Name: Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer kwantitatieve analyse van neuronale dendritische arborisatiecomplexiteit in Drosophila met focus op het SOX5-gen. Deze methode helpt onderzoekers dendritische morfogenese bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedank William A. Eimer voor imaging technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Cure Alzheimer Fonds [R.E.T], het National Institute of Health [R01AG014713 en R01MH60009 voor de R.E.T; R03AR063271 en R15EB019704 naar A.L.], en de National Science Foundation [NSF1455613 naar A.L.].

1. experimentele voorbereiding
<ol><li>Voorbereiding van de volgende reagentia: Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS); Triton-X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldehyde (PFA), verdund tot 4% wordt afgesloten vóór gebruik; silicone-elastomeer base en genezen agent; antifade montage medium (bvverlengen goud); en vingernagel Pools.</li>
	<li>Voorbereiding van de volgende apparatuur: dissectie Microscoop, twee scherpe pincet en een paar van schaar voor microdissection, een aantal pinnen voor microdissection, een petrischaal voor het maken van de dissectie schotel, Microscoop dia's en coverslips, een confocal microscoop, en een computer met Fiji ImageJ software geïnstalleerd.</li>
</ol>2. de larven collectie
<ol><li>UAS-Sox102F-RNAi vliegen met UAS-GFP, ppk-GAL4 of W1118 wild type vliegen, respectievelijk metgezel. Cultuur vliegt in standaardomstandigheden bij 25 ° C.</li>
	<li>In ~ 5-6 dagen, verzamelen de derde instar-larven van UAS-Sox102F-RNAi / ppk-GAL4, UAS-GFP of UAS-GFP en ppk-GAL4 / + control zorgvuldig met een Tang voor dissectie.</li>
</ol>3. dissectie van de larven
Opmerking: Alle procedures in deze sectie worden geëxploiteerd onder een microscoop met microdissection. De vergroting is aan de onderzoekers. Probeer aan te passen aan de optimale zicht-weergave. ~ 4-6 X vergroting wordt aanbevolen.
<ol><li>Plaats een larve op een dissectie gerecht gemaakt van silicone-elastomeer basis en een weefselkweek petrischaal.</li>
	<li>PIN de larve mond haak zodat de dorsale zijde onder ogen te zien, en vervolgens pin de staart van de larve. Plaats de dorsale zijde in het midden zo veel mogelijk om de middellijn, die de open-up marker zullen bloot te stellen.</li>
	<li>200 µL van PBS aan de larve te behouden lichaam vocht toevoegen.</li>
	<li>Maak een knippen met een schaar langs de dorsale middellijn tussen de twee tracheas, van caudal naar rostraal. Maken een kleine snede op elk van de vier hoeken van het lichaam van de larve.</li>
	<li>Plaats een PIN-code op elk van de vier hoeken van het lichaam zodat het lichaam plat ligt.</li>
	<li>De larve lichaam muur vast in 4% PFA gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen in PBST voor 5 min. Repeat tweemaal meer.</li>
	<li>Verwijder de pennen uit het weefsel. Breng het weefsel op een glasplaatje, dek af met antifade montage medium, en monteren met een cover slip. Lucht drogen voor 1 h en verzegel de randen met vingernagel Pools.</li>
</ol>4. beeldvorming verwerking
Opmerking: De beelden werden genomen met behulp van een systeem van omgekeerde confocal microscoop. De gebruiker kan het fotograferen van het monster met behulp van een 20 X doelstelling (aanbevolen).
<ol><li>Z-serie opnamen. Open het dialoogvenster 'Capture Z-serie' in de confocal microscoop software. Het bereik voor het vastleggen van de beelden van de serie Z te bepalen.<ol>
<li>Klik op de knop "Boven en beneden". De boven- en onderkant positie en input van de waarden te bepalen "onderaan:" en "Top:" vakken. De "stap" in het dialoogvenster 'Capture Z-serie' instellen als 0,5 µm. Klik vervolgens op de "Run nu" knop om te verwerven van de Z-serie beelden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De verkregen afbeeldingen opslaan als *.tiff of *.nd2 bestanden.</li>
	<li>De dia's opslaan in een donkere houder bij 4 ° C na imaging.</li>
</ol>5. dendriet evaluatie
Opmerking: GFP eiwit was co-overexpressie in UAS-GFP en ppk-GAL4 vliegt in de neuronen van de da voor GFP fluorescentie imaging analyse. De lengte, de vertakking en de structuur van da neuronen in de derde instar-larven werden gekwantificeerd. Analyseparameters omvatten lengte van dendrites (µm), de oppervlakte (µm2), de totale aantal takken en vertakkende structuur (%). Figuur 1 toont de analyse gebruikte parameters in detail.
<ol><li>
Lengte van Dendrites Opmerking: De lengte van dendrites is de som van alle dendrites label in tracer plugin.<ol>
<li>Installeren en uitvoeren van Fiji ImageJ (https://fiji.sc/)20 software. Vervolgens splitsen beelden in afzonderlijke kanalen, als er meerdere kanalen van beelden. Opmerking: De afbeelding in dit protocol heeft slechts één kanaal van GFP.</li>
