Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Het doel van dit onderzoek is om cellen efficiënt en snel uit vetweefsel te isoleren. Traditionele spijsvertering kost veel tijd en kan oververteren. Onze enzym- en mechanische golfmaat biedt zachte verspreiding en verkort de isolatietijd.

Om te beginnen plaats je een stuk achterste subcutane vetweefsel van een geëuthanaseerd varken in een kweekschaal. Dissecteer langs het natuurlijke vlak tussen het vetweefsel en de dermis om een complete ULB-plaat van twee tot drie millimeter dik te verkrijgen. Spoel de ULB één keer af in ijskoude, steriele zoutoplossing.

Na het scheuren van een steriele kweekschaal weeg je het weefsel in de steriele schaal op een vooraf gesteriliseerde balans. Voor elke 1,8 gram weefsel voeg je 10 milliliter ijskoude D-Hank's buffer toe en houd je het weefsel volledig ondergedompeld. Gebruik een steriele chirurgische schaar om alle zichtbare bloedvaten uit het weefsel te identificeren en te verwijderen.

Verwijder bindweefsel en fibrotische componenten. Gooi de verwijderde materialen weg in aangewezen biohazard-containers. Spoel het weefsel in D-Hanks buffer af om achtergebleven bloed en vuil te verwijderen.

Weeg het weefsel in de steriele kweekschotel op een vooraf gesteriliseerde balans na het scheuren. Breng 1,8 gram van de spoelweefselfragmenten over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 800 microliter A-type weefseldissociatiebuffer toe aan de buis.

Gebruik een steriele oogschaar om het weefsel in de buis in stukken van ongeveer één tot twee kubieke millimeter te snijden. Breng het minceweefsel samen met de omliggende buffer over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg 200 microliter A-type weefseldissociatiemiddel toe aan de buis.

Roer en schud de tube voorzichtig met de hand drie keer om de inhoud te mengen. Zorg ervoor dat de vetfragmenten volledig in de dissociatieoplossing zijn opgenomen. Controleer of de buisdop goed gesloten is.

Plaats de buis in een metalen bad bij 37 graden Celsius en laat het vijf tot tien minuten incuberen. Breng het gedeeltelijk verteerde vetweefsel in buffer over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, bestemd voor het mechanische dissociatiesysteem. Voer het vooraf ingestelde programma uit voor vetweefsel om mechanische dissociatie uit te voeren met een 200 hertz sinusgolf.

Verzamel de celsuspensie en voer deze door een 200 micrometer celfilter in een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis. Voeg vijf milliliter voorkoelde D-Hank-oplossing bij vier graden Celsius toe aan de zef. Spoel de zeef twee keer af met de D-Hank oplossing.

Centrifugeer de gefilterde celsuspensie op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gebruik een steriele pasteurpipette om de supernatante lipidenlaag te aspireren en af te voeren, terwijl je één milliliter buffer overlaat om de adipocytenlaag te beschermen. Verzamel de tweede laag met de adipocyten zonder de derde en vierde laag te verstoren.

Aspireer en gooi de derde laag weg. Voeg één milliliter van D.Hank's buffer toe aan de onderste pellet die de stromale vasculaire fractie of SVF bevat. Suspendeer de celpellet voorzichtig opnieuw in de buffer om een celconcentratie van twee tot vijf keer tien te bereiken, met een kracht van zes cellen per milliliter.

Bereid de SVF-celsuspensie voor in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Houd de suspense op ijs tot gebruik. Voeg 10 microliter SVF-celsuspensie en 10 microliter 0,4% trypanblauwe oplossing toe in een steriele microcentrifugebuis van 0,5 milliliter.

Pipetteer voorzichtig drie keer op en neer. Breng 10 microliter van het gekleurde celmengsel over op een telglaas, geschikt voor de geautomatiseerde celteller. Controleer of het monster de kamer volledig vult zonder over te lopen.

Plaats de telglijbaan in de automatische celteller. Selecteer het type trypan blue assay en pas indien nodig het celconcentratiebereik aan. Druk op tellen om geautomatiseerde celtelling te starten.

Monitor de beelden van de telkamer en observeer het automatische onderscheid tussen levende en dode cellen. Noteer het percentage cellevensvatbaarheid en het totale aantal levensvatbare cellen dat op het instrumentscherm wordt weergegeven. Voer drie onafhankelijke metingen uit voor elk monster.

Bereken de gemiddelde levensvatbaarheid en de celopbrengst per gram vetweefsel. Bereid een kleuringsoplossing voor met vijf microgram per milliliter huksed en één micromolair BODIPY in D.Hank's. Incubeer de geïsoleerde adipocyten in de kleuroplossing gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.

Gebruik een zelfgemaakt, adipocytvriendelijk glassysteem voor glaasdeksel voor preparaten die geschikt zijn voor fluorescentiemicroscopie. Het zelfgemaakte adipocytvriendelijke montagesysteem maakte een gelijkmatige verdeling van intacte adipocyten mogelijk voor heldere beeldvorming. In tegenstelling tot traditionele methoden die dichtbevolkte, meerlaagse opbouw produceerden, vertoonden de geëxtraheerde adipocyten een intacte structuur en normale morfologie.

De overlevingskans van adipocyten verkregen met de mechanische dissociatiemethode was significant hoger vergeleken met de traditionele enzymatische hydrolysemethode. De gezuiverde en gekweekte, van vetweefsel afgeleide stamcellen vertoonden een uniforme fibroblastachtige morfologie met langwerpige spilvormige cellen die ordelijk waren gerangschikt. De meeste cellen bleven ongekleurd, wat op levensvatbaarheid wijst, terwijl slechts een klein deel blauw kleurde, wat dode cellen vertegenwoordigt.

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de geïsoleerde celkenmerken over het vetdepot te vergelijken. De geïsoleerde SVF's uit het protocol kunnen worden gebruikt voor organoïde constructie en zuivering van vetstamcellen. Toekomstig onderzoek zou de isolatiemethode verder kunnen optimaliseren, rekening houdend met de vetweefselvariaties in de extracellulaire matrix over het depot.