Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Deze methode kan helpen bij het verbeteren van grootschalige en hoge resolutie karakterisering van eiwitisovormen en eiwit post-translationele wijzigingen in cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat capillaire zone elektroforese massaspectrometrie biedt zeer efficiënte scheiding en zeer gevoelige detectie van intacte eiwitten. Om de capillaire voor te behandelen, droogt u het minstens 12 uur met stikstofgas op 10 psi.

Vul vervolgens de capillaire met 50% volume-per-volume 3-propyl methacrylaat in methanol met behulp van een spuitpomp. Verzegel beide uiteinden van de capillaire met silicarubber. Na het uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur, doorgaan met een lineaire polyacrylamide coating op de binnenwand van de scheiding capillaire, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Verbrand een deel van de capillaire met behulp van een zachte vlam om de polyamide buitenste coating te verwijderen ongeveer vier centimeter afstand van het ene uiteinde van de capillaire. Maak het verbrande gedeelte van de capillaire voorzichtig schoon door de polyamidecoating volledig te verwijderen. Boor een klein gaatje aan het einde van een 200 microliter buis rond dezelfde grootte als de capillaire buitendiameter om de capillaire voldoende op zijn plaats te houden zodra het door dit gat is draad.

Rijg het uiteinde van de capillaire die dicht bij het verbrande gedeelte door het gat totdat het verbrande gedeelte in de buis zit. Voeg vervolgens ongeveer 150 microliter HF toe aan de 200 microliter buis, zodat de HF-oplossing ongeveer halverwege het verbrande gedeelte op de capillaire is. Incubeer de capillaire in de HF-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 90 tot 100 minuten.

Bereid het standaard eiwitmengsel en het E.coli-monster zoals beschreven in het tekstprotocol. Om het opzetten van de capillaire zone elektroforese, of CZE-systeem, laad het monster, de achtergrond elektrolyt, en de scheiding capillaire in CZE auto-sampler. Selecteer voorbeeldbelasting op de handmatige besturingselementpagina van de CZE-automonsternemer.

Laad de achtergrond elektrolyt flacon in de bufferlade van de auto-sampler, waarbij de positie in de bufferlade wordt op. Laad vervolgens de monster flacon in de monsterlade van de auto-sampler, waarbij de positie in de monsterlade wordt opgepass. Plaats de auto-sampler op de uitlijningspositie met behulp van handmatige bediening.

Laad nu de scheiding capillair in CZE auto-sampler met behulp van de niet-geëtste einde van de capillaire. Pas de hoogte van het injectieeinde van het capillair aan als het monstervolume lager is dan 50 microliter. Schakel de auto-sampler in om stand-by te staan met behulp van handmatige bediening.

Typ de monsterpositie in het systeem en verplaats de capillaire naar het monster. Duw het injectieeinde van de capillaire verder naar beneden om de bodem van de monsterfbak te bereiken. Door de handmatige bediening te blijven gebruiken, spoel je de capillaire 20 minuten door met de achtergrondelektrolyt met een druk van 20 psi.

Nu, monteer een commerciële elektrokinetically gepompt schede stroom interface aan de voorkant van de massa spectrometer. Vul het zakbufferreservoir met een buffer met 10% volumevolumemehanol en 0,2% mierenzuur in LCMS-kwaliteitwater. Spoel de T in de interface met de schede buffer via het handmatig toepassen van druk met een spuit.

Rijg het uiteinde van een elektrospray van één millimeter door een koker en sluit de zender via een fitting met één poort van de T. Spoel de T gewoon opnieuw handmatig door met een spuit om de zender te vullen met de schedebuffer. Pas de afstand tussen de opening van de zender en de ingang van de massaspectrometer aan op ongeveer twee millimeter met behulp van de camera die bij de interface is gekomen.

Breng een spanning van twee tot 2,2 kilovolt aan op de schedebuffer flacon voor elektrospray. Stel vervolgens de sproeispanning aan om een stabiele elektrospray te bereiken. Breng tijdens dit proces een lage druk aan het uiteinde van de capillaire om er zeker van te zijn dat er geen bellen in de capillaire zitten.

Zet de sprayspanning uit en schroef het geëtste uiteinde van de scheiding via de T voorzichtig in de zender totdat deze niet verder kan worden geduwd. Na het stoppen van de lage druk aan het injectieeinde van de capillaire, spoel de zender een beetje door met schedebuffer. Nogmaals, breng twee tot 2,2 kilovolt van spray spanning om de spray te testen.

