Absolute kwantificering van inositolpyrosfaten door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie
13 augustus 2021
Een procedure voor capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie voor de absolute kwantificering van inositolpyrosfaten uit zoogdiercelextracten wordt beschreven.
Dit levert hoogwaardige resultaten op voor het inositolfosfaatmetabolisme in alle organismen die we tot nu toe hebben getest. Het zal ook inzicht geven in nieuwe cellulaire biosynthetische paden waarvan we ons momenteel bewust zijn. Analyse van inositol fosfaat metabolisme door CE-ESI-MS is sneller, zeer gevoelig, en in staat van het verstrekken van structuur informatie voor inositol fosfaat assemblages.
Om te beginnen, zet een Capillaire Elektroforese Electrospray Ionization Mass Spectrometry of CE-ESI-MS-systeem op, bestaande uit een commercieel CE-systeem en een triple quadrupole tandem massaspectrometer, uitgerust met een Agilent Jet Stream ESI-bron. Sluit vervolgens de mantelstroom 1:100 splitter en de isocratische vloeistofchromatografiepompuitlaat aan en zorg ervoor dat de injectieflacon van het CE-systeem op dezelfde hoogte is als de sproeipunt van de massaanalysator. Gebruik vervolgens de MassHunter Workstation-versie of vergelijkbare MS-software om het hele systeem en de gegevensverzameling en -analyse te beheren.
Na het voorbereiden van de CE-loopbuffer en mantelvloeistof, installeert u de mantelvloeistof door gedurende vijf minuten met vijf milliliter per minuut te spoelen. Stel vervolgens het debiet in op één milliliter per minuut en de pompdruk op 180 bar. Zorg ervoor dat de gerecyclede slang weer aansluit op de vloeibare fles om het oplosmiddel opnieuw te gebruiken.
Vervolgens, met behulp van een capillaire kolomsnijder met een roterend diamantblad, slijpt u beide uiteinden van een CE-MS-capillair met een UV-detectievenster goed. Verwijder vervolgens twee tot drie centimeter polyimidecoating aan beide uiteinden met een aansteker en reinig het capillaire oppervlak met Isopropanol. Om het capillair te installeren, past u het capillair af op de CE-MS-cassette.
Klik vervolgens op de knop Cassette wijzigen en installeer de cassette in het CE-apparaat. Om het capillair te activeren, spoelt u het capillair eerst met één molair natriumhydroxide, gevolgd door water gedurende 10 minuten en vervolgens ce-loopbuffer gedurende 15 minuten. Steek vervolgens het capillair in de CE-MS-sproeier.
Gebruik een vergrootglas en de stelschroef in de spuitmachine om de capillaire uitlaat nauwkeurig af te stellen, zodat het capillaire uiteinde ongeveer 0,1 millimeter uit de spuitpunt steekt. Controleer de stabiliteit van de ESI-spuitmachine in de modus Volledige scan. De fluctuatie van totale ionenelektroferogrammen moet binnen 5% zijn Voer vervolgens een testrun uit met inositolfosfaatnormen.
Meng na het bereiden van het mengsel van interne normen 10 microliter van het monster met 0,5 microliter van het mengsel van interne normen en een injectieflacon met CE-monster. Wanneer u het bevoorradingssysteem gebruikt, klikt u op de knop Fles wijzigen. Doe de bereide 250 milliliter CE-loopbuffer in de elektrolytfles.
Klik vervolgens op Schone buizen die de vulnaald in een waterflacon bewaren. Stel de ESI- en MS-parameters in. Optimaliseer vervolgens de bronparameters met behulp van een bronoptimalisatie met een mengsel van inositolpolyfosfaatstandaarden en meerdere reactiebewakingsinstellingen met behulp van MassHunter Optimizer met alle normen.
Voer vervolgens een run uit voor de inositolfosfaatextracten en controleer de resultaten. Stel een volgorde in wanneer er meer voorbeelden zijn. Laat de MS na de meting in de stand-bymodus staan en schakel de vloeistofchromatografiepomp niet uit.
