Name: Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer autoradiografie voor farmacologische doelwitvisualisatie met muizenweefsel. Deze methode biedt hoge ruimtelijke resolutie en is sneller dan traditionele beeldvormingstechnieken voor eiwitbindingsanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gesteund door de Lundbeck Foundation (Grant R133-A12270) en de Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). De auteurs bedanken Dr. Aleš Marek voor de levering van [3H] radioligand.

Alle dier behandeling werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Deense dier experimenten inspectie.
Opmerking: Het protocol hier beschreven dekt weefsel voorbereiding (d.w.z., muis hersenweefsel), de in vitro autoradiografie assay in voldoende detail voor het opzetten van de methode in een nieuw lab, de blootstelling aan fosfor imaging platen, evenals Na diverse densitometric analyses van autoradiograms (Figuur 2) met als doel lokaliseren en kwantificeren van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Voor histologisch vergelijking is een protocol voor cresyl violet kleuring opgenomen. Bovendien is de bepaling van niet-specifieke binding met een concurrerende ligand is opgenomen in het protocol. Zie voor een gedetailleerde beschrijving over het bepalen van Kd, Bmax of Kikvorige publicatie4.
1. de weefsels voorbereiding door Cryosectioning
<ol><li>De muis euthanaseren door cervicale dislocatie en onmiddellijk ontleden uit de hersenen met behulp van schaar en pincet. Direct doorgaan naar de volgende stap om weefselschade te voorkomen.</li>
	<li>Module-freeze het weefsel door onderdompeling in poedervorm droogijs, gasvormige CO2 of tolueen. Rechtstreeks overbrengen in het bevroren weefsel een cryostaat met de temperatuur instellen tot-20 ° C. U kunt ook bewaren het weefsel bij-80 ° C tot verwerking. Opmerking: Vermijd herhaalde ontdooien/freezing ter vermindering van weefselbeschadiging.</li>
	<li>Laat het weefsel acclimatiseren tot-20 ° C in de cryostaat gedurende 20 minuten vóór verdere verwerking om te voorkomen dat weefsel verbrijzelen.</li>
	<li>Dekking van de houder van de weefsel met insluiten medium buiten de cryostaat en plaats het bevroren weefsel model snel in de gewenste richting terwijl het insluiten medium nog vloeibaar is. Plaats de muis hersenen verticaal op het cerebellum bijvoorbeeld, met het oog op de rostraal coronale secties. De houder van het weefsel terug overzetten naar de cryostaat en bloot de insluiten middellange tot temperaturen hieronder-10 ° C voor de verharding. Opmerking: Kwetsbare weefsel model moet worden bekleed in insluiten medium binnen de weefsel mallen vóór montage.</li>
	<li>Plaats de houder van het weefsel in de microtoom van de cryostaat. De afdrukstand van het weefsel te vermijden schuine secties aanpassen.</li>
	<li>Knip het weefsel met de begeleiding van een stereotaxic atlas18 in secties van de gewenste dikte (12 µm aanbevolen voor [3H] geëtiketteerd liganden). Zorgvuldig rechtzetten en ontvouwen van de sectie met een borstel van geringe omvang, indien nodig en dooi-mount de sectie op een microscoopglaasje. Sequentieel verzamelen de secties uit de regio van belang zijn voor de gewenste technische replicatie (bijvoorbeeld, 4 punten per dia).</li>
	<li>Toestaan de secties op de dia's gedurende 1 uur drogen voor verdere verwerking. Opmerking: Toevoeging van de dessicant materiaal aan dia dozen minimaliseert vocht ophoping op de weefselsecties. Procotol kan hier worden onderbroken door secties op lange termijn op te slaan in dia vakken-80 ° C.</li>
</ol>2. in vitro autoradiografie
Let op: radioactiviteit. Werken in een gecertificeerd laboratorium volgens plaatselijke voorschriften. Draag beschermende kleding. Vervreemden overeenkomstig radioactief verval of uitbesteden aan een gecertificeerde bedrijf.
