Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins

Het algemene doel van dit protocol is om digitale analyse-instrumenten te gebruiken om snel nauwkeurige tellingen te maken van cellen in een suspensie of van een migratie op een invasie-assaymembraan. Dit protocol kan onderzoekers helpen bij het kwantificeren van het aantal cellen dat nodig is voor gangbare technieken en in vitro celmotiliteitsassays. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het snelle en nauwkeurige celtellingen biedt, terwijl er meerdere filters en analyse-instrumenten worden geïntegreerd.

Begin met het instellen van de microscoopverlichting op maximum. Schakel over naar het 4x objectief en zorg ervoor dat de fasecontrastfilters worden gebruikt. Stel vervolgens, binnen de microscoopsoftware, de instellingen voor beeldvastlegging in op de standaardwaarden.

Plaats nu een standaard hemocytometer op de objecttafel van de microscoop en maak een afbeelding voor de kalibratiestap van het beeldvolume. Pas de belichtingstijd naar behoefte aan. Open in ImageJ, onder de celconcentratiecalculator, de afbeelding en klik op de knop Get Image Dimension.

Bij deze actie worden de tekstvakken voor de breedte en hoogte van de afbeelding ingevuld met de beeldresolutie in pixels. Selecteer vervolgens de tool voor rechte lijnen en trek een rechte lijn over de volledige lengte van het primaire p-vierkant van de hemocytometer door de cursor te klikken en te slepen. Druk daarna op de M-toets om het resultatenvenster weer te geven.

Typ nu de waarde uit de kolom lengte in het tekstvak voor de lengte van het p-vierkant in de celconcentratiecalculator. Klik vervolgens op de knop Bereken Beeldvolume om het beeldvolume in het tekstvak voor het beeldvolume weer te geven. Klik tot slot op de knop Opslaan om de kalibratie van de plug-in te voltooien.

Laad voor monsteranalyse 10 µL cellen in beide kamers van een hemocytometer-objectglas en stel de focus zo in dat het binnenste van de cellen donkerder is dan het celmembraan, zodat de focus in de centrale doorsnede van de cel ligt en niet bij de polen. Pas vervolgens de belichting verder aan zodat de cellen niet overbelicht raken. Licht zichtbare hemocytometerlijnen zijn acceptabel.

Maak nu vijf tot tien niet-overlappende afbeeldingen van het centrale gebied van de hemocytometer. De resolutie en vergroting van elke afbeelding moeten gelijk zijn aan die van de afbeelding voor de volumekalibratie. Klik vervolgens in de celconcentratiecalculator op Count Cells en selecteer in het pop-upvenster een map die geteld moet worden.

Voer vervolgens in het invoerveld voor het aantal monsters het aantal gemaakte afbeeldingen per kamer in en klik op OK. De plug-in zal nu de gegevens verzamelen. Zie de tekst voor meer details. Zet ter beginstadium in de microscoopsoftware de instellingen voor beeldopname op hun standaardwaarden.

Gebruik voor de tafel van de dissectiescoop een effen witte achtergrond en een lichtbron boven de tafel, bij voorkeur twee flexibele LED-lampen. Plaats nu een voltooid migratie-assay membraanpreparaat op de tafel. Pas de vergroting handmatig aan terwijl u naar het real-time beeld kijkt dat door de software wordt weergegeven, zodat de randen van een enkel membraan precies binnen het gezichtsveld van de camera vallen.

Pas vervolgens de posities van de lichtbron en de belichtingstijden aan om zo nauwkeurig mogelijk het ideale beeld te reproduceren, met een minimale achtergrondkleur en een uniform verlicht membraan. De nauwkeurigheid van de celtelling is afhankelijk van een hoogwaardige beeldacquisitie.

Het is daarom belangrijk om het beste beeld vast te leggen dat mogelijk is met de camera van de gebruiker voor een zo efficiënt mogelijk gebruik van de plug-ins. Verwijder nu het preparaat en voer de witbalans van het beeld uit in de microscoopsoftware om de kalibratie te voltooien. Vlak elk membraan direct voor het beelden af door druk uit te oefenen op het dekglas om zoveel mogelijk ingesloten luchtbellen te verwijderen.

Stel nu in de software de locatie van de map voor de opnames in. Neem vervolgens één afbeelding per membraan op en sla de afbeeldingsbestanden op als TIF-bestanden, gebruikend de naamconventie 'sample 001', waarbij het nummer voor elke afbeelding opeenvolgend wordt verhoogd. Deze naamconventie is vereist zodat de plug-in de bestanden kan vinden.

Als vlakveldcorrectie gewenst is, zoek dan voor elke slide een leeg gebied en maak een blanco afbeelding. Sla het bestand op onder de naam van het monster gevolgd door 'blank'. Open daarna de TC-plugin in ImageJ.