Vervang de CE-ESI-MS-sproeier door een LC-ESI-MS-sproeier wanneer er geen toevoer van mantelvloeistof is. Voor gegevensanalyse opent u kwantitatieve analysesoftware en maakt u een batch voor alle monsters. Maak vervolgens een nieuwe methode op basis van de verkregen meerdere reactiemonitoringgegevens en stel de Carbon-13 inositolfosfaten in als interne normen.
Controleer vervolgens de Multiple Reaction Monitoring Compound, Retention Time, interne standaarden, Concentration and Qualifier setup. Geef de validatie en afsluiting door om de methode toe te passen op de huidige batch. Sla de methode op.
Controleer vervolgens of elke piek in de batch correct is geïntegreerd. Integreer anders handmatig de piek. Exporteer de resultaten in een spreadsheet en kwantificeer de inositolpyrosfaten door de anoppitatierespons te vergelijken met de respectieve piekrespons van de stabiele isotoop gelabelde interne normen met bekende concentraties.
Ten slotte, met de gemeten concentratie in het inositolfosfaat, extractoplossing en het volume ervan, bereken de absolute hoeveelheden en normaliseer de hoeveelheid verder door celtellingen of eiwitgehalte. Bereken de cellulaire concentratie op basis van het aantal cellen en het gemiddelde celvolume van HCT116-cellen. De geëxtraheerde ionenelektroferogrammen van inositolpyrofosfaatnormen bij een concentratie van twee micromol worden hier weergegeven.
Metabolisme van inositolpyrosfaten bij zoogdieren met hun vereenvoudigde structuren wordt ingevoegd. Een CE-ESI-MS run van HCT116 cellen van University College London of UCL wordt hier getoond. CE-MS werd gebruikt om de variatie in IP8-niveaus tussen HCT116-cellen van UCL en die van NIH te kwantificeren.
De HCT116-cellen van UCL bevatten zeven keer hogere niveaus van IP8 dan die van NIH. Significante accumulatie van 1, 5-IP8 in de HCT116 UCL-cellen loopt parallel met een aanzienlijke toename van 1-IP7. CE-ESI-MS-analyse van met natriumfluoride behandelde HCT116-cellen van NIH toonde een verhoging van 5-IP7, samen met een vermindering van IP6 en een uiterlijk van 5-PPIP4.
Hoewel de niveaus van 1-IP7 tot op zekere hoogte daalden, is het niet volledig afwezig in met natriumfluoride behandelde cellen, maar meestal onder de detectiegrens. Het is belangrijk om een stabiele CE-ESI-MS-klasse te vormen. We raden aan om de herhaalbaarheid en gevoeligheid van het systeem te controleren voordat het wordt gemeten.
Deze techniek maakt het mogelijk om inositolfosfaatmetabolisme, implantaten en weefsels te verstrekken en biedt ook de mogelijkheid om het biologisch relevante inositolpyrofosfaat nauwkeurig te bestuderen.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie (CE-ESI-MS) om inositol pyrofosfaten uit extracten van zoogdiercellen te kwantificeren. De methode staat bekend om zijn snelheid, gevoeligheid en het vermogen om structurele informatie te verschaffen over inositol fosfaatassemblages.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Massaspectrometrie
- Biochemie
- Celbiologie
Achtergrond
- Inositol pyrofosfaten spelen een cruciale rol in cellulaire signalering.
- Inzicht in hun metabolisme kan inzicht geven in verschillende biologische processen.
- CE-ESI-MS biedt een snelle en gevoelige analysemethode.
- Vorige methoden misten de efficiëntie en detail die CE-ESI-MS biedt.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van inositol pyrofosfaten.
- Om het metabolisme van inositolfosfaten in zoogdiercellen te analyseren.
- Om variaties in inositol pyrofosfaatniveaus in verschillende cellijnen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Installatie van een CE-ESI-MS systeem met specifieke apparatuurinstellingen.
- Bereiding van CE running buffer en mantelvloeistof.
- Doorspoelen en activeren van de capillair voor optimale prestaties.
- Gegevensverzameling en analyse met behulp van MassHunter software.
Belangrijkste resultaten
- CE-ESI-MS kwantificeerd met succes inositol pyrofosfaatniveaus in HCT116 cellen.