		<li>Uitvoeren "afbeelding | Stapels | Z project"om een Z-projectie; een nieuw venster verschijnt met de naam 'Z-projectie.' Klik op "max intensiteit" voor projectie type en organiseren nummers tussen segment start en stop segment afhankelijk van op individuele voorkeuren. Klik op 'OK'. Er verschijnt een Z-projectie-afbeelding met de presentatie van de projectie dendriet duidelijk.</li>
		<li>Sporen van de neurites.<ol>
<li>Selecteer "Plugins | Segmentatie | Eenvoudige Neurites Tracer"in het venster om te traceren van de dendrites. Zoek het neuron soma, en klik op een punt op een dendriet vanaf de cel lichaam, en een ander punt aan het uiteinde van deze dendriet. Opmerking: Het programma verbindt de twee punten met een blauwe lijn.</li>
			<li>Druk op "Y" in de plug-in venster als het pad duidelijk is; het pad dendriet is herleid tot de eindpunten van het geselecteerde pad in de zichtbare beelden. Klik op "volledige pad" op hetzelfde plugin venster; het segment is voltooid (Figuur 2). Opmerking: Sommige dendrites eindigde verder van de uitgangspunten, waarin het traject werd verdeeld in kleinere segmenten. De segmenten werden gecombineerd om een volledige pad voor de tracer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nadat een pad is voltooid, ga terug naar een nieuw punt waar de takken zijn. Het nieuwe pad kan worden gebouwd op; het vak "Alle paden" venster zal tonen de waarden van de lengte van alle paden (Figuur 3). De tracering-bestand opslaan en doorgaan met de onvoltooide sporen zoals afgebeeld in Figuur 2.</li>
		<li>De dendriet lengtegegevens exporteren door te klikken, "bestand | Exporteren als *.cvs"in het 'Plugin'-venster. Vervolgens een samenvatting van alle lengtes van het pad, en de gegevens exporteren naar een data-analyse/spreadsheet-software. (Figuur 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Oppervlakte van de da neuronen
	<ol>
<li>Selecteer de Freehand tekengereedschap in het venster 'Fiji ImageJ'. Het pad traceren, en sluit vervolgens de eindpunten. Het 'Analyseren'-menu, selecteer "Set metingen | Gebied." Klik op "maatregel" uit het menu 'Analyseren'. Het resultaat wordt weergegeven in een nieuwe doos met de waarde voor het gebied geselecteerd (Figuur 4). Kopieer het naar de software van de analyse van de gegevens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Totaal aantal van takken en vertakking structuur van de da neuronen
	<ol>
<li>Berekenen van het totale aantal takken door het openen van de "Analyse" en vervolgens "maken | Analyze Skeletonized paden"in het venster plugin van tracering (Figuur 5). Opmerking: De structuur van de arbor is de som van de niveaus van takken. Het pad is gedefinieerd tussen de cel lichaam en de dendriet tips en één pad kan bevatten meerdere branches, zoals de primaire arbors zijn de dendrites van de cel lichaam van neuron. De secundaire arbors zijn takken van de primaire en zo verder met het tertiair, quaternaire en quinary arbors. De structuur van dendriet vertakking wordt gescheiden afhankelijk van de niveaus van takken. Bijvoorbeeld, is de primaire % het aantal vestigingen verdeeld door totale aantal vertakking, enzovoort.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li>
<li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li>
<li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li>
<li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li>
<li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+through+Dishevelled%2C+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li>
<li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li>
<li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase%2FFurry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li>
<li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li>
<li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li>
<li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).</li>
<li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+reversal+of+Alzheimer%27s+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li>
<li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Neurite+Tracer%3A+open+source+software+for+reconstruction%2C+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dendrites die de epidermis innervate zijn de input gebieden van neuronen en hun morphologies bepalen hoe de informatie is ontvangen en verwerkt door individuele neuronen. Ontwikkeling dendriet morfologie weerspiegelt gene modulatie van dendriet organisatie. De Drosophila larvale da neuron van het perifere zenuwstelsel is een belangrijk model voor het bestuderen van dendriet ontwikkeling omdat: 1) de functionele gelijkenis met zoogdieren11,12; 2) vier kla...