<ol><li>Ontdooi de secties gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Label de dia's met experimentele omstandigheden. Gebruik een potlood omdat de dia's zullen worden gebaad in ethanol tijdens latere kleuring.</li>
	<li>Plaats de dia's horizontaal in plastic bakjes. Opmerking: Positionering van dia's op een verhoogd platform binnen kunststof dienbladen vergemakkelijkt hun behandeling.</li>
	<li>Vooraf incubate de secties gemonteerd op de dia's in assay buffer aangepast naar doel in kwestie (voor GHB protocol, 50 mM KHPO4 buffer pH 6.0 wordt gebruikt) door nauwkeurige toepassing van een passende omvang op de dia (700 µL voor 3-4 knaagdier coronale secties). Opmerking: Zorg ervoor dat elke sectie volledig met vloeistof bedekt is.<ol>
<li>Dekking van de plastic schaaltjes met deksel teneinde te vermijden van verdamping en vooraf Incubeer bij relevante temperatuur (voor GHB protocol vooraf incubate gedurende 30 minuten op RT) onder constante zacht (20 rpm) schudden in een roteerapparaat plaat.</li>
		<li>Voor de bepaling van niet-specifieke binding, aanvulling assay buffer met relevante concentratie van compound (voor GHB protocol, 1 mM GHB). Opmerking: Pre-incubatie kan niet noodzakelijk zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giet af pre-incubatie vloeistof uit elke dia en de dia's ook terug overzetten naar de kunststof lade.</li>
	<li>Voorkom uitdroging, incubeer onmiddellijk de secties met relevante concentratie van radioligand in assay buffer gewenste voorwaarden (voor GHB protocol, 1 nM [3H] HOCPCA voor 1 h bij RT) bestrijkt de secties volledig met de radioligand oplossing (700 µL voor 3-4 knaagdier coronale secties).<ol>
<li>Incubeer onder onder constante zacht (20 rpm) schudden van kunststof bakjes met gesloten deksel. Opmerking: De radioligand concentratie kan worden gevalideerd door het tellen van een aliquoot deel in een vloeibare scintillatietelling teller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijderen van de incubatie-oplossing door het gieten van de vloeistof en breng de dia's in een Microscoop dia rek. Onmiddellijk overgaan tot de volgende stap om te voorkomen dat de sectie uitdroging.</li>
	<li>De dia's te wassen. Voor het protocol van GHB, wassen met ijskoude assay buffer tweemaal voor 20 s en vervolgens spoel tweemaal door dompelen de rek van de dia in de schaaltjes gevuld met ijskoude gedestilleerd water te verwijderen van zouten. Plaats van de dia's verticaal in rekken voor droging gedurende ten minste 1 uur op RT of de dia's gedurende 5 minuten droog met een ventilator koude temperatuur instelt. Opmerking: Wassen moet worden geoptimaliseerd, bijvoorbeelduitgebreide wassen nuttig kan zijn voor verminderen van niet-specifieke binding.</li>
	<li>De dia's overbrengen in een fixatiemiddel met paraformaldehyde (PFA) poeder voor overnachting fixatie met PFA dampen op RT ter bescherming van de integriteit van het ligand-target complex. Let op: PFA is giftig. Positionthe fixatiemiddel in rook kap en Vermijd contact met de huid/ogen met PFA.</li>
	<li>De volgende dag, worden de dia's overbrengen in een exsiccator doos met silicagel voor 3U op RT om vocht te elimineren.</li>
</ol>3. Gasbedwelming met behulp Phosphor Imaging platen en scannen
<ol><li>Plaats de secties in een cassette imaging plaat straling-afgeschermd met het weefsel naar boven. Voor de daaropvolgende kwantificering van radioligand binding, deelnemen aan een microscale [3H] elke cassette. Regelen van de secties willekeurig en bloot de secties voor directe vergelijking in de dezelfde cassette.</li>
