Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in chemische biologie en drugsontdekking. Zoals, bindt uw verbinding zich aan het doeleiwit? De belangrijkste voordelen voor deze techniek zijn dat er geen vereiste is van onthechting van de aanhangende cellen.

En ruimtelijke lokalisatie kan worden bepaald door beeldvorming. Hoewel we deze methode in cellijnen hebben toegepast, is het ook mogelijk om deze methode toe te passen op andere celsystemen zoals primaire culturen en coculturen. Voordat u de cellen plaatst, plaatst u zwarte 384-well beeldvormende testplaten in een weefselkweekkap en bedek u de platen met aluminiumfolie voordat u een standaardboor gebruikt om drie gaten met een diameter van 3,5 millimeter aan beide uiteinden van elke plaat te maken.

Wanneer de platen klaar zijn, gebruik aseptische techniek om een A-431 celcultuur te wassen met 5 tot 10 milliliter PBS. En broeden de cellen met twee milliliter trypsine bij 37 graden Celsius tot de cellen loskomen. Verdun de cellen na het tellen tot 5 keer 10 tot de 4e cel per milliliter in kweekmedium en zaad 40 microliter cellen tot elke put van elke testplaat.

Zachtjes schudden elke plaat van links naar rechts na het zaaien om een homogene verdeling van de cellen over de put bodems te garanderen. Om de effect van de plaatrand te minimaliseren, laat de cellen zich aan de bodem van de testplaten gedurende 20 minuten op kamertemperatuur in de achterkant van de laminaire stroomkap nestelen voordat u de platen twee tot drie dagen in een aangepaste bevochtigde kamer plaatst bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Op de dag van het experiment, gebruik een plaat wasmachine om het medium te aspirate van elke put.

En voeg 30 microliter van de verbinding van belang bij de juiste experimentele concentratie toe aan de juiste experimentele putten. Verzegel de samengestelde testplaten met ademende plaatafdichtingen. En breng de platen terug naar de celcultuur incubator voor 30 minuten.

Om de cellen bloot te stellen aan een hitte-uitdaging, eerst het waterbad op de juiste experimentele temperatuur, en plaats een onverzegelde dummy plaat met hetzelfde volume van medium per goed als de testplaat in het bad, samen met een thermokoppel thermometer voor het toezicht op de temperatuur in de putten. Wanneer de juiste experimentele temperatuur is bereikt, verwijdert u de ademende afdichting van elke testplaat en sluit u de platen opnieuw af met een strakke lijmaluminiumfolie om ervoor te zorgen dat er geen water in de putten lekt tijdens de daaropvolgende verwarming in het waterbad. Het toegankelijk houden van de geboorde gaten in het plaatframe.

Plaats de testplaten en een nieuwe dummyplaat in het waterbad, met de bodems van de platen schuin naar het wateroppervlak om de resterende lucht onder de platen te forceren en de temperatuur van de nieuwe dummyplaat te controleren. Een gelijkmatige verwarming van de plaat is van cruciaal belang voor de testprestaties. Zorg ervoor dat de plaat in het waterbad zodanig dat er geen luchtbellen gevangen onder.

Na drie minuten, onmiddellijk afkoelen van de platen in een tweede waterbad van kamertemperatuur water gedurende vijf minuten voor hun analyse. Om de cellen in beeld te brengen, voeg u eerst 10 microliter van 16% paraformaldehyde rechtstreeks toe aan de testplaten voor een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de fixatieperiode, was de cellen met 300 microliter PBS op de plaatwasser en voeg 20 microliters van 0,1%NP40 toe voor een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen zoals aangetoond. En blokkeer de cellen met 15 microliters van 1%runderserum albumine, of BSA, gedurende een uur bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens de plaatwasser om het blokkerende serum aan te sporen en voeg 10 microliter van het primaire antilichaam van belang toe aan de juiste putten voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, was elk goed met 300 microliter pbs, en label de cellen met 10 microliters van de juiste secundaire antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Voor nucleaire kleuring van de cellen, voeg 10 microliter van een geschikte nucleaire kleurstof aan elke put gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. En was de cellen in PBS zoals aangetoond.

Label de cellen met 10 microliter celmasker per put gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gevolgd door een laatste wasbeurt met PBS. Dan afzien van 60 microliter verse PBS aan elke put, en verzegelen de platen met aluminiumfolie tot beeldvorming.

Om de cellen in beeld te brengen, leg je vier beelden per put vast op een high-content imager met behulp van de juiste tl-kanalen onder de 10-voudige doelstelling met behulp van geautomatiseerde laserautofocus en pas binning toe tijdens de overname. Sla vervolgens de afbeeldingen op als 16-bits grijswaarden dot-tiff-bestanden, samen met de metagegevens. De herkenning van antilichamen mag niet worden verstoord door conformatieveranderingen in het doeleiwit die kunnen worden veroorzaakt door ligandbinding.

BirB796 heeft bijvoorbeeld een lange off rate en kwantificering van de doelbetrokkenheid is alleen mogelijk door een antigenererende ophaalstap toe te passen. Dit representatieve thermische aggregatiecurve-experiment voor cellen die worden behandeld met positieve en negatieve controleverbindingen illustreert typische eiwitstabilisatiebereiken na behandeling van de cellen met de verbindingen bij verschillende temperaturen. Hier wordt aangetoond dat een typisch isothermale dosisresponsvingsvingvingsvingertexperiment representatieve reeksen eiwitstabilisatie aantoont in reactie op verschillende doses experimentele verbinding.

De toepassing van isothermale warmte-uitdagingen voor samengestelde screening om nieuwe bindmiddelen van het doeleiwit te identificeren, maakt de analyse van een groot aantal verbindingen in één concentratie in één keer mogelijk, voordat isothermale dosisresponsvingeprinting van de hits om de beoogde eiwitstabilisatie te bevestigen. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de exacte experimentele omstandigheden, zoals de lengte en temperatuur van de hitte uitdaging invloed hebben op de waargenomen potentie van de verbindingen. Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde zeer gevaarlijk kan zijn.

En voorzorgsmaatregelen, zoals het volgen van richtlijnen voor institutionele veiligheid, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.