Dendrites, die de vertakte projecties van een neuron, betrekking hebben op het veld dat van het neuron zintuiglijke en synaptische ingangen van andere neuronen1,2 omvat. Dendrites zijn een belangrijk onderdeel van synapse formation en spelen een cruciale rol in de integratie van synaptic ingangen, evenals de elektrochemische stimulatie in een neuron teeltmateriaal. Dendritische arborization (da) is een proces waarmee vormen de neuronen nieuwe dendritische bomen en takken maken nieuwe synapsen. De ontwikkeling en de morfologie van de da, zoals tak dichtheid en groepering patronen, resultaat van scriptingregel biologische processen en zijn sterk gecorreleerd aan neuronale functie. Het doel van dit protocol is bedoeld als een methode voor kwantitatieve analyse van neuronale dendritric arborization complexiteit in Drosophila.
De complexiteit van dendrites bepaalt de synaptische typen, connectiviteit en ingangen van partner neuronen. Vertakkende patronen en een bevolkingsdichtheid van dendrites betrokken zijn bij de verwerking van de signalen die naar de dendritische veld3,4 convergeren. Dendrites hebben de flexibiliteit om aanpassing in ontwikkeling. Bijvoorbeeld heeft synaptic signaling een effect op dendriet organisatie in de somatosensorische neuron tijdens de ontwikkelings fase en het volwassen zenuwstelsel5. De oprichting van neuronal connectiviteit is afhankelijk van de voedselproductie en de rijping van dendrites. Misvorming van dendrites wordt geassocieerd met verminderde neuronale functie. Studies hebben aangetoond dat de abnormaliteit van da neuron morfogenese aan de etiologie van meerdere neurodegeneratieve ziekten bijdragen kan, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), en Lou Gehrig's disease / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)6,7,8. Synaptic wijzigingen weergegeven in het beginstadium van AD, in overleg met de achteruitgang en de bijzondere waardevermindering van neuron functie7,8. Echter, de specifieke kenmerken van hoe dendriet pathologie bijdraagt aan pathogenese in deze neurodegeneratieve ziekten blijft ongrijpbaar.
De ontwikkeling van dendrites wordt gereguleerd door de genen die coderen voor een complex netwerk van regelgevende instanties, zoals de familie van de Wnt van eiwitten9,10, transcriptiefactoren en liganden op cel oppervlakte receptoren11,12 . Drosophila da neuronen bestaan uit vier klassen (klasse I, II, III, IV), van welke klasse IV da neuronen hebben de meest complexe vertakkende patronen en hebben gewerkt als een krachtige experimenteel systeem voor beter begrip morfogenese13, 14. Tijdens de vroege morfogenese, overexpressie en/of RNAi zwijgen van genen in klasse IV da neuronen leiden tot veranderingen in de vertakkende patronen en dendriet snoeien13. Het is belangrijk een praktische methode voor de kwantitatieve analyse van de neuronale dendritische arborization te ontwikkelen.
Wij hebben eerder aangetoond dat zwijgen van de Drosophila ortholog van SOX5, Sox102F, tot kortere dendrites van da neuronen en verminderde complexiteit in klasse IV da neuronen15 leidde. Hier presenteren we de procedure voor kwantitatieve analyse voor de complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila. Dit protocol, aangepast uit de vorige beschreven methodologie, biedt een korte methode om de ontwikkeling van de sensorische neuronen da assay. Het illustreert de robuuste afbeelding labeling en de da neuron in de derde instar larvale lichaam muur16,17,18,19. Het is een waardevolle protocol voor onderzoekers die willen onderzoeken van de NDAC en ontwikkelingsstoornissen verschillen in vivo.

