High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

Huidige strategieën voor een urine drug screening zijn duur uit te voeren voor routine-analyse van steeds grotere panelen van drugs van misbruik zoals vereist voor werkplek testen, evenals therapeutische drug monitoring toepassingen. Bovendien, methoden op basis van amino testen zijn gevoelig voor bias en zijn uiteindelijk beperkt tot doelanalyse van bekende drug panelen. Het belangrijkste voordeel van onze methode, die wordt aangeduid als MSI-CE-MS, is dat het zorgt voor de snelle screening van een onbeperktd medicijnpaneel en hun metabolieten met hoge nauwkeurigheid en minimale sample workup.

Er is dringend behoefte aan een hoge doorvoer en betaalbare screening methode om de resultaten van de patiënt te verbeteren door de naleving te bevestigen en het optimaliseren van drugsdosering regimes, terwijl de onthulling van illegale drugsgebruik. Dit multiplexed scheidingsplatform kan worden toegepast op een verscheidenheid van andere onderzoeksgebieden die verband houden met gerichte of niet-gerichte metabolietprofilering in complexe biologische monsters. Begin met het ontdooien van ontkende ochtendurinemonsters verzameld van patiënten met een bekende voorgeschreven medicijngeschiedenis voor min 80 graden Celsius opslag op ijs en het vortexen van de ontdooide monsters gedurende 30 seconden.

Vervolgens sediment de monsters door centrifugatie en combineer drie 10 microliter aliquots van elk monster met 10 microliter van deuterated interne normen, vijf microliters van een 4-fluoro-L-fenylalanine en 3-chloor-L-tyrosine oplossing en 25 microliter van gedeïmiseerd water. Centrifugeren de mengsels vervolgens gedurende één minuut en breng 20 microliter van elk monster over in afzonderlijke polypropyleen flacons. Om de ongecoate gesmolten silica capillaire conditionering parameters, snijd een 135 centimeter lang, 50 micrometer binnendiameter, en 360 micrometer buitenste diameter capillaire uit een spoel.

Gebruik een capillaire raammaker om ongeveer 7 millimeter polyamidecoating van beide uiteinden van elke capillaire te verwijderen. Installeer vervolgens de capillaire inlaten in de capillaire elektroforese, of CE-cartridge, door elke capillaire looping voor twee 360 graden bochten, waarbij ervoor wordt gezorgd dat ongeveer twee millimeter van de capillaire uitlaten uit de CE-spuitnaald uitsteken. Wanneer alle haarvaten zijn geïnstalleerd, laadt u de CE-cartridge voorzichtig in het CE-systeem en slaat u de CE-sproeier uit de ionenbron.

Plaats de vloeibare chromatografie, of LC sproeier, in de ionenbron en selecteer flush in de software van het systeem om de capillaire conditionering in te stellen. Stel de duur van methanol, een molaire natriumhydroxide, gedeïmiseerd water en achtergrondelektrolyt flush in op 30 minuten per flush en plaats de isocratische pomp op stand-by tijdens de capillaire conditioneringsperiode. Reinig na de laatste flush de capillaire elektroforese massaspectrometer of CE-MS sproeier en de CE-elektrode met methanol doorweekte doekjes.

Reinig de CE-MS-interface met een één-op-één isopropanol wateroplossing om eventuele resterende zoutafzettingen te verwijderen. Vervang de LC sproeier door de gereinigde CE-MS sproeier en een nieuw geconditioneerde capillair in de coaxiale schede vloeistof interface. Schakel vervolgens de isocratische pomp in en breng gedurende 15 minuten een spanning van 30 kilovolt aan om ervoor te zorgen dat een stabiel CE-stroomprofiel wordt bereikt voorafgaand aan de urineanalyse.

Selecteer in de systeemsoftware preconditionering, stel de flush in op 600 seconden en geef een achtergrondelelektrolyt-bestandspositie op. Stel de injectie in om de monsters gedurende vijf seconden hydrodynamisch te injecteren op 100 millibar en om de achtergrondelelektrolyt-afstandsruimters gedurende 75 seconden elektrokinetisch te injecteren op 30 kilovolt. Stel de toegepaste spanning in op 30 kilovolt, de cartridgetemperatuur op 25 graden Celsius en de totale looptijd op 40 minuten.

