Voorbereiding van ritmisch-actief In Vitro neonatale knaagdier hersenstam-ruggenmerg en dun plakje

Deze methode vergemakkelijkt de reproduceerbare dissectie en snijden van knaagdieren hersenstam voor de vastgelegde analyse van de Mirian Medullary Respiratory Network. Deze techniek biedt een grote experimentele flexibiliteit, waardoor het mogelijk is om ofwel een in-vitro unblock of een slice voorbereiding voor de opname voor te bereiden. Deze methode kan worden gebruikt voor elektrofysiologie-experimenten om het neurale controlecircuit te verkennen dat ademhalingsritmes genereert en om de pathologie en desregulatie van de ademhaling in genetisch gemodificeerde knaagdieren te begrijpen.

Breng na dissectie van de neuraxis de geïsoleerde stam van het dier snel over naar een bescheerde dissectiekamer onder een dissectiemicroscoop en plaats de weefsels rugzijde omhoog, met het rostrale uiteinde naar de voorkant van de kamer. Speld het weefsel op de schouders en het meest caudale uiteinde van het ruggenmerg en maak een midsagittale incisie door de schedel na de pariëtale hechting om te voorkomen dat de cortex en de hersenstam die ten grondslag liggen aan de schedel. Beginnend bij de sagittale hechting en werken zijwaarts, knip de occipital hechtingen van de schedel om flappen van bot die kunnen worden gereflecteerd en vastgemaakt om te verankeren en stabiliseren van de rostral deel van de schedel te creëren.

Na het reflecteren van beide schedelflappen, accijns de rest van de hersenschors, waardoor het caudale gedeelte van het cerebellum relatief intact om een dorsale laminectomie uit te voeren. Gebruik microlender schaar en tangen om het spierstelsel rond de schedel en wervelkolom te verwijderen. Verwijder het weefsel langs de rugzijde van de ribbenkast, laat de ribben intact en knip voorzichtig de laterale processen van de wervellamina weg.

Na het wegsnijden van alle weefsel bovenlyseren de pons en medulla, de vermis, cerebellum, pons en het begin van het ruggenmerg, zal duidelijk zichtbaar zijn. Om een ventrale laminectomie uit te voeren, plaatst u het weefsel rugzijde naar beneden en speld aan de ribbenkast en het meest caudale uiteinde van de wervelkolom. Gebruik de schedelflappen om de rostral-kant van het weefsel vast te pinnen en de ventrale helft van de ribbenkast te verwijderen, inclusief het borstbeen en alle buikorganen.

Ontleed het zachte weefsel aan de ribbenkast om de ribben en het ruggenmerg bloot te leggen en verwijder de tong, slokdarm, luchtpijp, strottenhoofd en alle andere zachte weefsel en spierstelsel boven de basis van de schedel en de wervelkolom. Om de harde pallet te identificeren, ontleden het weefsel boven deze rechthoekige plaat van bot aan de basis van de schedel, dat een v-vorm inkeping omvat. Snijd vervolgens langs de middellijn van de pallet, voorzichtig tillen van het weefsel naar boven en het uitvoeren van een dwarse snede om het te verwijderen.

Om te beginnen met een ventrale laminectomie, verwijder de lamina, het blootstellen van de ventrale oppervlak van de hersenstam en het ruggenmerg van de eerste halswervel tot ongeveer de thoracale wervel zeven en snip vijf tot 10 millimeter langs beide zijden van de wervelkolom in de lamina. Wanneer het ruggenmerg is blootgesteld, knip de worteltjes ongeveer 20 tot 25 millimeter bilateraal, langs de wervelkolom tot ongeveer T7 en til voorzichtig de rostrale rand van C1, C2 en C3 met gehaakte of gebogen tangen om het knippen onder het bot voor verwijdering van de drie wervels mogelijk te maken. Wanneer de gewenste lengte van het ruggenmerg is geïsoleerd uit de wervelkolom, maak een dwarse snede om het ruggenmergweefsel te verwijderen.

Na het verwijderen van de dura, plaats de hersenstam in het midden van de paraffine platform op de plastic snijblok en gebruik fijne insectenpennen, bijgesneden tot niet meer dan een centimeter in lengte om de caudal einde van de hersenstam pin door het distale ruggenmerg. Vervolgens lijn de paraffine bedekte snijblok met de vastgepinde hersenstam in de Vibratone blok houder, zodat het blad loodrecht op de rostral gezicht van de hersenstam zal snijden. Maak vervolgens een eerste plak om 200 tot 300 micrometer ongelijk vreemd vreemd weefsel op het rostral-meest uiteinde van het weefsel te verwijderen, waardoor kleine aanpassingen worden aangebracht die nodig zijn om parp-lineariteit en kleine sneden te garanderen om ongelijke weefsels te verwijderen.

De glanzende worteltjes zullen zichtbaar worden aan de zijdelingse rand van de hersenstam, snijden een 300 tot 500 micrometer stukje hersenstam uit deze rostrale neuroanatomische markers om het pre-Botzinger complex en de bijbehorende transmissiecircuits vast te leggen. Alle stappen van de snijprocedure zijn van cruciaal belang voor het creëren van een reproduceerbare, levensvatbare slice, met alle noodzakelijke neuronale circuits in de juiste richting om een robuust ritme te produceren. Alle minimaal noodzakelijke neurale circuitelementen voor het genereren en overbrengen van inspiratoire ritme kan worden vastgelegd in een dunne plak met behulp van deze methode.

Met inbegrip van de pre-Botzinger complex, pre-motorische neuronen projecteren naar de hypoglossale motorische neuronen en de hypoglossale zenuwworteltjes. Het pre-Botzinger complex, de hypoglossale of 12e craniale zenuwworteltjes en C4 zenuwworteltjes kunnen vervolgens worden gebruikt voor inspiratoire opname. Het belangrijkste aspect van deze procedure is de zorgvuldige isolatie van de worteltjes en de bevestiging dat de hersenstam niet beschadigd is voordat het laatste plakje wordt gesneden.

Na deze procedure kunnen elektrofysiologie-opnames worden gemaakt met behulp van patchklemmethoden, extra cellulaire opnames of zuigelektroden om de elektrische activiteit van het netwerk vast te leggen. Eerder gepubliceerde protocollen hebben weinig stap-voor-stap detail, waardoor het moeilijk is voor nieuwe onderzoekers om deze methode te gebruiken zonder te reizen naar een ander laboratorium en tijd doorbrengen met een doorgewinterde onderzoeker.