<table><tbody><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Gibco Life Sciences</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 siliconen elastomeerbasis en uitharder</td><td>Dow Corning Corportation</td><td>3097366-0516;3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Fingernagellak</td><td>CVS</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Dumont</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5611</td><td></td></tr><tr><td>Insectenpinnen</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-6082-25</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglazen en dekglaasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-188-52</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve analyse van neuronale dendritische arborization complexiteit in drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites de vertakte projecties van een neuron worden en dendritische morfologie weerspiegelt synaptic organisatie tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Drosophila larvale neuronale dendritische arborization (da) is een ideaal model voor het bestuderen van de morfogenese van neurale dendrites en genfunctie in de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Er zijn vier klassen van da neuronen. Klasse IV is het meest complex met een vertakkende patroon dat betrekking heeft op bijna het hele gebied van de larvale lichaam muur. Wij hebben eerder het effect van het monddood maken van de ortholog van de Drosophila van SOX5 op klasse IV neuronale dendritische arborization complexiteit (NDAC) met behulp van vier parameters gekenmerkt: de lengte van dendrites, de oppervlakte van de dendriet dekking, de totaal aantal van takken, en de vertakkende structuur. Dit protocol stelt de workflow van NDAC kwantitatieve analyse, bestaande uit de larvale dissectie, confocal microscopie en afbeelding analysemethodes ImageJ softwarematig. Verder inzicht in da neuronale ontwikkeling en de onderliggende mechanismen zal verbetering van het inzicht van neuronale functie en aanwijzingen over de fundamentele oorzaken van neurologische en neurologische aandoeningen.

De dendrites van da neuronen waren gelabeld door co-overexpressing GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) in de da neurale soma en dendritische arbors voor GFP fluorescentie imaging analyse. De morfologie van da neuron dendrites was beeld door een omgekeerde confocal microscoop (Figuur 2).
De dendrites van da neuronen werden opgespoord met behulp van Fiji ImageJ software. Het bestand werd gebruikt voor het schatte...

Dit protocol is gericht op kwantitatieve analyse van complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila, die kan worden gebruikt voor studies van dendritische morfogenese.

