzamelt nu de gegevens. Zie de tekst voor meer details. Om te beginnen, stelt u in de microscoopsoftware de beeldopname-instellingen in op hun standaardwaarden.
Gebruik voor de tafel van de dissectiemicroscoop een effen witte achtergrond en gebruik een lichtbron boven het apparaat, bij voorkeur twee flexibele LED-lampen. Plaats nu een voltooide migratie-assaymembraanplaat op de tafel. Kijkend naar het realtime beeld dat door de software wordt weergegeven, pas de vergroting handmatig aan zodat de randen van een enkele membraan net binnen het gezichtsveld van de camera vallen.
Pas vervolgens de posities van de lichtbronnen en de belichtingstijden aan om, zo dicht mogelijk, het ideale beeld te reproduceren. Dat heeft minimale achtergrondkleur en een gelijkmatig verlicht membraan. De nauwkeurigheid van de celtelling is afhankelijk van de hoogwaardige beeldacquisitie.
Het is daarom belangrijk om de beste afbeelding die door de camera van de gebruiker kan worden vastgelegd, te gebruiken voor het meest efficiënte gebruik van de plugins. Verwijder nu de plaat en balanceer het wit in de microscoopsoftware om de kalibratie te voltooien. Vlak voor het beeldvorming, plat de elke membraan door druk op de dekglas aan te brengen om zoveel mogelijk vastgezette luchtbellen te verwijderen.
Stel nu binnen de software de locatie van de opnamemap in. Vang vervolgens één afbeelding per membraan, en sla de afbeeldingsbestanden op als TIF's met de naamgevingsconventie van monster 001 met incrementele verhogingen van het nummer voor elke afbeelding. Deze naamgevingsconventie is vereist voor de plugin om de bestanden te vinden.
Als flatfield-correctie gewenst is, zoek voor elke plaat een lege zone en neem een lege afbeelding. Sla het bestand op als lege monsternaam. Open vervolgens in ImageJ de TC-plugin.
Klik binnen TC op de knop Flatfield en selecteer vanuit het dialoogvenster Directory kiezen de map waarin de membraanafbeeldingen zijn opgeslagen. Open nu een migratie-assaymembraanafbeelding en selecteer Kleurdrempel. Stel in het venster de methode in op Shanbhag.
Stel de drempelkleur in op wit. Stel de kleurenruimte in op RGB en vink de optie voor donkere achtergrond uit. Pas vervolgens de bovenste schuifregelaars aan op nul en de onderste schuifregelaars op 255 om de afbeelding volledig wit te maken.
Eenmaal wit, pas de groene en rode schuifregelaars aan totdat alleen de kernen zichtbaar zijn. Kopieer in de TC-plugin de waarden van de RGB-schuifregelaars in de bijbehorende configuratie-instellingen RGB-drempeltekstvakken. Klik vervolgens op de knop Toevoegen/Wijzigen en overschrijf de configuratie.
Klik in het configuratie-instellingenpaneel op Opslaan om de instellingen op de harde schijf te schrijven. Klik nu om de afbeeldingen met de TC-plugin te tellen op Tel map en selecteer de map om te tellen. Het programma verwerkt vervolgens de afbeeldingen en voegt de gegevens automatisch toe aan de hoofdtabel.
Nu zal er in de hoofdtabel een vinkje in de kolom Calibreren? staan als de afbeelding is gemarkeerd voor kalibratie op basis van de gelijkenis met de ideale statistieken. Selecteer alle monsters die voor kalibratie zijn gemarkeerd.
Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer Hertel en Voorgestelde grootte. Dit zal de afbeeldingen hertellen met het voorgestelde minimale deeltjegebied. Klik vervolgens opnieuw met de rechtermuisknop en selecteer Plot weergeven.
Een ideale afbeelding zal een grafiek hebben die lijkt op een
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert nieuwe open-source ImageJ-plugins, Cell Concentration Calculator en migration assay Counter, voor het kwantificeren van hemocytometer- en migratie/invasie-micrografieën. Het beschrijft ook beeldverwervings- en kalibratieprotocollen, samen met de vereisten voor de plugins.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Beeldanalyse
Achtergrond
- Celtelling is essentieel voor verschillende biologische tests.
- Accurate kwantificering helpt bij het begrijpen van celgedrag.
- Digitale analysetools kunnen de tellingsefficiëntie verbeteren.
- Open-source tools bevorderen toegankelijkheid in onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te bieden voor snelle en nauwkeurige celtellingen.
- Om kwantificering in in vitro motiliteitsassays te vergemakkelijken.
- Om het gebruik van ImageJ-plugins voor celanalyse te beschrijven.
Gebruikte methoden
- Gebruik van ImageJ-plugins voor celtelling.
- Beeldverwerving met een microscoop met fasecontrastfilters.
- Calibratieprotocollen voor nauwkeurige metingen.
- Instellen van standaard beeldopname-instellingen in microscoopsoftware.
Belangrijkste resultaten
- Aangetoond effectiviteit van de plugins in celkwantificering.
- Biedt gedetailleerde protocollen voor beeldverwerving.
- Benadrukt de voordelen van digitale analysetools.
- Laat zien hoe aan de vereisten voor de plugins wordt voldaan.
Conclusies
- De nieuwe plugins verbeteren de celtellingsnauwkeurigheid aanzienlijk.
- Ze bieden een gebruiksvriendelijke aanpak voor onderzoekers.
- Digitale tools kunnen experimentele werkstromen stroomlijnen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Automated cell counting using ImageJ plugins addresses a critical bottleneck in high-throughput cell-based assay workflows by delivering rapid, reproducible, and quantitative cell enumeration. This capability enhances predictive confidence in early discovery and screening, supporting robust data generation for downstream decision-making. The approach enables scalable, standardized analysis across large sample sets, directly impacting portfolio triage and resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of cell proliferation and viability for hypothesis-driven studies.
- Reduces subjectivity and manual error in cell enumeration, supporting functional target validation.
- Facilitates rapid data generation for pathway interrogation and mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cell counts for migration and invasion assays, ensuring assay readiness.
- Standardizes counting procedures, improving reproducibility and scalability across screens.
- Delivers quantitative outputs suitable for reliable compound evaluation and hit triage.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical model selection by providing robust cell quantification.
- Enables alignment of cell-based assay outputs with translational biomarker strategies when relevant.
- Improves risk-adjusted advancement decisions through consistent, high-quality data.
Pipeline & Workflow Integration
Automated cell counting integrates at the interface of early discovery, screening, and preclinical workflows, providing a reusable analytical capability for cell-based assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling accurate cell quantification.
- Screening: Ensures assay reproducibility and quantitative outputs for migration/invasion and proliferation assays.
- Analytics: Provides statistical outputs and calibration metrics to compare experimental conditions objectively.
- Translational Research: Facilitates data continuity for preclinical model selection when cell enumeration is a key metric.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable platform for diverse particle counting needs across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell counting workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing manual bottlenecks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement through robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy and digital image acquisition for optimal results.
- Depends on access to phase contrast microscopes and compatible imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of image capture and calibration protocols.
- Adaptable to various cell types and assay formats with appropriate macro modifications.
- Image quality and calibration accuracy are critical for reliable automated counts.
