Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het chloroplast veld, bijvoorbeeld de samenstelling van de chloroplast eiwit import machines. Het is essentieel voor vergroening en fotosynthese en dus voor de voedselproductie op de planeet. De moleculaire machine bestaat uit twee afzonderlijke complexen in het buiten- en binnenste lid van het chloroplast genaamd TOC en TIC, maar de samenstelling is niet volledig bekend.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de zuivering van Arabidopsis TOC / TIC complex kan worden bereikt in een enkele stap zuiveringsmethode, TAP-TOC zuivering. Het is een specifieke en efficiënte methode. Over het algemeen kunnen onderzoekers die nieuw zijn bij deze methode worstelen omdat ze niet bekend zijn met de isolatie van chloroplastmembraanfracties, wasmiddel, oplosmiddel of affiniteitszuivering.

Na het bereiden van de Arabidopsis planten, maal 10 gram van drie weken oude zaailingen in vloeibare stikstof, met behulp van een koude mortel en stamper met zand. Voeg 20 milliliter koude slijpbuffer toe aan de gemalen weefsels. Meng goed en laat het mengsel ontdooien op ijs.

Vervolgens weken twee lagen van snelle filtratie materiaal met slijpbuffer. Filtreer het homogenaat door de twee lagen filtermateriaal in een conische centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer het filtraat op 1, 500 keer g in vier graden Celsius gedurende 10 minuten en breng de supernatant over op een verse, voorgekoelde conische centrifugebuis van 50 milliliter.

Herhaal de centrifugatie nogmaals onder dezelfde omstandigheden. Breng de supernatant naar een koude 38,50 milliliter ultracentrifuge buis en vul het tot 35 milliliter met koude slijpbuffer. Gebruik een ultracentrifuge om het monster gedurende een uur te centrifugeren op 100, 000 keer g en vier graden Celsius.

Met behulp van een glazen Teflon homogenisator, resuspend de groene pellet in slijpbuffer. Centrifuge op 100, 000 keer g en vier graden Celsius gedurende een uur en gooi de supernatant. Gebruik de glazen Teflon homogenisator om de groene pellet opnieuw op te hangen in 18,75 milliliter van één x slijpbuffer.

Voeg vervolgens nog eens 9.375 milliliter van een x slijpbuffer toe. Voeg 9.375 milliliter van vier x oplosoplossing toe om het uiteindelijke volume op 37,5 milliliter te brengen en gedurende 30 minuten op een roterende shaker bij vier graden Celsius te laten waerpen. Gebruik hierna een ultracentrifuge om het monster gedurende een uur te centrifugeren op 100, 000 g en vier graden Celsius.

Breng de supernatant met de oplosbaar membranen over naar een verse kegelvormige centrifugebuis van 50 milliliter. Na de voorbereiding van de IGG agarose hars, breng de eerder gewassen IGG agarose hars naar de 50 milliliter conische buis met de 37,5 milliliter van oplosbaar membranen. Broeden 's nachts op een roterende shaker op vier graden Celsius.

De volgende dag, sediment de IGG agarose hars op 100 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik een pipet om de supernatant te verwijderen. Was de IGG agarose hars in 37,5 milliliter buffer A en incubbate op een roterende shaker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Doorgaan met sedimenteren en wassen van de hars zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng hierna de IGG-agarose hars over naar een 500 microliter spinkolom met een filter van 35 micron. Was de kralen twee maal met 300 microliters van TEV elutie buffer voor evenwicht.

Voeg vervolgens 300 microliters van TEV-elutiebuffer toe die 10 microliter TEV-protease bevatten. Broed de spinkolom met kralen in een Thermomixer bij 16 graden Celsius en 350 rpm gedurende twee uur. Open vervolgens de draaikolom en plaats deze in een nieuwe, schone buis van 1,5 milliliter.

Draai deze buis op 100 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de eluate te verzamelen. In deze studie wordt een TAP gelabeld chloroplast envelop eiwit complex van transgene A.thaliana planten gezuiverd. Immunoblot analyse bevestigt dat isolaat TAP-TOC159 interageert met TOC75 en TOC33 van het TOC-complex.

De chloroplast buitenste membraan kinase, KOC1, waarvan bekend is dat fosforylaat TOC159 is ook co-geïsoleerd. De aanwezigheid van TIC110 laat zien dat het geïsoleerde TAP-TOC159 complex ook de componenten van het TIC-complex bevat. Het FBN1A-antilichaam herkende het TAP-TOC159-complex niet, wat duidt op de afwezigheid van verontreinigingen.

In de negatieve controle isoleerde NTAP-eiwit niet co-isoleren met een van de TOC-, TIC-eiwitten en bevestigt het de specificiteit van de TAP-TOC159-zuivering. Hoewel deze methode inzicht kan geven in chloroplast eiwitimport, kan het mogelijk worden toegepast op elk ander complex in het Arabidopsis thaliana-flessysteem. Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast, zoals westerse blotting of massaspectrometrie om de aanwezigheid van bekende componenten aan te tonen of om nieuwe componenten van de TOC- en TIC-complexen te identificeren.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoek op het gebied van chloroplast eiwitimport om de functie van nieuwe componenten van de TOC- en TIC-complexen te verkennen.