Breng vervolgens, volgens het tijdschema, een drukgradiënt van twee millibar per minuut toe van nul tot 40 minuten tijdens de scheiding. Wanneer de monstervername is voltooid, spoelt u de capillaire op 50 millibar druk met de achtergrondelektrolyten 's nachts terwijl de capillaire zich in de CE-sproeier in de ionenbron bevindt. Stel de tof-MS positieve ionendetectie in op een massa-ladingverhouding van 50 tot 1,700, met een gegevensverwervingssnelheid van 500 milliseconden per spectrum, en bevestig dat zowel het profiel als de centroid-gegevens worden opgeslagen in D-bestandsformaat.

Stel de elektrospray ionisatie voorwaarden op capillaire en mondspanningen van 2000 volt elk, de vernevelmgas tot 10 pond per vierkante inch, en het drogen gas levering tot acht liter per minuut op 300 graden Celsius met een schede gasstroom van 3,5 liter per minuut op 195 graden Celsius tijdens de aankoop. Stel vervolgens de MS-spanningsinstellingen van de fragmenter, skimmer en octapool één radiofrequentie in op respectievelijk 120, 65 en 750 volt en stel de parameters voor instrumentcontrole en gegevensverwerving in op basis van het ontwerp van het experiment. Open voor data-analyse de multi-segment CE-MS-gegevens in de systeemsoftware.

Stel onder chromatogrammen de extractiegegevens en de chromatogram- en massaspectrale gegevensindelingen in op de profielmodus. Selecteer onder smoothing de quadratische kubieke Savitzky-Golay en stel de functiebreedte in op 15 punten. Klik vervolgens op MS integreren en stel de integrator in op agile.

Stel onder piekfilters het maximum aantal pieken in op 11. Klik onder de weergave op de lijst integratiepiek en selecteer piekaantal, retentietijd, piekgebied, piekhoogte en signaal-ruisverhouding. Sla vervolgens de parameters op onder een unieke methodenaam en pas de methode toe op het proces voor de interpretatie van elke gegevensset.

In deze representatieve analyse van verschillende isobarische isomerische drugs van misbruik en hun metabolieten, 30 opgelost pieken van 10 onafhankelijke monsters van een geneesmiddel mengsel werden ontdekt zonder monster overdracht. Twee andere isobarische opioïden kunnen volledig worden opgelost als 20 verschillende pieken met de volledige scan gegevensverwerving. Ook twee amfetamine positionele isomeren werden volledig opgelost in deze multi-segment CE-MS analyse, om illegale methamfetamine misbruik te onderscheiden van het potentiële misbruik van phentermine, een voorgeschreven stimulerend middel dat wordt gebruikt als een eetlustremmer voor gewichtsverlies.

In deze representatieve analyse van de drugscreening werd een positief screeningtestresultaat voor methadon afgeleid door de detectie van een grote signaalpiek die comigreert met de methadon-d3-piek met een lage massafout. Er werden geen andere signalen gedetecteerd in andere urinemonsters binnen dezelfde run en de gedetecteerde methadonconcentratie overschreed 13 keer de aanbevolen cutoff-limiet in vergelijking met de gemeten ionenresponsratio in het monster en gecorrigeerd door een viervoudige urineverdunningsfactor, wat bevestigt dat de patiënten zich aan de onderhoudstherapie voor methadon houden. Hier werd een seriële injectieconfiguratie in multi-segment CE-MS, bestaande uit vijf verschillende drug calibrants, geanalyseerd in tweevoud binnen een enkele run samen met de synthetische urine leeg.

De drug metabolieten werden ontdekt als hun potenated moleculaire ionen boven hun screening cutoff grenzen. Na deze procedure kan een groot aantal polaire en ionische metabolieten in urine ook worden geanalyseerd door MSI CMS ter ondersteuning van op ontdekkingen gebaseerd metabolisch onderzoek. Bovendien kan uitgebreid toezicht worden gehouden op een breed scala aan exogene geneesmiddelen en hun metabolieten, waaronder niet-voorgeschreven medicijnen en illegale drugs die vatbaar zijn voor misbruik.

Deze geoptimaliseerde methode kan ook worden gebruikt om routinematig andere drugs van misbruik te screenen. Dit kunnen cannabis of alcoholmetabolieten zijn en onze methode kan ook onderscheid maken tussen een synthetische of een valse urinematrix en een natuurlijk, echt, authentiek gedoneerd urinemonster. Vergeet niet om altijd voorzichtig te zijn bij het werken met biologische vloeistoffen.