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de impact van het SOX5-gen op de complexiteit van de dendritische arborisatieneuronen tijdens de neuronale ontwikkeling in Drosophila te observeren. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van morfogenese van neuro-dendrieten, en de genfunctie in de ontwikkeling van het zenuwstelsel, om neurodegeneratieve ziektegenen beter te begrijpen. Uiteindelijk biedt deze techniek een kwantitatieve analyse van de complexiteit van dendrieten, die kan worden gebruikt in veel verschillende soorten neuro-dendrieten.De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot genetisch mechanisme van neuro-degeneratieve ziekte, omdat mutatie de sleutel tot het begrijpen van genfunctie houdt. Set-up kruisen van UAS-GFP;ppk-GAL4 met de UAS-Sox102F-RNAi stamvliegen of W118-besturingselementen. Cultuur de vliegen onder standaard omstandigheden op 25 graden Celsius.In ongeveer vijf tot zes dagen, gebruik tangen om zorgvuldig te verzamelen van de derde instar larven voor dissectie. Plaats een larve in een dissectie schotel gemaakt van silicium elastomeer basis, en een weefsel-cultuur Petri schotel. Plaats het gerecht vervolgens onder de dissectiemicroscoop.Speld nu de staart van de larve om de middellijn bloot te stellen. Dan pin de larve mond haken, zodat de larve rugkant is omhoog. Voeg nu 200 microliter PBS aan de schotel toe om de larve onder te dompelen in oplossing.Snijd vervolgens de staart en mond van de larve met kleine insnijdingen. Snijd vervolgens de larve open langs de rugmiddelijn en tussen de twee tracheas, gaande van caudal naar rostral. Plaats dan een pin op elk van de vier hoeken van het lichaam, zodat het lichaam ligt plat.Bevestig nu de larve lichaamswand in vier procent PFA gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de larve met PBS drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt. Verwijder na de wasbeurten de pinnen en breng het weefsel over op een glazen schuif.Dompel het weefsel vervolgens onder in antifade montagemedium en monteer het met een afdeksel. Laat het gemonteerde weefsel een uur drogen voordat het met vingernagelpoetsje op de afdekking wordt afgesloten. Bewaar deze dia's in het donker op vier graden Celsius.Leg z-serie beelden vast met een confocale microscoop met behulp van een 20X-doelstelling. Stel eerst het bereik van de z-stappen in om alle DA-neuronen in de larvelichaamswand op te nemen en stel de stapgrootte in op een halve micrometer. Sla vervolgens de afbeeldingen op als TIF- of ND2-bestanden voor verwerking.Evalueer vervolgens het aantal en de morfologie van de dendrieten op de DA-neuronen. Begin met het beoordelen van hun lengtes. Ten eerste, in Fiji ImageJ, split de beelden in aparte kanalen indien nodig.Alleen het GFP-kanaal moet worden beoordeeld. Maak vervolgens een z-projectie. Selecteer in het nieuwe venster de maximale intensiteit voor projectietype en kies de begin- en stopsegmenten.Klik vervolgens op OK om een z-projectieafbeelding te maken met duidelijke dendrietprojecties. Traceer nu de neurites met behulp van de plug-in tool. Ga eerst naar de soma van het neuron van belang en klik waar een dendriet uit het cellichaam tevoorschijn komt.Klik dan op het puntje van dit dendriet. Als de blauwe lijn die de twee punten verbindt de lengte van de neurite loopt, drukt u op Y voor ja. Als deze regel vervolgens past op het volledige pad van de neurite, klikt u op voltooid pad.Als de lijn niet op het pad past, klikt u op punten verder langs deze neurite om het pad te buigen in meerdere lijnsegmenten die passen bij de lengte van de neurite. Klik vervolgens op voltooid pad en ga verder met het markeren van het pad voor de volgende neurite. Nadat u alle overtrekpaden hebt voltooid, selecteert u de optie Analyse, Paden meten om de paden naar een CSV-bestand te exporteren.Gebruik deze gegevens om de gemiddelde waarde van padlengtes voor analyse te berekenen en te berekenen. Bereken vervolgens het oppervlak van het neuron. Selecteer eerst het gereedschap voor tekenen met vrije hand in het venster Fiji ImageJ.Sluit vervolgens de eindpunten van het neuron van belang aan. Selecteer vervolgens de optie Meten in het venster Analyseren. Het resultaat wordt weergegeven in een nieuw vak met de waarde voor het geselecteerde gebied.Kopieer deze waarde naar de software voor gegevensanalyse. Bereken ten slotte het totale aantal branches met behulp van de plug-in Skeletonized Paths analyseren. De dendrieten van DA neuronen werden gelabeld door co-overexpressing GFP in hun soma en dendriet arbors voor GFP florescence imaging analyse.De morfologie van dendrieten werd afgebeeld met behulp van een omgekeerde confocale microscoop. De dendrieten van DA neuronen werden getraceerd zoals beschreven. Het bestand werd gebruikt om de dendrietlengte te schatten.Het uitschakelen van Sox102F in DA-neuronen in de derde instar-larve leidde tot een aanzienlijke vermindering van het totale aantal dendrieten met ongeveer de helft van de taklengte en met een eenvoudigere structuur, met slechts de helft van het aantal takken. Logischerwijs leidde dit tot een vermindering van het arboroppervlak. Dit protocol biedt een snelle methode om de ontwikkeling van DA sensorische neuronen te beoordelen.Tijdens een poging deze procedure, zorg ervoor dat een ruim aantal beelden van elke groep DA neuronen te nemen om een goede dekking te krijgen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals dendrietanalyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de ontwikkeling van dendriet te beantwoorden. Sinds de ontwikkeling, deze techniek heeft geholpen onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen maken gevolgtrekkingen in neurodegeneratieve ziekte zoals de ziekte van Alzheimer met behulp van modelsystemen.

