Name: Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer een miniaturized solid phase extraction methode met LC-MS/MS detectie voor kwantificering van 3-nitrotyrosine in menselijke urine. Deze techniek biedt hoge gevoeligheid voor klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zouden Scott Howard en Abigail Marinack erkennen voor algemene ondersteuning en coördinatie van dit werk.

Alle studies waarbij menselijke urinemonsters werden uitgevoerd, werden gevolgd aan de procedure die is goedgekeurd door de Pharmasan / Neuroscience Institutionele Review Board (IRB). 1. Urine Monster Collection en Creatinine (Cr) Determination <ol><li> Verzamel 5 ml van de volgende morgen urine monsters na ca. 10 uur &#39;s nachts vast in een 5 ml transportbuis A die 250 μl 3 N HC1 bevat als conserveermiddel en opslaan bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Ontdooi en draaikolk 5 ml transport urine Een buis en centrifuge in een centrifuge ( bijv. Sorvall) (2297 xg, 10 min). </li><li> Aliquot 1 ml urine tweemaal uit de 5 ml transportbuis A. </li><li> Bepaal Cr door middel van een urine creatinine methode 26 . </li></ol> 2. Bereiding van standaard, IS en Quality Control (QC) monsters <ol><li> Bereid een voorraadoplossing van 3-NT bij 100 μg / ml in water met 0,01% HCOOH mobiele fase A (MA) op en opslaan bij -20 ° C. </li><li> MakenEen 3-NT werk standaard oplossing bij concentratie van 100 ng / mL door het verdunnen van de 100 μg / mL 3-NT voorraadoplossing met MA. </li><li> Genereren normen variërend van 5 tot 2500 pg / ml door verdunning van de 100 ng / mL werkstandaard met 0,15 M HCl verzuurde lege urine vrij van 3-NT, samen met lege en dubbele lege monsters. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van IS 13 C 9 -3-NT bij 100 μg / ml in water met MA en sla de bij -20 ° C op. </li><li> Maak een IS-werkoplossing op 500 pg / ml door verdunning van de 100 μg / ml 13 C 9 -3-NT IS-voorraadoplossing met MA. </li><li> Bepaal vijf niveaus van QC-monsters die de LLOQ, laag, medium en hoog niveau ( d.w.z. 10, 25, 100, 500 en 1.250 pg / ml) omvatten, door verdunning van de 3-NT werkstandaard in de verzuurde lege urine. </li></ol> 3. Fase-extractieprocedure <ol><li> Ontdooien en vortex urine monsters, normen en QC monsters. </li><li> Voeg urine monsters, normen en QC samp toeLes (250 μl elk) naar 32 putjes van een schone 2 ml 96-putjes collectieplaat. </li><li> Introduceer de 500 pg / mL IS werkoplossing (50 μL) aan elke put, behalve dubbele lege monsterput. Voeg 0,01% HCOOH (50 μL) toe aan de dubbele blanco monsterput. </li><li> Voeg LC-MS / MS water toe met 0,1% HCOOH (250 μl). </li><li> Meng het bovenstaande mengsel drie keer met een 8-kanaalspipet. </li><li> Bedek de plaat tot SPE laadt. </li><li> Plaats een MCX 96-puts extractieplaat en een verzamelreservoir op een positieve drukprocessor. </li><li> Conditie de extractieplaat met vloeibare MeOH (200 μL) door het sorbent. </li><li> Equilibreer door stromend water met 2% HCOOH (200 μL) door het sorbent. </li><li> Breng het gehele volume van elk van de vooraf gemengde monsters met een 8-kanaalspipette zorgvuldig op de voorgekookte extractieplaat. </li><li> Stel een lage positieve druk ( bijv . 3 psi) op ​​de positieve drukprocessor om het mengsel te laten stromenDoe het sorbent langzaam aan, pas de druk zo nodig aan. </li><li> Was de putjes door water met 2% HCOOH (200 μL) door het sorbent te stromen. </li><li> Was de putjes door methanol (200 μL) door het sorbent te stromen. </li><li> Was de putjes door stromend water (200 μL) door het sorbent. </li><li> Droog de putjes volledig met een hoge positieve drukinstelling ( bijv . 40 psi) op ​​de positieve drukprocessor. </li><li> Vervang het reservoir met een schone 2 ml 96-putjes collectieplaat. </li><li> Toepassing 25 mM NH4 OAc bij pH 9 (50 pl) aan de ingehouden analyt elueren en IS van de extractieplaat. </li><li> Pipette LC-MS water met 5% HCOOH (50 μL) om het eluaat te neutraliseren. </li><li> Meng met de 8-kanaalspipette drie keer en stuur voor analyse naar het LC-MS / MS-station. </li></ol> 4. LC-MS / MS-analyse <ol><li> Meet 2,000 ml LC-MS water nauwkeurig met een afgedrukte cilinder en verplaats het in een 2 liter fles. </li><li> PIpette 200 μL pure HCOOH in de bovenstaande fles die LC-MS water bevat. </li><li> Meng grondig en label als mobiele fase A (MA). Inclusief initialen, voorbereidingsdatum en vervaldatum. </li><li> Neem een ​​2 liter fles LC-MS methanol en label als mobiele fase B (MB) met startdatum en vervaldatum. </li><li> Stel de temperatuur van de auto-sampler op tot 4 ° C. </li><li> Plaats de verzamelplaat met voorbereide monsters in de autosampler. </li><li> Plaats een PFP-kolom (150 mm x 2.1 mm ID, 3 μm) en bescherm de kolom in de oven. </li><li> Stel de oventemperatuur in op 30 ° C. </li><li> Equilibreer 10 minuten met behulp van de acquisitie methode met de LC gradiënt elutie zoals getoond in Tabel 1 . </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tijd (min) </td><td> module </td><td> Evenementen </td><td> Parameter </td></tr><tr><td> 0 </td><td> pumps </td><td> Pomp B Conc. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> pumps </td><td> Pomp B Conc. </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> pumps </td><td> Pomp B Conc. </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> pumps </td><td> Pomp B Conc. </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> pumps </td><td> Pomp B Conc. </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 4.01 </td><td> pumps </td><td> Pomp B Conc. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.5 </td><td> pumps </td><td> Pomp B Conc. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.6 </td><td> pumps </td><td> Pomp B Conc. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> controleur </td><td> Hou op </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1: Liquid Chromatography Gradient Elution Conditions <ol start="10"><li> Maak een batchlijst inclusiefNormen, QC en urine monsters. </li><li> Start de partij door injectie van de bereide monsters (12 μL). </li></ol> 5. Peak Identificatie, Integratie en Data Process <ol><li> Beheer de gegevensverzameling en -verwerking met behulp van de software. </li><li> Identificeer en integreer 3-NT en IS pieken voor alle monsters. </li><li> Bepaal een standaardkromme met een bereik van 10-2.500 pg / mL voor 3-NT kwantificering door lineaire regressie van de piek gebied verhouding van 3-NT en IS versus de nominale 3-NT concentratie met een gewicht factor van 1 / x. </li><li> Kwantificeer alle monsters met behulp van de standaardkromme. </li><li> Bepaal of de QC-monsters in het gevestigde bereik vallen. </li><li> Omzetten van de gedetecteerde concentraties urinemonsters naar de uiteindelijke resultaten in de eenheid van nM of nmol / mmol Cr. </li></ol>