	<li>De tritium-gevoelige fosfor imaging plaat onmiddellijk vóór gebruik ter opheffing van geaccumuleerde signalen uit de opslag te wissen en te elimineren achtergrond signalen. Daarom, laden van de plaat in fosfor imaging machine en worden blootgesteld aan zichtbaar/infrarood licht volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Verwijder de plaat uit fosfor imaging machine en plaats deze onmiddellijk naar de secties in de cassette. Zorg ervoor dat de cassette volledig is gesloten. Bloot in de secties aan de fosfor imaging plaat voor 3 dagen op RT beschermd tegen licht.</li>
	<li>Omdat licht signaal van de beeldvorming plaat wist, zorgvuldig openen van de cassette in het donker en onmiddellijk overdracht van de beeldvorming plaat in het donkere vak van een fosfor imager of plaats de fosfor imager in een donkere kamer. Opmerking: Zorg ervoor om te specificeren van de ruimtelijke rangschikking van de dia's tijdens de blootstelling teneinde individuele specimen op het digitale beeld na analyse. Daarom, fosfor imaging platen ook weergeven één hoek gesneden in een verschillende hoek teneinde de correcte oriëntatie van de plaat op de digitale foto.</li>
	<li>Scan de plaat met de hoogste resolutie mogelijk om een digitale beeld te krijgen.</li>
</ol>4. Optioneel: Cresyl Violet kleuring van weefselsecties
<ol><li>1% cresyl violet-oplossing te bereiden door het mengen van 5 g cresyl violet acetaat in 500 mL gedeïoniseerd water (dH2van O) tot het is opgelost (ongeveer 2 h). Filtreer door een filtreerpapier met behulp van een trechter in een nieuwe fles van 500 mL. Breng de pH op 3,5-3.8.</li>
	<li>Positie de kleuring van de dia ingesteld onder zuurkast. Laden met de volgende oplossingen in wit polypropyleen laden (met uitzondering van xyleen) bereiden: a. 50% ethanol/50% dH2O b. 70% ethanol/30% dH2O c. 100% ethanol d. 100% ethanol e. 100% dH2O f. 1% cresyl violet g. 0,07 procent azijnzuur (Voeg 175 µL van azijnzuur aan 250 mL dH2O). h. 100% xyleen in groene oplosmiddel-resistente laden i. 100% xyleen in groene oplosmiddel-resistente laden</li>
	<li>De dia's overbrengen in de zuurkast en plaats ze in een dia-rack.</li>
	<li>Los de lipiden door toenemende gesorteerde reeks van ethanol in dH2O in 100% ethanol (lade a-d) door dompelen de dia's voor 1 min.</li>
	<li>Hydrateren de specimens dH2O t/m aflopende concentraties van ethanol (lade a-d in omgekeerde volgorde, gevolgd door lade e) door dompelen de dia's voor 1 min.</li>
	<li>Dompel de specimens in cresyl violet oplossing gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Spoel de specimens in 0,07 procent azijnzuur door het opheffen van de dia's op en neer zachtjes voor 4-8 s. Wash de dia's door dompelen in dH2O voor 1 min.</li>
	<li>Uitdrogen van de specimens door onderdompeling van de dia's voor 30 s in oplopende concentraties van ethanol (lade a-d).</li>
	<li>Overdracht van de specimens via twee dienbladen van 100% xyleen (lade h en i) om quench de ethanol.</li>
	<li>Hydrateren de specimens dH2O t/m aflopende concentraties van ethanol (lade a-d in omgekeerde volgorde, gevolgd door lade e) door dompelen de dia's voor 1 min.</li>
	<li>Verwijder de dia's uit de zoutoplossing met een tang. Voeg een paar druppels van organisch oplosmiddel montage media per dia en voeg een dekglaasje 24 x 60 mm aan bovenop te beschermen van monsters. Het verwijderen van luchtbellen tussen het model en de dekglaasje aan door zachtjes te drukken op het dekglaasje aan. Opmerking: Houd de resterende dia's in xyleen tijdens montage om te voorkomen dat het drogen.</li>
	<li>Droog de dia's die 's nachts in een zuurkast op RT.</li>
	<li>Een beeld krijgen van model met een microscoop en 1.25 X doelstelling.</li>