Klik in TC op de knop Flatfield en selecteer in het dialoogvenster Choose Directory de map waarin de membraanbeelden zijn opgeslagen. Open nu een membraanbeeld van een migratie-assay en selecteer Color Threshold. Stel in het venster de methode in op Shanbhag.

Stel de drempelwaardekleur in op wit. Stel de kleurruimte in op RGB en vink de optie voor een donkere achtergrond uit. Pas vervolgens de bovenste schuifregelaars aan naar nul en de onderste schuifregelaars naar 255 om de afbeelding volledig wit te maken.

Zodra het beeld wit is, worden de groene en rode schuifregelaars aangepast tot alleen de kernen zichtbaar zijn. Kopieer in de TC-plug-in de waarden van de RGB-schuifregelaars naar de bijbehorende tekstvakken voor de RGB-drempelwaarde in de configuratie-instellingen. Klik vervolgens op de knop Add/Modify en overschrijf de configuratie.

Klik in het paneel met configuratie-instellingen op Save om de instellingen naar de harde schijf te schrijven. Klik nu op Count Folder en selecteer de map die geteld moet worden om de afbeeldingen met de TC-plugin te tellen. Het programma zal vervolgens de afbeeldingen verwerken en de gegevens automatisch aan de hoofdtafel toevoegen.

In de hoofdtabel staat nu een vinkje in de kolom Kalibreren? als een afbeelding is gemarkeerd voor kalibratie op basis van de gelijkenis met de ideale metrieken. Selecteer alle monsters die zijn gemarkeerd voor kalibratie.

Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer Recount and Suggested Size. Hierdoor worden de afbeeldingen opnieuw geteld met het voorgestelde minimale partikeloppervlak. Klik daarna opnieuw met de rechtermuisknop en selecteer Show Plot.

Een ideaal beeld zal een grafiek vertonen die lijkt op een langsgerekt rechtsscheef normaalverdelingsmodel. Indien nodig kunnen het onderste groottebereik of de RGB-drempelwaarden worden aangepast door het monster te selecteren, met de rechtermuisknop te klikken en Recount and Manual Settings te selecteren. Voer vervolgens de gewenste instellingen in en klik op Count om het beeld opnieuw te tellen.

Om de tellingen handmatig aan te passen, selecteert u de monsters, klikt u met de rechtermuisknop op de tabel en selecteert u Open image with counts. De originele afbeelding wordt geopend met rode markeringen die elk door de plug-in geteld deeltje vertegenwoordigen. Daarnaast kan de optie Show counted binary image worden gebruikt om te controleren hoe goed individuele cellen worden onderscheiden door de kleur-drempelwaarde.

Om handmatig een telling toe te voegen, houdt u de Ctrl-toets ingedrukt en klikt u met de linkermuisknop. Hiermee wordt er een markering geplaatst op de positie van de cursor, die wordt toegevoegd aan het totale aantal. Om handmatig een markering te verwijderen, klikt u met de rechtermuisknop op de afbeelding; de plug-in verwijdert dan de markering die zich het dichtst bij de cursor bevindt.

Om een groep markeringen te verwijderen, selecteert u een interessegebied en klikt u met de rechtermuisknop op het gebied terwijl u de Ctrl-toets ingedrukt houdt. Het proces van de celconcentratiecalculator is afhankelijk van het p-square kalibratiebeeld en de berekening van de p-square lengte en pixels. Een p-square van een hemocytometer heeft een volume van 100 nanoliters; gegeven deze constante kan het totale beeldvolume worden berekend na het converteren van pixels naar millimeters.

Een vergelijking van handmatige en geautomatiseerde tellingen over 57 beelden van verschillende experimenten en celtypen laat een zeer sterke correlatie tussen beide methoden zien. Concentraties tussen vijf miljoen en 2.000 cellen per milliliter werden nauwkeurig geteld met behulp van het geautomatiseerde proces. De metriek Q representeert de algemene helderheid van de beelden op basis van de distributie van verschillende partikelgroottes.

Een adequate Q is groter dan 0,5. Wanneer deze kwalificaties worden toegepast op een selectie van matige tot uitstekende beelden met betrekking tot helderheid en achtergrondruis, lagen de gekalibreerde beeldtellingen significant dichter bij de handmatige tellingen dan de ongekalibreerde beeldtellingen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cellen in suspensie en uit celmotiliteitsassays nauwkeurig en efficiënt geteld kunnen worden met behulp van de CCC- en TC ImageJ-plugins.

Zodra men bedreven is met de TC-plugin, kunnen de acquisitie, kwantificering en aanpassing van celgetallen in minder dan een uur worden voltooid. Beide plugins maken gebruik van de particle counting-functie van ImageJ en kunnen worden aangepast door de door ImageJ gebruikte macro's te bewerken. Dit biedt de gebruiker meer flexibiliteit om de reikwijdte van de plugins uit te breiden naar andere deeltjes.