<ol><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li>
<li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitrotyrosine%2C+a+marker+of+nitrosative+stress%2C+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li>
<li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration%3A+Cause%2C+effect%2C+or+association%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li>
<li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li>
<li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Biochem.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li>
<li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li>
<li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li>
<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples%3A+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li>
<li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine%3A+strategies%2C+controversies%2C+and+our+current+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li>
<li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li>
<li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative%2Fnitrative+changes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li>
<li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li>
<li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li>
<li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+o%2Co%27-dityrosine%2C+o-nitrotyrosine%2C+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC%2Felectrospray+ionization-MS%2FMS+using+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li>
<li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tyrosine%2C+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li>
<li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li>
<li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity%3A+validity+and+clinical+applicability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized%2C+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS%2FMS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li>
<li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS%2FMS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li>
<li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-015-8934-5">Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li>
<li>Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from:
 <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> 2011-2011 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS%2FMS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Ernstige variaties in concentraties die eerder zijn gerapporteerd in de literatuur voor het endogene vrije 3-NT in menselijke urine monsters onthullen methodologische problemen in verband met beschikbare assays 8 , 9 , 10 , 11 . Een nauwkeurige bepaling van het lage basale niveau van 3-NT in menselijke urine blijft een uitdagende taak die speciale voorzorgsmaatregelen vereist voor het voorbere...