</ol>5. densitometric analyse van digitaal beeld
<ol><li>Het meten van relatieve optische dichtheid (staven) van elke ijkstandaard uit de microscale [3H] met de software van de analyse van een afbeelding.<ol>
<li>Selecteer een gebied van gelijke grootte voor elk punt van de [3H] microscale met behulp van een tool voor regio creatie van het menu-item regio bepaling. Een nummer toewijzen aan elke geselecteerde gebied door te klikken op het getal onder de menu-item- Label.</li>
		<li>OD-waarden voor elk punt van de ijkstandaard exporteren door te klikken op bestand | E xport | 2D regio verslag. ROD waarden overbrengen naar een werkblad en normaliseren door de grootte van het geselecteerde gebied. Lineaire regressie om te verkrijgen van een standaard curve voor verdere densitometric analyse uit te voeren. Opmerking: Zorg ervoor dat de geselecteerde gebieden worden geëtiketteerd om overeenkomende waarden van ROD en monsters te identificeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uitvoeren van kwantificering van autoradiograms met behulp van de merkgebonden beeldbewerkingssoftware door het selecteren van de regio van belang (ROI) met behulp van een hulpmiddel van de verwezenlijking van de regio in elke sectie en het meten van de ODs. Selecteer dezelfde regio in elke sectie door een sjabloon voor de regio van belang, dat is gekopieerd en handmatig aangepast aan kleine variaties in de anatomie van de hersenen voor elk autoradiogram te maken. Het identificeren van de anatomie van de ROI door vergelijking van autoradiograms met een hersenen atlas18. Wanneer meerdere behandelingen worden vergeleken, analyses uit te voeren de verblind en gerandomiseerde teneinde vooringenomen selectie van ROIs.</li>
	<li>ROD waarden en grootte van de geselecteerde gebieden in een spreadsheet exporteren door te klikken op bestand | E xport | 2D regio verslag.</li>
	<li>Verdeel de gemeten staaf van de geselecteerde ROI door het gebied te verkrijgen van de dichtheid per specifiek gebied.</li>
	<li>Meten van de staaf van de achtergrond van de plaat en bijbehorende ROD-waarden en oppervlakte exporteren naar een werkblad. Het signaal van de gemiddelde achtergrond van elke staaf waarde van elke ROI aftrekken.</li>
	<li>Gemiddelde de staafjes technische wordt gerepliceerd, dat wil zeggen, sectie wordt gerepliceerd met behulp van weefsel van hetzelfde dier.</li>
	<li>Gebruik de standaard curve staven omzetten in eenheden van radioligand binding, dwz., nCi/mg weefsel equivalenten (TE). Opmerking: De term TE wordt gebruikt omdat normen worden gegenereerd met materialen simuleren van weefsel.</li>
	<li>Express bindende door conversie van nCi/mg naar nmol/mg TE volgens de specifieke activiteit van de radioligand (vergelijking 1). <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58879/58879eq1v2.jpg">(1)</li>
	<li>Aftrekken voor het verkrijgen van specifieke bindende waarden, niet-specifieke binding van totale bindend.</li>
	<li>Gemiddelde de binding van elke biologische repliceren met behulp van het gemiddelde van de technische repliceert van elk dier (verkregen in stap 5.6).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De kwaliteit van een autoradiografie bepaling wordt meestal bepaald door de gevoeligheid van de radioligand. Een belangrijke factor is de geselecteerde isotoop, dat wordt gegeven door de beschikbaarheid van bekende liganden of het haalbaar is specifieke etikettering technieken aan opbrengst liganden met passende specifieke activiteit (dat wil zeggen, de hoeveelheid radioactiviteit per eenheid mol van een radioligand)23en met een beperkte hoeveelheid chemische aantasting. Een groot aantal ...

