Visualisatie en kwantificering van mesenchymale cel Adipogenic differentiatie mogelijkheden met een Lineage specifieke Marker

Het algemene doel van deze procedure is om de differentiatie van stromale cellen in een adipogene lijn te visualiseren en te kwantificeren, met behulp van een lijn-specifiek eiwitmarker, vetzuurbindend eiwit vier. Dit wordt bereikt door eerst het isoleren en uitbreiden van de belangrijke stromale cellen. De stromale cellen worden vervolgens geoogst en geplaatst in standaard in-vitro kweekplaten.

Na enkele dagen incubatie worden de cellen behandeld met een adipogene differentiatiemedium. De cellen worden gedurende 14 dagen geïncubeerd, met regelmatige vervanging van het medium. Na differentiatie worden de cellen gefixeerd en gekleurd met antilichamen tegen vetzuurbindend eiwit vier.

Een geautomatiseerd immunofluorescent microscoop met hoge inhoud wordt gebruikt om beelden van de gelabelde cellen in de microputjes te vastleggen. De differentiatie wordt vervolgens gekwantificeerd met behulp van gespecialiseerde beeldanalysesoftware. In tegenstelling tot de traditionele methoden voor het meten van adipogene differentiatie met behulp van kleurstoffen zoals Oil Red O, gebruikt de in deze video beschreven test een antilichaam tegen het lijn-specifiek eiwit, vetzuurbindend eiwit vier, om adipogene differentiatie te bevestigen.

Door dit te doen, kwantificeert deze methode veranderingen in genexpressie die overeenkomen met adipogene differentiatie. Deze test kan een schat aan informatie leveren, inclusief het percentage gedifferentieerde cellen, de intensiteit van het fluorescentiesignaal per cel en veranderingen in celmorfologie. De mogelijkheid om meerdere kenmerken te analyseren maakt de identificatie van mogelijke subtiele veranderingen in differentiatie in reactie op verschillende behandelingen mogelijk.

Deze test heeft ook een hoge doorvoercapaciteit, waardoor deze ideaal is voor toepassingen in hoge doorvoer geneesmiddelenonderzoek. Resuspendeer de cellen in compleet ASC-medium, dat DMEM/F-12 basaal medium is, aangevuld met 10% foetaal bovien serum, GlutaMAX en antibiotica. Pipetteer in een 96-well kweekplaat, met 5000 cellen per putje.

Er zijn acht putjes nodig voor elke donor. Vier putjes krijgen controlemedium, terwijl de rest differentiatiemedium krijgt. Elke vierde put van elke behandeling zal dienen als primaire controle.

Incubeer de cellen bij 37 graden, bevochtigd met een atmosferische conditie van 5% koolstofdioxide gedurende vier dagen. Dit is om de cellen toe te laten groeien tot confluëntie in elke put. Op dag vier haalt u de platen uit de incubator.

Verwijder de helft van het medium uit elke put. Voeg een gelijk volume compleet ASC-medium, of adipogene differentiatiemedium, dat is aangevuld met insuline, isobutylmethylxanthine, dexamethason en indomethason toe. Incubeer de plaat bij 37 graden, bevochtigd met een atmosferische conditie van 5% koolstofdioxide.

De tijd die nodig is voor voldoende differentiatie is 14 dagen. Gedurende deze tijd, ververs het medium door om de twee tot drie dagen een mediumwisseling uit te voeren. Na differentiatie haalt u de platen uit de incubator.

Pipetteer voorzichtig al het medium uit elke put. Fixeer de cellen door ijskoud methanol toe te voegen. Incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.

Verwijder de methanol en was met Tris-gebufferd zout. Blokkeer door 0,25% caseïneblokker toe te voegen. Incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

Verwijder caseïne en was vervolgens met Tris-gebufferd zout. Bereid het primaire antilichaammengsel voor door het anti-FABP4-antilichaam 200-voudig te verdunnen in antilichaamverdunningsbuffer. Voeg het mengsel toe aan alle putjes, behalve degene die zijn gereserveerd als primaire knooppuntcontrole.

Voeg in plaats daarvan antilichaamverrdünngsbuffer toe aan deze putjes. Incubeer gedurende een uur op kamertemperatuur. Na incubatie, was de cellen eenmaal met Tris-gebufferd zout.

Verwijder, voeg vers Tris-gebufferd zout toe en incubeer gedurende vijf minuten op de rocker. Herhaal dit proces tweemaal. Bereid het tweede reantilichaammengsel voor door Anti-Rabbit Alexa 488 tweede reantilichaam 200-voudig te verdunnen in antilichaamverdunningsbuffer.

Voeg DAPI toe, dat celkernen labelt, bij een uiteindelijke verdunning van één op 2000. Voeg het mengsel toe aan alle putjes en wikkel de plaat in folie om fotobleking te voorkomen. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.

Na incubatie, was de cellen met TBS en voer nog twee 15-minuten wasbeurten uit op de rocker. Verwijder alle buffer uit de putjes en voeg opslagbuffer toe, aangevuld met 0,4 milligram per milliliter thimerosal, om bacteriegroei te voorkomen. Een hoogwaardige screeningsmachine, uitgerust met een geautomatiseerde stage, focusobjectieven en filters, wordt gebruikt om deze bioassay te beeldvormen.

Controleer of de juiste filters op hun plaats zitten. Reinig de bodem van de plaat voor de beste kwaliteit. Laad de plaat in de stage met A1 gepositioneerd op de boven-linkse hoek.

Gebruik de plate acquisition wizard om essentiële informatie over het experiment op te nemen, zoals plaatnummer, vergroting, datum, experimentele omstandigheden en labeldetails. Selecteer het type microputplaat dat wordt gebruikt. Gebruikers kunnen putjes en het aantal sites selecteren dat moet worden verworven.

Selecteer alle putjes die moeten worden afgebeeld door het raster te markeren. Beweeg de stage naar de helderste put. Het selecteren van de helderste put zorgt ervoor dat alle beelden worden verkregen met pixelwaarden die in een lineair bereik liggen, en dus direct evenredig zijn met de kleurintensiteit.

Als deze stap niet wordt uitgevoerd, kunnen de beelden die in helderdere putjes zijn genomen oververzadigd zijn. Selecteer de juiste kanaalcombinaties, belichtingstijd en Z-offsetparameters voor het experiment. De filters die worden gebruikt voor het beeldvormen van FABP4 en DAPI komen overeen met de specifieke labels die worden gebruikt om de kleuring te visualiseren.

Alexa 488, dat exciteert bij 480 nanometer en emetteert bij 560 nanometer, werd gebruikt om FABP4 te visualiseren. En de DAPI-kleurstof, die exciteert bij 360 nanometer en emetteert bij 460 nano