De effecten van oxidatieve stress op de klinische presentatie zijn de laatste jaren in de voorhoede getrokken 1 . Een van de biomarkers die worden onderzocht, is 3-nitrotyrosine (3-NT), een eindstabiel product dat wordt gevormd wanneer reactieve stikstofsoorten (RNS) interageren met tyrosine, een catecholamine neurotransmitter precursor. Terwijl 3-NT klinische waarde kan hebben als biomarker voor RNS in vivo, kunnen de substantiële veranderingen van de eigenschappen en functies van tyrosine de overeenkomstige eiwitten en cellulaire functies 1 , 2 nadelig beïnvloeden. Opkomende onderzoeken hebben voorgesteld dat 3-NT een belangrijke rol kan spelen bij ontstekingsomstandigheden 3 , neurodegeneratieve stoornissen 4 , 5 , hart- en vaatziekten 6 en diabetes 7 , alsmede de condities die verband houden met oxidatieve stress. Echter, deze obsRvations zijn gebaseerd op resultaten van methoden die niet gevoelig zijn voor en / of selectiviteit 8 , 9 , 10 , 11 . De enorme concentraties van 3 NT voor de biologische monsters die eerder in de literatuur zijn gerapporteerd, tonen aan dat er ernstige analysemethoden met deze analyses zijn geassocieerd en technische verbeteringen nodig zijn om de niveaus van 3-NT nauwkeurig te kwantificeren en de rol ervan te controleren in de pathologie van deze omstandigheden . De kwantificering van gratis 3-NT in biologische matrices geeft een speciale uitdaging voor man en instrument 8 , 9 , 10 , 11 . Ten eerste vraagt ​​het spoorniveau van endogeen 3-NT een ultragevoelige detectie; Ten tweede, het bestaan ​​van tal van structureel vergelijkbare analoges, in het bijzonder tyrosine, dat aanwezig is inEnorme overmaat, vereist een hoge mate van selectiviteit; Ten derde vereist de artefactuele vorming van 3-NT door tyrosine nitrering met alomtegenwoordig nitraat en nitriet speciale aandacht tijdens de monstervoorbereiding om valse overschatting van 3-NT te vermijden. Onder een grote verscheidenheid aan methodieken die zijn gebruikt om 3-NT te meten, is MS / MS beschouwd als de gouden standaard methode vanwege de superieure gevoeligheid en selectiviteit 11 , 12 , 13 , 14 . Gaschromatografie (GC) gekoppelde MS / MS biedt de beste gevoeligheid, maar de onontbeerlijke steekproef derivatisatie stappen zijn te vervelend en tijdrovend om efficiënt te zijn voor klinische toepassingen 15 , 16 . LC-MS / MS vereist geen complexe monster derivatisatie, waardoor het de veelbelovende optie is. Niettemin zijn er verschillende obstakels om te overwinnen, zoals de seNsitiviteit van LC-MS / MS-methoden die in de literatuur worden gerapporteerd, moet worden verbeterd voor de meting van laag overvloedig 3-NT 7 , 17 , 18 en de relatief lange omkeertijd moet worden verkort voor toepassingen met hoge doorvoer 12 , 13 , 17 , 19 . Bovendien, bij het overwegen van klinische toepassingen, speelt de biologische matrix een belangrijke rol. Het zou makkelijk en goedkoop zijn om, indien mogelijk, 20 , 21 , 22 te verkrijgen en niet invasieve te maken. Plasma, het traditioneel gebruikte monster in de literatuur, is geen klinisch gewenste matrix, dus een methodologie die gebruik maakt van urine, die niet invasieve en kosteneffectief is, werd gezocht. Verschillende pogingen om rel. Te ontwikkelenLable en specifieke LC-MS / MS methodologieën zijn gemaakt met behulp van urine 9 , 10 , 11 . Echter, ze zijn allemaal niet zozeer selectief, betrouwbaar of efficiënt genoeg voor klinisch gebruik. De effectiviteit van de overheersende SPE met behulp van traditionele omkeerfase cartridge (C18 type) als monsteropruiming voor de 3-NT analyse is ondervraagd en een sequentiële SPE van sterke kationuitwisseling (SCX) en omgekeerde fase C18-OH is voorgesteld 6 , 7 , 19 . Een recent ontwikkelde LC-MS / MS methode gebruikte een multi-stap zuivering proces van handmatige C18 SPE, preparatieve hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC) en online SPE voor analyse van 3-NT 23 . Hoewel deze methode voor klinische doeleinden gevoelig genoeg was, met een LLOQ van 0,041 nM, was het opruimingsproces intensief en vervelend en vereisteRood 3 ml urine, het beperken van de haalbaarheid voor hoge doorvoer. Een