Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Het algemene doel van deze structuur-functie methode is om op moleculair niveau de rol van verschillende eiwitdomeinen, of ziekte-relevante mutaties, in naïeve of gedifferentieerde muis embryonale stamcellen te ontleden. Deze methode kan helpen om te onthullen hoe verschillende residuen of domeinen van een eiwit kunnen bijdragen aan zijn functie in een bepaalde cellulaire context. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer efficiënte targeting van reddingsconstructies naar het genoom van knock-out embryonale stamcellen, of ES-cellen, mogelijk maakt en het onderzoek naar hun rol in verschillende celtypen.

Om dit te bereiken, combineren we drie zeer efficiënte technologieën. Deze omvatten verbeterde isolatie van muis embryonale stamcellen, recombinatie-gebaseerde targeting factor assemblage en ES-cel targeting via recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling, of RMC. Jinke D'Hont, een technicus uit mijn laboratorium, zal een aantal van de procedures demonstreren.

Recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling, of RMCE, maakt de uitwisseling van DNA-fragmenten mogelijk tussen een vector en een genomisch locus. RMCE maakt gebruik van heterospecifieke recombinatiesites die niet kruisreageren en die zijn ingebed in een genomisch locus. In aanwezigheid van een donorplasmide dat een DNA-fragment bevat dat wordt geflankeerd door dezelfde heterospecifieke sites, zal de recombinase dit DNA-fragment in de RMCE-compatibele genomische locus invoegen vanwege dubbele gelijktijdige translocatie.

Alleen bij correcte recombinatie zal het opgesloten promotorloze Neomycine-resistentiegen in de Rosa 26 docking site worden hersteld via een PGK-promoter in de binnenkomende targeting vector, wat geneesmiddelresistentie oplevert. Dit Neomycine-resistentie vals systeem resulteert in een zeer hoge targeting-efficiëntie, vaak dicht bij 100%. De dag voor het isoleren van blastocysten, voeg 0,1% gelatine toe aan 12 wel-gecultiveerde platen. En incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Aspibeer de gelatine-oplossing. Zaai vervolgens een kwart van een fles P2 Muis Embryonale Fibroblasten, of MEFs, in MEF-medium, en verdeel ze over de 12-well platen. Incubeer de 12-well platen van MEFs in twee milliliter MEF-medium bij 37 graden Celsius.

Laat de cellen groeien tot een confluente monolaag. Voeg vervolgens 10 microgram per milliliter Mitomycin-zaad toe aan de putjes. En incubeer de culturen gedurende drie uur bij 37 graden Celsius om de cellen te inactiveren.

Na het selecteren van heterozygote knock-out muizen die een RMCE-cassette bevatten in de Rosa 26-locus volgens het tekstprotocol, voer kruisingen uit om RMCE-compatibele heterozygote knock-out muizen te fokken, met heterozygote knock-out muizen. De volgende ochtend, controleer op copulatiepluggen door het vrouwtje bij de basis van de staart op te tillen en onderzoek de vaginale opening op een witachtige massa. Als de plug moeilijk te zien is, spreid met een hoekige sonde de lippen van de vulva lichtjes uit, en scheid vervolgens de vrouwtjes met pluggen van hun mannetjes.

Om blastocysten te verzamelen op 3,5 dagen na coïtus, of DPC. Nadat de zwangere vrouwtjes zijn geëuthanaseerd, maak een mid-ventrale incisie en gebruik fijne schaar en pincetten om de baarmoeder en eileider te dissekeren. Buig vervolgens een 26-gauge naald in een hoek van 45 graden, bevestigd aan een 1 milliliter spuit gevuld met M2-medium.

En steek de naald in het uiteinde van de baarmoeder dat het dichtst bij de eileider ligt. Gebruik fijne pincetten om de naald op zijn plaats te houden terwijl je de zuiger duwt om de blastocysten uit de baarmoeder in het deksel van een 10 centimeter schaal te spoelen. De baarmoeder zal opzwellen als het spoelen succesvol is.

Gebruik een mondpijp om alle embryo's in een druppel M2-medium te verzamelen en was de embryo's twee keer in een druppel M2-medium. Direct na het wassen van de embryo's, gebruik PBS om de mitomycin-C inactieve cellen twee keer te wassen. Gebruik vervolgens een mondpijp om elke blastocyst op een aparte put van de mitomycin-C behandelde MEFs te plateren, in SRES-celmedium, aangevuld met pluripotent of 2I.

Incubeer de culturen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Ververs het SREF-celmedium elke twee tot drie dagen. Onderzoek elke blastocyst onder een stereomicroscoop bij 4X vergroting en controleer op uitkomen en loslating van de MEF-laag.

Na 10 tot 12 dagen cultiveren, gebruik onder een stereomicroscoop een P10-pijp met wegwerptips om individuele icium-uitgroeiingen te verzamelen. Breng elke uitgroei over in ongeveer 10 microliter medium naar een V-vormige 96-well plate, die 30 microliter per put bevat van PBS. Voeg met een multi-kanaals pijp 50 microliter 0,25% trypsine toe aan elke put.

En incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie minuten. Voeg 100 microliter van voorgeïncubeerd FPS-bevattend ES-celmedium toe en dissocieër de icium-uitgroeiingen in enkele cellen door 10 tot 15 keer te pipetten. Breng vervolgens de gedissocieerde cellen over naar mitomycin-C behandelde 96-well MEF-platen.

De volgende dag ververs het SR-gebaseerde medium. Breid de ES-cellen uit op vergelijkbare wijze van 24 naar 6-well platen. Na het identificeren van geredde CDNA-vectoren volgens het tekstprotocol, bereid een 10 microliter LR-reactie voor met 100 nanogram redding CDNA-vector, 150 nanogram pre-uitgesneden RMCEDV1-vector en twee microliter recombinase-mix, die een faag-gecodeerde integrase, een excisionase en een bacteriële integratiegastheerfactor bevat.

Incubeer de reactie bij 25 graden Celsius gedurende twee uur. Om de gecombineerde vectoren te transformeren, voeg 5 microliter van elk mengsel toe aan 40 microliter hitteschok competente E.Coli-bacteriën, in een 2 milliliter buis met schroefdop. En incubeer het monster op ijs gedurende 20 minuten.

Bek