Autoradiografie is een methode waarmee beelden van radioactief verval. De techniek is routinematig gebruikt om de studie van de verdeling van de weefsel van een proteïne van belang in vitro op basis van een specifieke farmacologische interactie tussen een radioactief gelabelde stof en haar doelstelling. Dit voorziet rechtstreekse informatie over de selectiviteit van het ligand in het doel. In vitro autoradiografie kan ook worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van farmacologische bindende parameters van radioligands, zoals de dissociatieconstante (Kd) en de dichtheid van bandplaatsen (Bmax), alsmede voor het bepalen van de remming constante (Ki) van concurrerende liganden1,2. Vergeleken met traditionele homogenaat radioligand binding, heeft autoradiografie het voordeel van kunnend visualiseren ruimtelijke anatomie en beknopte vermelding van regionale expressie patronen3. De methode van autoradiografie is daarom een relevante alternatief voor immunocytochemie, met name in het ontbreken van een gevalideerde antilichaam. Autoradiografie is eenvoudig toe te passen in een standaard isotoop laboratorium gegeven van de beschikbaarheid van een geschikte radioligand met de vereiste farmacologische specificiteit, toegang tot een microtoom cryostaat voor het voorbereiden van weefselsecties, en een geschikte beeldvorming apparaat welk vermag de verdeling van de radioactiviteit in de respectieve weefselsecties analyseren. Met name is een belangrijk selectiecriterium voor de radioligand een beperkte hoeveelheid binding aan doelsoort sites. Dit kan naar andere eiwitten, membranen of materialen zoals plastic of filters, en wordt gezamenlijk aangeduid als niet-specifieke binding. Meestal kan niet-specifieke binding is niet-verzadigbare maar verzadigbare als het gaat om een specifieke uit-target proteïne. De beste manier van valideren waar specifieke binding is te vergelijken met weefsels ontbreekt het doel, bijvoorbeeldgenetisch gemanipuleerde (knock-out) weefsel4.
De methodologie is hier, geïllustreerd met de autoradiografie karakterisering van de hoge-affiniteit bindende site voor zuur van γ-hydroxybutyraat (GHB) in de hersenen van zoogdieren. Inzicht in de farmacologische interactie tussen GHB en zijn bindende plaats is van belang als GHB zowel een klinisch nuttig drug in de behandeling van narcolepsie en alcoholisme5, maar ook een natuurlijk bestanddeel van de zoogdieren hersenen en een recreatieve is drug6. Hoge-affiniteit GHB bandplaatsen waren eerst beschreven met behulp van [3H] GHB binding aan de rat hersenen homogenaat7. Door de jaren heen, verder autoradiografie studies met [3H] GHB en de analoge [3H] NCS-382 heeft een hoge dichtheid van bindende sites in reukkolf gebieden van rat8,9,10, muis9 , varken11en aap/mens hersenen12. De moleculaire identiteit en exacte functionele relevantie van deze bandplaatsen hebben bleef echter ongrijpbaar.
Met de bedoeling om te verder karakteriseren de bandplaatsen en te vergemakkelijken van studies over de fysiologische rol van GHB, meerdere radioligands integratie van verschillende isotopen begiftigd met verschillende affiniteiten zijn ontwikkeld ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA en [125ik] BnOPh-GHB)13,14,15,16(herzien in17) (figuur 1). De combinatie van selectieve hoge-affiniteit radioligands inwoners en een bevolkingsdichtheid van de zeer hoge weefsel van de binding sites hebben toegestaan voor de productie van hoge-kwaliteit beelden met behulp van de fosfor imaging techniek9,11. Samen met een overzicht van de praktische punten bij het opzetten van een autoradiografie experiment en een illustratie te illustreren details, zal de sectie discussie benadrukken i) de keuze van de radionuclide, ii) de keuze van assay voorwaarden, en iii) het gebruik van fosfor Imaging platen versus X-ray film. Het algemene doel van deze paper is te voorzien in technische, methodologische en wetenschappelijke bijzonderheden over de techniek van autoradiografie informeren over weefsel distributie en farmacologische analyse van eiwit doelen.