molecuulgeïmprimeerd polymeer werd gebruikt als het SPE sorbent om de efficiëntie van het opruimingsproces 14 te verbeteren, maar de resulterende LLOQ (0,7 ug / ml) was niet laag genoeg voor klinische exemplaren. Een andere methode vereist tweedimensionale (2D) LC-MS / MS en immunoaffiniteitskromatografie voor het opruimen van het monster om een ​​detectiegrens (LOD) van 0,022 nM 24 te bereiken . Hoewel al deze methoden vooruitgang hebben geboekt bij de beoordeling van 3-NT, heeft niemand de gevoeligheid, betrouwbaarheid en efficiëntie die nodig zijn voor klinische toepassingen bereikt. Om de pathologie van gratis 3-NT en zijn rol als biomarker van oxidatieve stress in klinische instellingen te onderzoeken, hebben we een methodologie ontwikkeld die eenvoudig, efficiënt, nauwkeurig en nauwkeurig is, waardoor klinische toepassingen met hoge doorgang 25 kunnen worden toegepast . Een geminiaturiseerde gemengd mode kation exc(MCX) 96-putjes extractiemicroplate werd geïmplementeerd om eenvoudig en effectief monsteropruiming en verrijking van 3-NT in een enkele extractie te verwezenlijken die de nadelen in de bestaande methoden die derivatisatie, verdamping en 2D-LC vereisen omzeilen. Vloeistofchromatografie met 0,01% HCOOH als additief in mobiele fase bood een verbeterde signaalrespons met een snelle cyclustijd aan. Selectiviteit werd verder verbeterd door toepassing van een mild NH4 OAc elutieoplossing voor selectieve elutie van 3-NT, en het gebruik van MRM overgang voor zowel 3-NT en de interne standaard (IS). Het matrix effect werd gecompenseerd door gebruik te maken van een gereduceerde hoeveelheid van een voorkeur 13 C-gelabelde isotopische IS voor kwantificering. Met de komst van deze methodologie kunnen onderzoekers en clinici de rol van 3-NT in klinische condities verifiëren en de impact van oxidatieve stress verder onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>3-Nitro-L-tyrosine</td><td>Sigma</td><td>N7389-5g</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitro-L-tyrosine-13C9</td><td>Sigma</td><td>652296-5.0mg</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spec Gold Urine</td><td>Golden West Biologicals</td><td>MSG 5000-1L</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 96-well &micro;Elution plate</td><td>Waters</td><td>186001830BA</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96 well collection plate</td><td>Phenomenex&nbsp;&nbsp;</td><td>AH0-7194</td><td></td></tr><tr><td>96 positive processor</td><td>Waters&nbsp;</td><td>186005521</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>14262-2L</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV water</td><td>Sigma</td><td>14263-2L</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid for mass spectrometry</td><td>Sigma</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Sigma</td><td>338818-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra PFP propyl columns</td><td>Restek</td><td>9179362</td><td></td></tr><tr><td>5500 Triple quad</td><td>AB Sciex&nbsp;</td><td>/</td><td>Contact manufacture for more detail</td></tr><tr><td>UFLC-XR</td><td>Shimadzu&nbsp;</td><td>/</td><td>Contact manufacture for more detail</td></tr><tr><td>Integra 400 Plus&nbsp;</td><td>Roche</td><td>/</td><td>Urinary Creatinine Jaff&eacute; Gen 2 method</td></tr><tr><td>LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial</td><td>Waters</td><td>600000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial</td><td>Waters</td><td>186000384C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL transport tube</td><td>Phenix</td><td>TT-3205</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge tube</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge tube</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2266</td><td></td></tr><tr><td>eLine electronic pipette</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge centrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS balance&nbsp;&nbsp;</td><td>Kennedy Scales, inc.</td><td>735</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer&nbsp;</td><td>Bernstead Thermolyne</td><td>M16715</td><td></td></tr></tbody></table>