quantitative-analysis-neuronal-dendritic-arborization-complexity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Tal van recente studies hebben aangegeven mutaties in synaptische eiwitten in verband met de hersenen pathologieën. Primaire gekweekte corticale neuronen bieden een grote flexibiliteit in het onderzoeken van de effecten van deze ziekte-geassocieerde eiwitten op dendritische rug morfologie en beweeglijkheid.

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

De dendritische arborization sensorische neuronen van...

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

Source: Ting, C., et al., Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure of preparing a Drosophila brain, capturing horizontal and frontal image stacks of GFP-labeled medulla dendrites under a confocal microscope, and creating a 3D reconstruction to analyze their morphology across layers and columns.

Analyzing Dendritic Morphology Across Drosophila Medulla Layers and Columns

We beschrijven twee methoden voor visualisatie en kwantificering van dendritische arborisatie in de hippocampus van muizenmodellen: real-time en extended depth of field beeldvorming. Terwijl de eerste methode geavanceerd topografisch traceren en kwantificering van de mate van vertakking toelaat, biedt de laatste snelle visualisatie van de dendritische boom.

Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.

Verwijdering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Spier Weefsel van Larvale Filets voor Immunofluorescentie Analyse van sensorische neuronen en opperhuidcellen

Hier laten we zien hoe het aantal en de ruimtelijke verdeling van synaptische actieve zones in Drosophila melanogaster fotoreceptoren te kwantificeren, gemarkeerd met een genetisch gecodeerde moleculaire marker, en hun modulatie na langdurige blootstelling aan licht.

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

Twee beeldanalyse algoritmen, "Drosophila NMJ Morfologie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" zijn gemaakt, automatisch kwantificeren negen morfologische kenmerken van de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ).

Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromusculaire Junction morfologie

Hier laten we zien hoe dendritische routering van Drosophila merg neuronen in de kolommen en lagen te analyseren. De werkstroom een ​​dual-beeldvorming techniek om de beeldkwaliteit en computerhulpmiddelen voor opsporing, registratie dendritische assen aan de hand kolommatrix en voor de analyse van dendritische structuren in 3D te verbeteren.

Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen

Hier presenteren we een Golgi-Cox protocol in uitgebreid detail. Deze betrouwbare weefselvlekmethode zorgt voor een hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus, en door de hele hersenen, met minimale probleemoplossing.

Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Leer kwantitatieve analyse van neuronale dendritische arborisatiecomplexiteit in Drosophila met focus op het SOX5-gen. Deze methode helpt onderzoekers dendritische morfogenese bestuderen.

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Meer video's verkennen