Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen
July 14th, 2017
Een selectieve en gevoelige vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS / MS) methode gekoppeld aan een efficiënte vaste fase-extractie op een microplaat van 96-putjes met gemengde modus kation-uitwisseling (MCX) 96-putjes werd ontwikkeld voor het meten van vrije 3-nitrotyrosine ( 3-NT) in menselijke urine met hoge doorvoer, die geschikt is voor klinische toepassingen.
Het algemene doel van deze geminiaturiseerde solid phase extractie in combinatie met een LC-MS/MS-test is om vrij 3-nitrotyrosine in menselijke urine nauwkeurig te kwantificeren voor klinische toepassingen. Vrij 3-nitrotyrosine helpt bij de opbrengsten en is een biomarker voor oxidatieve stress. Het blijft echter een bijzondere uitdaging om 3-nitrotyrosine nauwkeurig te kwantificeren in biologische noodsituaties voor klinische toepassingen vanwege onvoldoende gevoeligheid, selectiviteit en omslachtige monstervoorbereidingen.
Deze techniek, die een effectieve solid phase extractie incorporeert in een zeer gevoelige LC-MS/MS-interactie, maakt snelle, specifieke en nauwkeurige bepaling mogelijk van lage niveaus van endogene 3-nitrotyrosine in menselijke urine zonder de noodzaak van constitutie en tweedimensionale LC. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in onderzoek naar oxidatieve stress, kan deze ook worden toegepast op andere pathologische aandoeningen zoals complexe inflammatoire en neurodegeneratieve stoornissen. De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar het monitoren van de effectiviteit van antioxidantbehandeling omdat het 3-nitrotyrosine-niveau kan worden verlaagd door antioxidanten. Om deze procedure te beginnen, worden eerder bereide en ontdooide urinemonsters, standaarden en QC-monsters gevortext.
Na het vortexen, voeg 250 microliter van elk monster en standaard toe aan 32 putjes van een schone twee milliliter 96-well verzamelplaat. Voeg 50 microliter van eerder bereide interne standaard werkoplossing toe aan elk putje behalve het dubbele blanco monsterputje. Voeg vervolgens 50 microliter LC-MS-kwaliteit water met 0,01% forminezuur toe aan het dubbele blanco monsterputje.
Voeg vervolgens 250 microliter LC-MS-kwaliteit water met 0,1% forminezuur toe aan de putjes. Meng de oplossingen vervolgens drie keer met een achtkanaals pipet en dek de plaat af tot SPE-belasting. Plaats vervolgens een mixed mode kationenuitwisselings 96-well extractiemicroplaat en een verzamelreservoir op een positieve drukprocessor.
De solid phase extractie die een mixed mode kationenuitwisselings microplaat gebruikt, maakt gelijktijdige monsterschoonmaak en verrijking van 3-nitrotyrosine in een enkele extractie mogelijk. Conditioner de extractieplaat door 200 microliter LC-MS-kwaliteit methanol door het sorbent te laten stromen. Draai de knop voor drukregeling op de positieve drukprocessor om een lage positieve druk in te stellen om het mengsel langzaam door het sorbent te laten stromen, en pas de druk indien nodig aan.
Breng in evenwicht door 200 microliter LC-MS-kwaliteit water met 2% formienzuur door het sorbent te laten stromen. Laad met behulp van een achtkanaals pipet voorzichtig het volledige volume van elk van de vooraf gemengde monsters op de vooraf geconditioneerde extractieplaat. Stel lage positieve druk in op de positieve drukprocessor om het mengsel langzaam door het sorbent te laten stromen, en pas de druk indien nodig aan.
Was vervolgens de putjes door 200 microliter LC-MS-kwaliteit water met 2% formienzuur door het sorbent te laten stromen. Na het wassen met 200 microliter methanol en water, stel de positieve drukprocessor in op hoge druk om de putjes te drogen. Zodra de putjes droog zijn, vervang het reservoir door een schone twee milliliter 96-well verzamelplaat.
Breng nu 50 microliter van een 25 millimolair ammoniumacetaatoplossing aan om het vastgehouden analieet en de interne standaard langzaam van de extractieplaat te elueren. Voeg vervolgens 50 microliter LC-MS-kwaliteit water met 5% formienzuur toe om het eluaat te neutraliseren. Het gebruik van een milde ammoniumacetaatoplossing voor de elutie van 3-nitrotyrosine biedt aanzienlijk verbeterde selectiviteit en gevoeligheid.
Meng de monsters drie keer met een achtkanaals pipet ter voorbereiding op liquid chromatography tandem mass spectrometry analyse. Na het opzetten van het LC-MS/MS-instrument, breng de 3-nitrotyrosine LC-MS/MS-methode gedurende 10 minuten in evenwicht met de LC-gradiënt elutie. Door de methode in evenwicht te brengen, zal de LC-gradiënt worden geëquilibreerd naar de initiële gradiënt elutie.
De temperatuur van de autosampler wordt ingesteld op vier graden Celsius en de oventemperatuur wordt ingesteld op 30 graden Celsius. Maak een batchlijst met de urinemonsters, standaarden en QC-monsters. Start vervolgens de batch door de voorbereide monsters te injecteren.
Na het voltooien van alle injecties, stel een standaardcurve vast met een bereik van 10 tot 2.500 picogram per milliliter voor 3-nitrotyrosine kwantificering door lineaire regressie van de piekoppervlakteverhouding van 3-nitrotyrosine en interne standaard versus de nominale 3-nitrotyrosineconcentratie. Kwantificeer tenslotte alle andere monsters met behulp van de vastgestelde standaardcurve en bepaal of de QC-monsters binnen het vastgestelde bereik vallen. LC-gegevens van menselijke urinemonsters tonen aan dat 3-nitrotyrosine chromatografisch wordt gescheiden van andere structureel vergelijkbare tyrosine-analogen onder de geoptimaliseerde omstandigheden, wat co-eluerende interferenties elimineert vanwege deze sterk overmatige verbindingen en bijgevolg de graad van testselectiviteit verbetert.