integratie van gefinatiseerde solid phase extraction en lc-ms / ms detection of 3-nitrotyrosine in menselijke urine voor klinische toepassingen

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Vrij 3-nitrotyrosine (3-NT) is uitgebreid gebruikt als een mogelijke biomarker voor oxidatieve stress. Verhoogde niveaus van 3-NT zijn gerapporteerd in een grote verscheidenheid aan pathologische aandoeningen. Bestaande methoden beschikken echter niet over voldoende gevoeligheid en / of specificiteit die nodig is om het lage endogene niveau van 3-NT betrouwbaar te meten en zijn te moeizaam voor klinische toepassingen. Dientengevolge is analytische verbetering dringend nodig om de niveaus van 3-NT nauwkeurig te kwantificeren en de rol van 3-NT bij pathologische omstandigheden te verifiëren. Dit protocol presenteert de ontwikkeling van een nieuwe vloeistofdetectormetrie (LC-MS / MS) detectie gecombineerd met een miniaturized solid phase extraction (SPE) voor de snelle en nauwkeurige meting van 3-NT in menselijke urine als een niet-invasieve biomarker Voor oxidatieve stress. SPE met behulp van een 96-putje plaat zorgde voor een aanzienlijke vereenvoudiging van het proces door het verzamelen van monsteropruiming en analytverrijking zonder vervelende derivatisatie- en verdampingsstappen, Het verminderen van oplosmiddelverbruik, afvalverwijdering, risico op verontreiniging en totale verwerkingstijd. De overeenkomst van 25 mM ammoniumacetaat (NH4 OAc) bij pH 9 als SPE elutie-oplossing aanzienlijk verbeterde selectiviteit. Massaspectrometriesignaalrespons werd verbeterd door aanpassing van de multiple reaction monitoring (MRM) overgangen. Het gebruik van 0,01% HCOOH als additief op een pvaffluorfenyl (PFP) kolom (150 mm x 2,1, 3 μm) verbeterde signaalrespons nog 2,5 keer en verkort de totale looptijd tot 7 minuten. Een lagere limiet van kwantificering (LLOQ) van 10 pg / ml (0,044 nM) werd bereikt, wat een significante gevoeligheidsverbetering voor de gerapporteerde assays vertegenwoordigt. Met deze vereenvoudigde, snelle, selectieve en gevoelige methode kunnen twee platen urinemonsters (n = 192) worden verwerkt in een 24 uur tijdsperiode. Gezien de aanzienlijk verbeterde analytische prestatie, en niet-invasieve en goedkope urine steekproefneming, is de voorgestelde test voordelig voor preklinische en klinischestudies.

Figuur 1 illustreert dat 3-NT volledig chromatografisch gescheiden is van andere structureel vergelijkbare tyrosineanalogen onder de geoptimaliseerde LC-conditie, die de co-elutie-interferenties wegens deze veel te veel verbindingen elimineert en derhalve de mate van assayselectiviteit verbetert. Daarnaast maakt de gradiënteluctie met 0,01% HCOOH als additief in MA en methanol bij een stromingssnelheid van 0,45 ml / min een snelle elutie van 3-NT ( dwz</...

Een selectieve en gevoelige vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS / MS) methode gekoppeld aan een efficiënte vaste fase-extractie op een microplaat van 96-putjes met gemengde modus kation-uitwisseling (MCX) 96-putjes werd ontwikkeld voor het meten van vrije 3-nitrotyrosine ( 3-NT) in menselijke urine met hoge doorvoer, die geschikt is voor klinische toepassingen.

Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Het algemene doel van deze geminiaturiseerde vaste-fase-extractie in combinatie met een LC-MS/MS-analyse is het nauwkeurig kwantificeren van vrij 3-nitrotyrosine in menselijke urine voor klinische toepassingen. Vrij 3-nitrotyrosine dient als een biomarker voor oxidatieve stress. Het blijft echter een specifieke uitdaging om 3-nitrotyrosine in biologische monsters voor klinische toepassingen nauwkeurig te kwantificeren vanwege onvoldoende gevoeligheid, selectiviteit en omslachtige monstervoorbereidingen.Deze techniek, die een effectieve vastefase-extractie combineert met een zeer gevoelige LC-MS/MS-interactie, maakt een snelle, specifieke en nauwkeurige bepaling van lage concentraties endogeen 3-nitrotyrosine in menselijke urine mogelijk, zonder dat constitutie en tweedimensionale LC nodig zijn. Hoewel deze methode inzicht kan bieden bij onderzoek naar oxidatieve stress, kan zij ook worden toegepast op andere pathologische aandoeningen, zoals complexe inflammatoire en neurodegeneratieve stoornissen. De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar het monitoren van de effectiviteit van antioxidantbehandelingen, aangezien het 3-nitrotyrosineniveau door antioxidanten kan

integration-miniaturized-solid-phase-extraction-lc-msms-detection-3

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Rekening houdend met speeksel bemonstering voor toekomstige klinische toepassing, is een lolly-achtige ultrafiltratie (LLUF) probe gemaakt om te passen in de menselijke mondholte. Directe analyse van onverteerd speeksel door nanoLC-LTQ massaspectrometrie werd aangetoond dat LLUF sondes om grote eiwitten en een hoge overvloed eiwitten te verwijderen, en maak een lage overvloedige peptiden meer aantoonbaar.

Bemonstering Human Inheemse Speeksel peptidoom Met behulp van een Lollipop-Like Ultrafiltratie Probe: vereenvoudigen en te verbeteren Peptide Detection voor Klinische massaspectrometrie

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Een snel protocol voor proteolytische vertering met een zelfgebouwde flow-through tryptische microreactor gekoppeld aan een elektrospray-ionisatie (ESI) massaspectrometer wordt gepresenteerd. De fabricage van de microreactor, de experimentele opstelling en het proces voor gegevensverzameling worden beschreven.

Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

We presenteren een handige solid-phase extraction gekoppeld aan hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) met elektrochemische detectie (ECD) voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen. Wij identificeren ook de metaboliet MHPG als een potentiële biomarker voor de vroege diagnose van hersenschade voor zuigelingen.

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

Presenteren we een methode voor het detecteren van 3-nitrotyrosine chemische wijzigingen van atmosferische eiwitten met 6 mm diameter rondes gesneden uit lucht sampler voorfilters met behulp van een krachtige vloeibare chromatografie-elektrochemische detector (HPLC-ECD).

Detectie van 3-Nitrotyrosine in de atmosferische omgeving via een High-performance Liquid Chromatography-elektrochemische Detector systeem

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor uitgebreide drug surveillance waarmee voor de betere resolutie en detectie van grote panelen van drugs van misbruik en hun metabolieten, met kwaliteitscontrole op basis van multisegment injectie-capillair elektroforese-massaspectrometrie.

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

Proteomic profilering van tyrosine-nitraat eiwitten is een uitdagende techniek vanwege de geringe overvloed van de 3-nitrotyrosine modificatie. Hier beschrijven we een nieuwe aanpak voor nitropeptide verrijking en profilering met behulp van angiotensine II als model. Deze methode kan worden uitgebreid voor andere in vitro -of in vivo -systemen.

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Hier beschreven is een protocol voor de bepaling van vier verschillende tryptofaanmetabolieten gegenereerd in de kynurenine route (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic zuur, 3-hydroxyanthranilic zuur) in het medium verzameld uit kankercelculturen geanalyseerd door vloeibare chromatografie in combinatie met een enkele viervoudige massaspectrometrie.

Gelijktijdige kwantificering van geselecteerde kynurenines geanalyseerd door vloeibare chromatografie-massaspectrometrie in medium verzameld uit kankercelculturen

Dit protocol beschrijft een CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine biomarker test die point-of-care kankerdiagnostiek mogelijk maakt door middel van de ex vivo analyse van tumor-geassocieerde protease-activiteiten.

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

Leer een miniaturized solid phase extraction methode met LC-MS/MS detectie voor kwantificering van 3-nitrotyrosine in menselijke urine. Deze techniek biedt hoge gevoeligheid voor klinische toepassingen.

Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen (Video) | JoVE Journal

Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen

Meer video's verkennen