Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Het algemene doel van deze procedure is om de impact van het SOX5-gen op de complexiteit van de dendritische arborisatieneuronen tijdens de neuronale ontwikkeling in Drosophila te observeren. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van morfogenese van neuro-dendrieten, en de genfunctie in de ontwikkeling van het zenuwstelsel, om neurodegeneratieve ziektegenen beter te begrijpen. Uiteindelijk biedt deze techniek een kwantitatieve analyse van de complexiteit van dendrieten, die kan worden gebruikt in veel verschillende soorten neuro-dendrieten.

De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot genetisch mechanisme van neuro-degeneratieve ziekte, omdat mutatie de sleutel tot het begrijpen van genfunctie houdt. Set-up kruisen van UAS-GFP;ppk-GAL4 met de UAS-Sox102F-RNAi stamvliegen of W118-besturingselementen. Cultuur de vliegen onder standaard omstandigheden op 25 graden Celsius.

In ongeveer vijf tot zes dagen, gebruik tangen om zorgvuldig te verzamelen van de derde instar larven voor dissectie. Plaats een larve in een dissectie schotel gemaakt van silicium elastomeer basis, en een weefsel-cultuur Petri schotel. Plaats het gerecht vervolgens onder de dissectiemicroscoop.

Speld nu de staart van de larve om de middellijn bloot te stellen. Dan pin de larve mond haken, zodat de larve rugkant is omhoog. Voeg nu 200 microliter PBS aan de schotel toe om de larve onder te dompelen in oplossing.

Snijd vervolgens de staart en mond van de larve met kleine insnijdingen. Snijd vervolgens de larve open langs de rugmiddelijn en tussen de twee tracheas, gaande van caudal naar rostral. Plaats dan een pin op elk van de vier hoeken van het lichaam, zodat het lichaam ligt plat.

Bevestig nu de larve lichaamswand in vier procent PFA gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de larve met PBS drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt. Verwijder na de wasbeurten de pinnen en breng het weefsel over op een glazen schuif.

Dompel het weefsel vervolgens onder in antifade montagemedium en monteer het met een afdeksel. Laat het gemonteerde weefsel een uur drogen voordat het met vingernagelpoetsje op de afdekking wordt afgesloten. Bewaar deze dia's in het donker op vier graden Celsius.

Leg z-serie beelden vast met een confocale microscoop met behulp van een 20X-doelstelling. Stel eerst het bereik van de z-stappen in om alle DA-neuronen in de larvelichaamswand op te nemen en stel de stapgrootte in op een halve micrometer. Sla vervolgens de afbeeldingen op als TIF- of ND2-bestanden voor verwerking.

Evalueer vervolgens het aantal en de morfologie van de dendrieten op de DA-neuronen. Begin met het beoordelen van hun lengtes. Ten eerste, in Fiji ImageJ, split de beelden in aparte kanalen indien nodig.

Alleen het GFP-kanaal moet worden beoordeeld. Maak vervolgens een z-projectie. Selecteer in het nieuwe venster de maximale intensiteit voor projectietype en kies de begin- en stopsegmenten.

Klik vervolgens op OK om een z-projectieafbeelding te maken met duidelijke dendrietprojecties. Traceer nu de neurites met behulp van de plug-in tool. Ga eerst naar de soma van het neuron van belang en klik waar een dendriet uit het cellichaam tevoorschijn komt.

Klik dan op het puntje van dit dendriet. Als de blauwe lijn die de twee punten verbindt de lengte van de neurite loopt, drukt u op Y voor ja. Als deze regel vervolgens past op het volledige pad van de neurite, klikt u op voltooid pad.

Als de lijn niet op het pad past, klikt u op punten verder langs deze neurite om het pad te buigen in meerdere lijnsegmenten die passen bij de lengte van de neurite. Klik vervolgens op voltooid pad en ga verder met het markeren van het pad voor de volgende neurite. Nadat u alle overtrekpaden hebt voltooid, selecteert u de optie Analyse, Paden meten om de paden naar een CSV-bestand te exporteren.

Gebruik deze gegevens om de gemiddelde waarde van padlengtes voor analyse te berekenen en te berekenen. Bereken vervolgens het oppervlak van het neuron. Selecteer eerst het gereedschap voor tekenen met vrije hand in het venster Fiji ImageJ.

Sluit vervolgens de eindpunten van het neuron van belang aan. Selecteer vervolgens de optie Meten in het venster Analyseren. Het resultaat wordt weergegeven in een nieuw vak met de waarde voor het geselecteerde gebied.

Kopieer deze waarde naar de software voor gegevensanalyse. Bereken ten slotte het totale aantal branches met behulp van de plug-in Skeletonized Paths analyseren. De dendrieten van DA neuronen werden gelabeld door co-overexpressing GFP in hun soma en dendriet arbors voor GFP florescence imaging analyse.

De morfologie van dendrieten werd afgebeeld met behulp van een omgekeerde confocale microscoop. De dendrieten van DA neuronen werden getraceerd zoals beschreven. Het bestand werd gebruikt om de dendrietlengte te schatten.

Het uitschakelen van Sox102F in DA-neuronen in de derde instar-larve leidde tot een aanzienlijke vermindering van het totale aantal dendrieten met ongeveer de helft van de taklengte en met een eenvoudigere structuur, met slechts de helft van het aantal takken. Logischerwijs leidde dit tot een vermindering van het arboroppervlak. Dit protocol biedt een snelle methode om de ontwikkeling van DA sensorische neuronen te beoordelen.

Tijdens een poging deze procedure, zorg ervoor dat een ruim aantal beelden van elke groep DA neuronen te nemen om een goede dekking te krijgen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals dendrietanalyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de ontwikkeling van dendriet te beantwoorden. Sinds de ontwikkeling, deze techniek heeft geholpen onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen maken gevolgtrekkingen in neurodegeneratieve ziekte zoals de ziekte van Alzheimer met behulp van modelsystemen.