- Er werden significante verschillen in IP8 niveaus waargenomen tussen HCT116 cellen uit verschillende bronnen.
- Wijzigingen in het inositol fosfaat metabolisme werden opgemerkt na behandeling met natriumfluoride.
- De methode toonde hoge herhaalbaarheid en gevoeligheid.
Conclusies
- CE-ESI-MS is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van het inositol fosfaat metabolisme.
- De techniek kan ons begrip van cellulaire biosynthetische paden verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere studies omvatten over inositolfosfaten in verschillende biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantitation of inositol pyrophosphates (PP-InsPs) enables mechanistic de-risking in target validation by providing quantitative readouts of phosphate homeostasis and cellular energy charge. This CE-ESI-MS method supports assay development for intracellular signaling pathways, offering baseline separation of regioisomers and absolute concentration data. The approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling temporal monitoring of PP-InsPs under experimental conditions, informing go/no-go decisions in preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking PP-InsPs to metabolic signaling and insulin sensitivity pathways.
- Operational Value: Provides high-throughput, sensitive quantification of low-abundance PP-InsPs without radioactive tracers, reducing assay complexity and cost.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by delivering absolute cellular concentrations of PP-InsPs, including minor isomers, for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers baseline separation of PP-InsP regioisomers, enabling specific detection of biologically relevant species in mammalian cells.
- Operational Value: Offers reproducible, quantitative outputs via stable isotope-labeled internal standards, ensuring assay standardization across runs.
- Scalability: Facilitates platform reuse for screening compound effects on inositol phosphate metabolism in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase PP-InsP dynamics to preclinical validation by monitoring temporal changes in HCT116 cells under experimental conditions like sodium fluoride treatment.
- Mechanistic De-risking: Reveals alterations in IP7/IP8 levels and PPIP4 appearance, supporting pathway-specific biomarker alignment and risk-adjusted advancement decisions.
- Disease-Relevant System: Applicable to studying phosphate homeostasis and cellular energy charge in oncology and metabolic disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by supplying quantitative, structurally resolved PP-InsP data that inform mechanistic understanding and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PP-InsPs as metabolic messengers surveying phosphate homeostasis and insulin sensitivity.
- Screening: Enables assay readiness through sensitive detection and baseline separation of PP-InsPs, allowing reliable compound evaluation in metabolic signaling assays.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (absolute concentrations, temporal changes) via MRM, enabling statistical comparison across conditions and cell lines.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by monitoring PP-InsP modulation in disease-relevant systems, supporting biomarker alignment and risk-adjusted decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable CE-ESI-MS capability for longitudinal studies of inositol phosphate metabolism across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through absolute quantitation of PP-InsPs, reduction of mechanistic ambiguity in inositol phosphate signaling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and sensitivity achieved via CE-ESI-MS with internal standard normalization and optimized source parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via quantitative PP-InsP readouts, capital efficiency by avoiding radioactive methods, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on PP-InsP modulation data, enabling informed advancement of compounds affecting phosphate homeostasis and energy signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in capillary electrophoresis, mass spectrometry optimization, and metabolite quantification using stable isotope-labeled standards.
- Needs instrumentation including a commercial CE system, triple quadrupole MS with Agilent Jet Stream ESI source, and MassHunter software for data acquisition and analysis.
- Demands cross-team standardization of CE running buffer preparation, sheath liquid flow rates (1 mL/min), and capillary installation procedures to ensure ESI spray stability (<5% TIC fluctuation).
- Involves adaptation considerations for different sample types (cells, tissues) requiring normalization to cell counts or protein content and appropriate internal standard selection.
- Includes practical limitations such as the need for system repeatability and sensitivity checks before measurements, and potential interference from high-abundance inositol phosphates during method development.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry (CE-ESI-MS) System
1:38
Preparation of Buffer, Capillary, and CE-MS System
3:28
Performing the CE-ESI-MS Runs
5:10
Data Analysis
6:50
Results: Quantitation of Inositol Pyrophosphates from Mammalian Cell Extracts by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry
8:35
Conclusion