Selecteer een nieuwe methode onder het vervolgkeuzemenu bestand op het hoofdinstrumentenscherm. Selecteer daar de inlaat als startmonsterfstuk, einde monster flacon, lade als monster, druk als vijf psi, kilovolts als nul en duur als 95 seconden voor een monsterinjectie. Stel vervolgens inlaat in als inlaatbladje, lade als buffer, druk als nul psi, kilovolts als 30 en duur als 4,200 seconden voor de scheiding van het standaard eiwitmengselmonster.

Voor de scheiding van het E.coli proteome monster, inlaat als inlaat flacon, lade als buffer, druk als nul psi, kilovolts als 20, en duur als 6, 600 seconden. Selecteer ten slotte inlaat als inlaatbladje, lade als buffer, druk als 10 psi, kilovolt als 30 en duur als 600 seconden voor capillaire spoelen. Stel nu de MS- en MS/MS-parameters in voor intacte eiwitanalyse met behulp van een viervoudige ionenvalmaskerspectrometer.

Als u de instellingen van het afstemmen van bestanden wilt aanpassen, schakelt u de intacte eiwitmodus in en gebruikt u een overvuldruk van 0,2. Stel de ionenoverdracht capillaire temperatuur in op 320 graden Celsius en het RF-niveau met de S-lens op 55. Als u het CZE MS/MS-experiment wilt uitvoeren, start u eerst de methode voor gegevensverwerving op de massaspectrometercomputer door run-sequentie te selecteren.

Start vervolgens de capillaire elektroforesevolgorde op de capillaire elektroforese auto-sampler computer. Voer een databasezoekopdracht uit met TopPIC in de TopPIC-suite en in de grafische gebruikersinterface van TopPIC. Klik op databasebestand en selecteer een geschikte database om te zoeken.

Klik op spectrumbestand en selecteer de gegenereerde ms2. msalign-bestand gegenereerd als de invoer. Selecteer het MS1-functiebestand en kies het gegenereerde functiebestand.

Stel cysteïne carbamidomethyl C57 als een vaste wijziging als gevolg van de iodoacetamide behandeling. Selecteer de functie lokdatabase en selecteer onder afsluitinstellingen de foutdetectiesnelheid in het vervolgkeuzemenu naast spectrumniveau. Stel het false discovery rate in op 0,01 op spectrumniveau.

Laat de genererende functie niet geselecteerd en stel de fouttolerantie in op 15 delen per miljoen. Stel de false discovery rate in op 0,05 op proteoform niveau. Selecteer er onder geavanceerde parameters twee voor het maximum aantal massaverschuivingen in het vervolgkeuzemenu.

Stel de maximale massaverschuiving van onbekende modificaties in op 500 daltons. Laat alle andere parameters op hun standaardwaarden staan en klik op de startknop rechtsonder in de grafische gebruikersinterface. Het representatieve elektroferogram voor het standaard eiwitmengsel wordt getoond.

Het standaard eiwitmengsel wordt meestal ten minste in tweevoud uitgevoerd om de scheidingsefficiëntie en de reproduceerbaarheid van het systeem te evalueren. De scheidingsefficiency kan met het aantal theoretische platen van sommige proteïnen worden geëvalueerd. De reproduceerbaarheid kan worden geëvalueerd door de relatieve standaarddeviaties van eiwitintensiteit en migratietijd.

Het CZE MS/MS platform kan worden gebruikt voor grootschalige karakterisering van proteoforms in verschillende complexe proteomen, waarbij meer dan 500 proteoforms en 190 eiwitten uit een E.coli proteoom in één run met veel vertrouwen worden geïdentificeerd. Hier kan een ingezoomd oog op het elektropherogram worden gebruikt om het scheidingsvenster van het systeem te beoordelen. De zeer lage E-waarde en spectrale FDR suggereert het hoge vertrouwen van de proteoform ID.The hoge aantal gematchte fragmentionen geeft verder het hoge vertrouwen van de ID.While een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de geëtste scheiding capillaire draad in de elektrospray zender langzaam en voorzichtig.

Stabiele isotopenetikettering of labelvrije methoden kunnen worden opgenomen in de CZE MS-procedure om te bepalen hoe proteoform overvloed verandert in cellen over verschillende omstandigheden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van top-down proteomics om de rol van proteovormen te onderzoeken bij het reguleren van verschillende biologische processen in cellen. Vergeet niet dat het werken met fluorzuur zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals goede persoonlijke beschermingsmiddelen en het hebben van noodprocedures moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.