Absolute kwantificering van inositolpyrosfaten door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie

Dit levert hoogwaardige resultaten op voor het inositolfosfaatmetabolisme in alle organismen die we tot nu toe hebben getest. Het zal ook inzicht geven in nieuwe cellulaire biosynthetische paden waarvan we ons momenteel bewust zijn. Analyse van inositol fosfaat metabolisme door CE-ESI-MS is sneller, zeer gevoelig, en in staat van het verstrekken van structuur informatie voor inositol fosfaat assemblages.

Om te beginnen, zet een Capillaire Elektroforese Electrospray Ionization Mass Spectrometry of CE-ESI-MS-systeem op, bestaande uit een commercieel CE-systeem en een triple quadrupole tandem massaspectrometer, uitgerust met een Agilent Jet Stream ESI-bron. Sluit vervolgens de mantelstroom 1:100 splitter en de isocratische vloeistofchromatografiepompuitlaat aan en zorg ervoor dat de injectieflacon van het CE-systeem op dezelfde hoogte is als de sproeipunt van de massaanalysator. Gebruik vervolgens de MassHunter Workstation-versie of vergelijkbare MS-software om het hele systeem en de gegevensverzameling en -analyse te beheren.

Na het voorbereiden van de CE-loopbuffer en mantelvloeistof, installeert u de mantelvloeistof door gedurende vijf minuten met vijf milliliter per minuut te spoelen. Stel vervolgens het debiet in op één milliliter per minuut en de pompdruk op 180 bar. Zorg ervoor dat de gerecyclede slang weer aansluit op de vloeibare fles om het oplosmiddel opnieuw te gebruiken.

Vervolgens, met behulp van een capillaire kolomsnijder met een roterend diamantblad, slijpt u beide uiteinden van een CE-MS-capillair met een UV-detectievenster goed. Verwijder vervolgens twee tot drie centimeter polyimidecoating aan beide uiteinden met een aansteker en reinig het capillaire oppervlak met Isopropanol. Om het capillair te installeren, past u het capillair af op de CE-MS-cassette.

Klik vervolgens op de knop Cassette wijzigen en installeer de cassette in het CE-apparaat. Om het capillair te activeren, spoelt u het capillair eerst met één molair natriumhydroxide, gevolgd door water gedurende 10 minuten en vervolgens ce-loopbuffer gedurende 15 minuten. Steek vervolgens het capillair in de CE-MS-sproeier.

Gebruik een vergrootglas en de stelschroef in de spuitmachine om de capillaire uitlaat nauwkeurig af te stellen, zodat het capillaire uiteinde ongeveer 0,1 millimeter uit de spuitpunt steekt. Controleer de stabiliteit van de ESI-spuitmachine in de modus Volledige scan. De fluctuatie van totale ionenelektroferogrammen moet binnen 5% zijn Voer vervolgens een testrun uit met inositolfosfaatnormen.

Meng na het bereiden van het mengsel van interne normen 10 microliter van het monster met 0,5 microliter van het mengsel van interne normen en een injectieflacon met CE-monster. Wanneer u het bevoorradingssysteem gebruikt, klikt u op de knop Fles wijzigen. Doe de bereide 250 milliliter CE-loopbuffer in de elektrolytfles.

Klik vervolgens op Schone buizen die de vulnaald in een waterflacon bewaren. Stel de ESI- en MS-parameters in. Optimaliseer vervolgens de bronparameters met behulp van een bronoptimalisatie met een mengsel van inositolpolyfosfaatstandaarden en meerdere reactiebewakingsinstellingen met behulp van MassHunter Optimizer met alle normen.

Voer vervolgens een run uit voor de inositolfosfaatextracten en controleer de resultaten. Stel een volgorde in wanneer er meer voorbeelden zijn. Laat de MS na de meting in de stand-bymodus staan en schakel de vloeistofchromatografiepomp niet uit.

Vervang de CE-ESI-MS-sproeier door een LC-ESI-MS-sproeier wanneer er geen toevoer van mantelvloeistof is. Voor gegevensanalyse opent u kwantitatieve analysesoftware en maakt u een batch voor alle monsters. Maak vervolgens een nieuwe methode op basis van de verkregen meerdere reactiemonitoringgegevens en stel de Carbon-13 inositolfosfaten in als interne normen.

Controleer vervolgens de Multiple Reaction Monitoring Compound, Retention Time, interne standaarden, Concentration and Qualifier setup. Geef de validatie en afsluiting door om de methode toe te passen op de huidige batch. Sla de methode op.

Controleer vervolgens of elke piek in de batch correct is geïntegreerd. Integreer anders handmatig de piek. Exporteer de resultaten in een spreadsheet en kwantificeer de inositolpyrosfaten door de anoppitatierespons te vergelijken met de respectieve piekrespons van de stabiele isotoop gelabelde interne normen met bekende concentraties.

Ten slotte, met de gemeten concentratie in het inositolfosfaat, extractoplossing en het volume ervan, bereken de absolute hoeveelheden en normaliseer de hoeveelheid verder door celtellingen of eiwitgehalte. Bereken de cellulaire concentratie op basis van het aantal cellen en het gemiddelde celvolume van HCT116-cellen. De geëxtraheerde ionenelektroferogrammen van inositolpyrofosfaatnormen bij een concentratie van twee micromol worden hier weergegeven.

Metabolisme van inositolpyrosfaten bij zoogdieren met hun vereenvoudigde structuren wordt ingevoegd. Een CE-ESI-MS run van HCT116 cellen van University College London of UCL wordt hier getoond. CE-MS werd gebruikt om de variatie in IP8-niveaus tussen HCT116-cellen van UCL en die van NIH te kwantificeren.

De HCT116-cellen van UCL bevatten zeven keer hogere niveaus van IP8 dan die van NIH. Significante accumulatie van 1, 5-IP8 in de HCT116 UCL-cellen loopt parallel met een aanzienlijke toename van 1-IP7. CE-ESI-MS-analyse van met natriumfluoride behandelde HCT116-cellen van NIH toonde een verhoging van 5-IP7, samen met een vermindering van IP6 en een uiterlijk van 5-PPIP4.

Hoewel de niveaus van 1-IP7 tot op zekere hoogte daalden, is het niet volledig afwezig in met natriumfluoride behandelde cellen, maar meestal onder de detectiegrens. Het is belangrijk om een stabiele CE-ESI-MS-klasse te vormen. We raden aan om de herhaalbaarheid en gevoeligheid van het systeem te controleren voordat het wordt gemeten.

Deze techniek maakt het mogelijk om inositolfosfaatmetabolisme, implantaten en weefsels te verstrekken en biedt ook de mogelijkheid om het biologisch relevante inositolpyrofosfaat nauwkeurig te bestuderen.