<table><tbody><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28956481</td><td>20x40 cm - Gevoelig voor tritium</td></tr><tr><td>Cresyl violet acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>DPX (niet-waterige montagevloeistof voor microscopie)</td><td>Merck Millipore</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>microscope slides</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td><td>Sakura Finetek Denmark ApS</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tritium Standard op Glas</td><td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td><td>ART 0123</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen-vervanger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5597</td><td></td></tr></tbody></table>

autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiografie is gericht op het visualiseren van de anatomische distributie van een proteïne van belang in weefsel van proefdieren evenals mensen. De methode is gebaseerd op de specifieke binding van een radioligand naar haar biologische doel. Daarom, bevroren weefselsecties worden geïncubeerd met radioligand oplossing, en de binding aan de doelstelling vervolgens is gelokaliseerd door de detectie van radioactief verval, bijvoorbeeld met behulp van lichtgevoelige film of fosfor imaging platen. Resulterende digitale autoradiograms weer opmerkelijke ruimtelijke resolutie, waarmee de kwantificering en localisatie van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Bovendien voorziet kwantificering de farmacologische karakterisering van ligand affiniteit op door middel van dissociatieconstanten (Kd), remming-constanten zijn (Kik), alsmede de dichtheid van bandplaatsen (Bmax) in geselecteerde weefsels. De methode biedt dus informatie over zowel de doel lokalisatie en de selectiviteit van het ligand. Hier, wordt de techniek geïllustreerd met autoradiografie karakterisering van het zuur met hoge-affiniteit γ-hydroxybutyraat (GHB) bindend sites in zoogdieren hersenweefsel, met speciale nadruk op methodologische overwegingen met betrekking tot de bepaling van de bindende parameters, de keuze van de radioligand en de detectiemethode.

Met behulp van het protocol beschreven, was de anatomische distributie van de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen gevisualiseerd met de hoeveelheid radioactief gemerkte GHB analoge [3H] HOCPCA in de hersenen van de muis, die werd gesneden in coronale, Sagittaal en horizontale secties (Figuur 3 ). Hoge niveaus van bindende werden waargenomen in de hippocampus en de cortex, lagere binding in het striatum en geen bindende werd ontdekt in het cerebellum, ...

De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.

Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autoradiografie is een krachtige en eenvoudige techniek om de verspreiding van eiwitbindende sites in weefsels te bestuderen met behulp van specifieke radioligen voor het doel. Het is ook een geschikt alternatief voor immunohistochemie. Deze techniek visualiseert eiwitexpressie met ruimtelijke resolutie via digitale beelden die sneller zijn dan traditionele filmbelichting.Het kan ook worden gebruikt voor farmacologische analyse van eiwitdoelen. De methode omvat muisweefsels gemonteerd op glas, maar kan worden uitgebreid tot andere soorten of zelfs tot cellen geteeld op coverslips. Het demonstreren van de procedure zal worden door Nane Griem-Krey, een promovendus in mijn laboratorium.Om te beginnen dompelt u het weefsel onder in droog ijs in poedervorm om het te bevriezen. Breng het bevroren weefsel rechtstreeks naar een cryostat die is ingesteld op min 20 graden Celsius. Laat het weefsel 20 minuten wennen tot min 20 graden Celsius in de cryostat.Bedek vervolgens de weefselhouder met inbeddingsmedium buiten de cryostat en plaats het bevroren weefselmonster snel in de gewenste oriëntatie terwijl het inbeddingsmedium nog vloeibaar is. Breng de weefselhouder terug naar de cryostat en stel het inbeddingsmedium