Er wordt geen 3-nitrotyrosine signaal waargenomen in het multiple reaction monitoring chromatogram van het dubbele blanco monster, wat aangeeft dat 3-nitrotyrosine niet wordt gevormd tijdens het hele proces. Representatieve multiple reaction monitoring chromatogrammen van 3-nitrotyrosine en interne standaard voor een gezond individu worden hier getoond. Er werden geen storende signalen waargenomen op de retentietijd van 3-nitrotyrosine en interne standaard.
Een representatieve standaardcurve wordt hier getoond. De detectielimiet, gedefinieerd als de laagste concentratie met een signaal-ruisverhouding groter dan drie, werd bepaald op twee picogram per milliliter. De onderste kwantificeringslimiet werd bepaald op 10 picogram per milliliter en wordt gedefinieerd als de laagste concentratie binnen 20% van onnauwkeurigheid en nauwkeurigheid met een signaal-ruisverhouding van meer dan 10.
De fijn afgestelde integratietest levert aanzienlijk verbeterde specificiteit, gevoeligheid en doorvoer op met verminder
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een zeer gevoelige liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) methode voor het kwantificeren van vrij 3-nitrotyrosine in menselijke urine. De methode omvat solid phase extractie, waardoor het geschikt is voor klinische toepassingen en onderzoek naar oxidatieve stress.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Klinische Biochemie
- Onderzoek naar oxidatieve stress
Achtergrond
- Vrij 3-nitrotyrosine is een biomarker voor oxidatieve stress.
- Accurate kwantificering in biologische monsters is uitdagend vanwege gevoeligheids- en selectiviteitsproblemen.
- Bestaande methoden omvatten vaak omslachtige monstervoorbereidingen.
- Oxidatieve stress is gekoppeld aan verschillende pathologische aandoeningen, inclusief neurodegeneratieve stoornissen.
Doel van studie
- Om een methode te ontwikkelen voor nauwkeurige kwantificering van vrij 3-nitrotyrosine in menselijke urine.
- Om klinische toepassingen en onderzoek naar oxidatieve stress te vergemakkelijken.
- Om monitoring van de effectiviteit van antioxidantbehandelingen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Geminiaturiseerde solid phase extractie.
- Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).
- Hoge doorvoer analyse van urinemonsters.
- Voorbereiding van standaarden en kwaliteitscontrolemonsters.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt snelle en specifieke bepaling van lage niveaus van 3-nitrotyrosine mogelijk.
- Het verbetert de gevoeligheid en selectiviteit in vergelijking met traditionele methoden.
- Resultaten kunnen inzichten bieden in oxidatieve stress en gerelateerde aandoeningen.
- Mogelijke toepassingen in het monitoren van antioxidantbehandelingen.
Conclusies
- De ontwikkelde LC-MS/MS methode is effectief voor klinische toepassingen.
- Het lost uitdagingen op bij het kwantificeren van 3-nitrotyrosine in biologische monsters.
- Deze techniek zou onderzoek naar oxidatieve stress en de implicaties ervan kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of low-abundance biomarkers like 3-nitrotyrosine in human urine is critical for oxidative stress research and clinical biomarker validation. This miniaturized SPE-LC/MS/MS method delivers enhanced sensitivity and selectivity, enabling reliable detection of endogenous 3-NT levels without derivatization or lengthy sample preparation. The high-throughput format supports preclinical and clinical studies requiring rapid, non-invasive biomarker assessment for go/no-go decisions in antioxidant therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oxidative stress pathways by providing quantitative 3-NT measurements as a functional biomarker.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through specific detection of free 3-NT in complex biological matrices.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating 3-NT levels with disease states and antioxidant intervention outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized, reproducible assay with low matrix effect for consistent compound screening.
- Operational Value: Miniaturized SPE on 96-well plates allows processing of 192 samples in 24 hours, improving workflow efficiency.
- Scalability: Reduced solvent consumption and waste disposal lower operational costs for large-scale biomarker studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase oxidative stress mechanisms to preclinical validation via quantifiable urinary biomarker.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables monitoring of antioxidant treatment effectiveness through measurable reductions in 3-NT levels.
- Disease Relevance: Applicable to inflammatory and neurodegenerative disorders where oxidative stress plays a pathogenic role.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing a robust oxidative stress readout.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by quantifying 3-NT as a downstream effector of reactive nitrogen species.
- Screening: Enables assay readiness with high sensitivity (LLOQ 10 pg/mL) and selectivity for reliable compound evaluation in urine.
- Analytics: Provides quantitative MRM-based readouts with signal-to-noise >10 for accurate concentration determination across a 10–2500 pg/mL range.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment with oxidative stress pathology and antioxidant response.
- Enterprise Reuse: The miniaturized SPE-LC/MS/MS platform is reusable across multiple studies, reducing revalidation burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in oxidative stress biomarker measurement, reduction of false positives from interferences.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and high throughput (192 samples/24h) enable consistent cross-study comparisons.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in antioxidant development via quantifiable biomarker modulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on biomarker engagement and mechanism validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in LC-MS/MS method development and solid phase extraction optimization.
- Needs access to positive pressure processors, 96-well SPE plates, and PFP chromatographic columns.
- Demands standardization of sample handling, internal standard use, and MRM transition settings across sites.
- Adaptation to other biological matrices may require reoptimization of elution and cleanup conditions.
- Practical limitation: Method is specific to free 3-NT; total 3-NT measurement would require hydrolysis steps not included here.
