Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Het algemene doel van het gebruik van een combinatie van micromanipulatie en lichtmicroscopietechnieken zoals FRAP en fotoactivatie is om de ruimte-tijddynamiek van eiwitten die betrokken zijn bij cytoskeletregulatie en migratie in verschillende omstandigheden of op een signaalroute-afhankelijke manier te monitoren. De micromanipulatiemethoden die hier worden besproken, zijn nuttig voor directe levering van elk type molecuul in cellen, evenals voor lichtgeïnduceerde manipulatie van eiwitactiviteit binnen gedefinieerde subcellulaire locaties. Dus het belangrijkste voordeel van de hier gepresenteerde technieken is dat ze het mogelijk maken om de onmiddellijke effecten die eiwitten op cellen uitoefenen samen met het volgen van hun mobiliteit door de cel te bepalen.

Om deze procedure te beginnen, passeer eerder gekweekte B16-F1-cellen in een verhouding van één op vijf in een plastic schaal van drie centimeter. Afzuigen het celkweekmedium. Was de cellen met PBS, zuig de PBS af en voeg Trypsine EDTA toe om de cellen los te maken.

Voeg celkweekmedium toe aan de trypsiniseerd cellen. Herschort en breng de cellen over naar falconbuisjes, centrifugeer daarna gedurende drie tot vijf minuten bij 1000 rpm. Nadat de B16-F1-cellen in een schotel van drie centimeter zijn geplaatst en ze minimaal zes uur de tijd hebben gehad om zich te verspreiden, transfecteer de B16-F1-cellen door een mengsel van 500 nanogram DNA-construct en één microliter transfectie-reagens toe te voegen in een oplossing met 150 millimolar natriumchloride.

Voor de B16-F1-cellen bekleed 15 millimeter dekglasjes met 150 microliter laminine-oplossing en incubeer gedurende één uur op kamertemperatuur. Voor de NIH 3T3-cellen bekleed de dekglasjes met fibronectine-oplossing en incubeer gedurende één uur op kamertemperatuur. Na incubatie was de laminine- en fibronectine-incubeerde dekglasjes met PBS en zuig vervolgens de PBS af.

Zaai twee milliliter van de NIH 3T3-fibroblasten in een verhouding van één op twintig van een confluënte schotel op de fibronectine-gecoate dekglasjes. Pipet twee milliliter van de getransfecteerde B16-F1-cellen in een verhouding van één op dertig van een confluënte schotel op de laminine-gecoate dekglasjes. Laat de cellen vervolgens overnacht in een weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius verspreiden op laminine- en fibronectine-gecoate dekglasjes voorafgaand aan microscopie.

Plaats het dekglaasje met de cellenkant omhoog op een warmtegeleide RC-26 aluminium beeldvormingskamer. Plaats vervolgens een plastic verzegeling bovenop het dekglaasje om een veilige verzegeling tussen het dekglaasje en de kamer te maken, zet vast door de plastic verzegeling met de glijklemmen van de kamer vast te schroeven om lekken van het medium te voorkomen. Pipet nu 37 graden Celsius voorverwarmd microscopie-medium in het centrale gebied.

Voer de warmtedetector in de aangewezen sleuf van de kamer in en koppel de elektroden van de kamer aan een TC-324B automatische temperatuurregelaar die een constante temperatuur van 37 graden Celsius handhaaft. Centrifugeer een eerder ontdooid eiwit-oplossing bij 10.000G gedurende minimaal 30 minuten om eiwitaggregaten te verwijderen die kunnen leiden tot het verstoppen van de naald indien aanwezig in de micro-injectie capillair. Gebruik een flexibele pipettip om een micro-injectienaald te laden met één microliter eiwit-oplossing vanaf de achterkant.

Als er luchtbellen in de naaldtip aanwezig zijn, tik voorzichtig op de basis van de naald om ze te verwijderen. Pas vervolgens de naaldhouder op het micromanipulatieapparaat zorgvuldig aan. Wanneer de micro-injectienaald in de naaldhouder wordt geschroefd, oefen druk uit op de naald met behulp van een micro-injectiedrukapparaat voordat de naaldtip in het celkweekmedium wordt getransloceerd.

Positioneer vervolgens de naald in het gezichtsveld met behulp van een laagvergrotingsobjectief en zoek vervolgens een cel van belang en laat de naald geleidelijk boven de cel zakken. Voor micro-injectie raakt u voorzichtig de plasmamembraan van de cel aan, wat voldoende kan zijn om de cel te penetreren of om een tijdelijke membraanbreuk te bevorderen door een zeer zachte tik op de microscoopopstelling. Stop het injectieproces zodra het stromen in de cel zichtbaar is door de naaldtip omhoog te bewegen in het medium.

Voordat u de laser activeert, schakelt u over naar het GFP-kanaal en start u de aankoop van de tijdsverloopopname. Hierna tekent u handmatig het gebied dat moet worden fotobleken op het GFP-kanaal terwijl u het display bekijkt. Start de fotobleken door een handmatige trigger van de 405 nanometer laser minimaal drie tot vier frames na het begin van de beeldacquisitie.

Stel de GFP 488 nanometer beeldacquisitie in de software in op 500 milliseconden belichting en 1500 milliseconden tijdsinterval. Pas vervolgens de software-instellingen aan voor het verkrijgen van dubbelkanaals of driekanaals tijdsverloopfilmpjes door het golflengteseriesvierkant te markeren en het gewenste aantal kanalen te selecteren in het menu voor het verkrijgen van golflengten. Voordat u de laser activeert, start u de aankoop van de tijdsverloopopname en tekent u handmatig het gebied dat moet worden fotogeactiveerd op het fasecontrastkanaal terwijl u het display bekijkt.

Start hierna de fotoactivering door een handmatige trigger van de 405 nanometer laser minimaal drie tot vier frames na het begin van de beeldacquisitie. Voor analyse van de FRAP-resultaten, opent u de tijdsverloopfilmpjes afgeleid van VisiView op de MetaMorph-software. Haal intensiteitswaarden van de fotogeblakte gebieden voor elk tijdspunt van fluorescentieherstel door respectieve gebieden handmatig te tekenen met behulp van MetaMorph.

Teken een vorm aan de punt van het lamellipodiüm dat het volledige of een deel van het fotogeblakte gebied bedekt en pas de positie ervan handmatig aan op volgende frames indien nodig om veranderingen in de lamellipodiale intensiteiten van het respectieve gebied in de tijd tijdens verplaatsing van de voortschrijdende punt te volgen. Voor correctie van achtergrond en fotobleken acquisitie analyseert u gebieden