Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het biomedisch onderzoeksveld, zoals biomarker ontdekking, drug ontdekking, diagnostiek, en screening van drugs of antilichamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoge doorvoer is en eiwitanalyses op een zeer reproduceerbare manier kan detecteren. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de diagnose van vele ziekten, omdat het getroffen eiwitten of hun isovormen kan meten.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in celsignaleringstrajecten, kan deze ook worden toegepast op andere systemen waar specifieke eiwitten moeten worden geanalyseerd. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de test stappen zijn moeilijk te leren vanwege de trucs, zoals het verwijderen van bubbels, het laden van de plaat, et cetera. Bereid eerst een monsterverdunningsmix voor door één microliter DMSO-remmermix en twee microliter proteaseremmers toe te voegen aan 47 microliter monsterverdunningsmiddel, zodat de uiteindelijke concentratie dmso en proteaseremmers één X.Verdun eerder geïsoleerde eiwitlysaten met behulp van het monsterverdnningsmiddelmengsel om de gewenste concentraties te verkrijgen.

Voeg vervolgens 3.325 microliter standaardladder, zes microliter proteaseremmer en drie microliter DMSO-remmer toe aan 137.675 microliter antholietpremix. Vortex het monster ten minste 15 seconden en blijf op ijs. Meng de twee bereide oplossingen in een verhouding van één tot drie, zodat de uiteindelijke concentraties DMSO proteaseremmers en de isoelectrische puntstandaardladder één X zijn en de eiwitten in de capillaire de uiteindelijke gewenste concentraties bereiken.

Nadat de eiwitten aan het monstermengsel zijn toegevoegd, worden alle stappen uitgevoerd op ijs of op vier graden Celsius. Zet een plaat met 384 put op ijs. Laad tien microliter van de monstermix in de juiste put van de plaat, volgens de testsjabloonlay-out die is ontworpen met de geautomatiseerde westerse blotting-systeemsoftware.

Verdun hierna de primaire en secundaire antilichamen met antilichaamverdunningsstoffen. Vervolgens pipette tien microliters van primaire antilichamen en 15 microliter van secundaire antilichamen in elke put. Meng vervolgens luminol en peroxide XDR in een één-op-één verhouding.

Pipette 15 microliters van de luminolperoxide mengen in elke put. Zodra de monsters en reagants zijn toegevoegd aan de plaat, centrifuge gedurende tien minuten op 2500 keer G en vier graden Celsius om spin vaststelling van de vloeistof en verwijder de bellen. Als er nog steeds bellen bestaan, verwijder ze dan handmatig met behulp van een dunne pipetpunt.

Open de geautomatiseerde western blotting systeem software en klik op new'from the file menu. Ga naar het lay-outvenster en wijs locaties toe voor reagants en monsters in de 384-put plaat. Maak een reagant opdracht door te klikken op een put overal in het blok.

Selecteer een rijblok van elk 12 putten. Ga vervolgens naar de gereedschapsbalk van het indelingsvenster en voeg een voorbeeld, primair, secundair of luminolrijblok in. Ga naar het protocolvenster en selecteer een reagant locatie in de plaat.

Klik vervolgens op de cel in de voorbeeldkolom en selecteer de reagant in het vervolgkeuzemenu. Selecteer op dezelfde manier de reagant-locaties voor de primaire, secundaire en luminol voor elke cyclus. Klik één voor één op de cellen in de primaire of secundaire antilichaamkolom en wijzig indien nodig de incubatietijden.

Voeg vervolgens cycli toe door op de knop Toevoegen in de sectie protocol te klikken. Voer in het sjabloonvenster informatie in met betrekking tot het monster, zoals de identiteit van de primaire en secundaire antilichamen, hun catalogusnummers en verdunningen. Sla het nieuwe testbestand op.

Voordat u op de startknop klikt, controleert u snel de lay-out om te controleren of alles correct is. Klik nu op start om de run te beginnen. De software zal de gebruiker vragen om het afval te verwijderen, om het water en capillaire doos bij te vullen, om anolite en catholiet toe te voegen aan de resource tray, om wasbuffer toe te voegen, en om de plaat te laden in de gekoelde monster lade.

Een instrument statusbalk wordt weergegeven op het computerscherm een paar minuten nadat de run is gestart. Klik op het scherm overzicht uitvoeren om de status- en scheidingsvensters te bekijken. Als u de elektroforesescheiding in een capillaire wilt observeren, speelt u de scheidingsfilm voor die capillaire film af door op de gewenste cyclus te klikken en vervolgens op de afspeelknop in het bedieningspaneel te klikken.

Open het run-bestand en selecteer het tabblad Analysescherm. Klik op bewerken'en vervolgens op analyse'om het iso-elektrische puntbereik te wijzigen. Breng de juiste iso-elektrische puntstandaard aan.

Voeg een piekpasvorm toe en voeg een pieknaam toe. Selecteer ten slotte de gegevens die u wilt gebruiken op het tabblad Pieken en exporteer de gegevens voor verdere analyse. Hier wordt het elektropherogram van fosforyleerde extracellulaire signaalregulerende kinases van vasculaire endotheelgroeifactor gestimuleerd lysates getoond.

Er is een zeer hoge inductie van fosforyleerde eiwitten waargenomen met vasculaire endotheelgroeifactor. De inzet toont de endogene ladingscontrole, HSP 70, wat wijst op een vergelijkbare belasting van monsters voor zowel onbehandelde als behandelde monsters. In een conventionele immunoblot werden slechts twee banden gedetecteerd, hoewel de fosforyleerde extracellulaire signaalregulerende kinase-eiwitten in vier pieken werden opgelost door capillaire isolementische scherpstelanalyse.

Het elektropherogram van extracellulaire signaalregulerende kinases van vasculaire endotheelgroeifactor gestimuleerd lysates wordt hier getoond. De inzet toont dezelfde laadregeling die parallel wordt gebruikt. Een conventionele immunoblot toont slechts twee banden die overeenkomen met extracellulaire signaalgeregeerde kinase een en extracellulaire signaal-geregelde kinase twee.

Terwijl met de capillaire isolementrische scherpstelling, de extracellulaire signaal-geregelde kinase eiwitten werden opgelost in zes pieken, wat overeenkomt met alle vier de verschillende fosforylated pieken en twee niet-fosforylated pieken. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in een paar uur, afhankelijk van het aantal cycli, als het goed wordt uitgevoerd. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om hogere antilichaamconcentraties te gebruiken in vergelijking met conventionele immunoblots.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de test stappen zijn moeilijk te leren als gevolg van trucs, zoals het verwijderen van bubbels, het laden van de plaat, et cetera. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe een test te ontwerpen, monsters voor te bereiden, voer de test, en analyseren van de gegevens om verschillende isoforms van uw eiwit te observeren.