bloot tot temperaturen onder min 10 graden Celsius voor verharding. Plaats de weefselhouder in het microtome van de cryostat.Pas de oriëntatie van het weefsel aan om schuine secties te voorkomen. Snijd het weefsel met de begeleiding van een stereotaxic atlas in secties van de gewenste dikte en ontvouwen de sectie met een kleine borstel indien nodig. Dooi zet het gedeelte op een microscoopplaat.Dan achtereenvolgens verzamelen van de secties uit de regio van belang voor de gewenste technische herhaling. Laat de secties op de glijbanen een uur drogen voordat u verder worden behandeld. Gebruik in een gecertificeerd radioactiviteitslaboratorium een potlood om de dia's te labelen met de experimentele omstandigheden.Plaats de glijbanen horizontaal in plastic trays. Breng zorgvuldig een passend volume SA-buffer toe dat is aangepast aan het doel in kwestie op de secties die op de dia's zijn gemonteerd. Zorg ervoor dat elke sectie volledig is afgedekt.Voor de bepaling van niet-specifieke binding, vul SA buffer met een relevante concentratie van niet-gelabelde verbinding. Bedek vervolgens de trays met deksels om verdamping te voorkomen. Pre-incubeer bij een relevante temperatuur gedurende 30 minuten op een plaatshaker ingesteld op 20 rpm.Giet vervolgens de pre-incubatievloeistof van elke dia af en breng de dia's terug in de plastic lade. Bedek de secties onmiddellijk volledig met de relevante concentratie van radioligen in SA-buffer. Voor de bepaling van niet-specifieke binding, aanvulling radioligen oplossing met een relevante concentratie van niet-gelabelde verbinding.Bedek de trays met deksels en uitbroed onder de gewenste omstandigheden met constant zacht schudden bij 20 tpm. Giet hierna de incubatieoplossing af en breng de dia's in een microscoopdiarek. Was onmiddellijk de glijbanen.Voor het GHB-protocol, was twee keer met ijskoude SA buffer gedurende 20 seconden en spoel vervolgens twee keer door het dompelen van de schuifrek in trays gevuld met ijskoud gedestilleerd water. Plaats de glijbanen minstens een uur verticaal in rekken en de lucht drogen. Breng de dia's vervolgens over naar een fixator met paraformaldehyde voor nachtelijke fixatie bij kamertemperatuur.Breng de dia's de volgende dag over op een desiccatorbox met silicagel op kamertemperatuur. Laat de glijbanen drie uur in de desiccatorbox staan om vocht te elimineren. Plaats eerst de secties in een stralingsafschermde imagingplaatcassette met het weefsel naar boven gericht.Neem een radioactieve microschaal op in elke cassette voor latere kwantificering van radioligen binding. Laad onmiddellijk voor gebruik de tritiumgevoelige fosforbeeldplaat in de fosforbeeldmachine en stel deze bloot aan zichtbaar infrarood licht volgens de instructies van de fabrikant om het te wissen. Verwijder vervolgens de beeldplaat van de fosforbeeldmachine en plaats deze onmiddellijk op de delen in de cassette.Zorg ervoor dat de cassette volledig gesloten is. Stel de secties bloot aan de fosforbeeldvormingsplaat voor de geoptimaliseerde belichtingstijd bij kamertemperatuur terwijl ze zijn afgeschermd van licht. Na blootstelling, open de cassette voorzichtig in het donker en breng de beeldplaat onmiddellijk over in de donkere doos van een fosforbeeldcamera.Scan de plaat met de hoogst mogelijke resolutie om een digitaal beeld te verkrijgen. Open om te beginnen een geschikt beeldanalyseprogramma. Bepaal de relatieve optische dichtheden voor elke kalibratiestandaard door de bepaling van het menu-itemgebied te selecteren.Selecteer het gereedschap voor het maken van regio's en gebruik het om een gebied van gelijke grootte te selecteren voor elk punt van de radioactieve microschaal. Wijs een getal toe aan elk geselecteerd gebied door op nummer onder het menu-itemlabel te klikken. Klik op Bestandsexport en vervolgens op 2D-regiorapport om de OD-waarden voor elk punt van de kalibratienorm te exporteren.Gebruik in de gepatenteerde beeldvormingssoftware een regiocreatietool om het interessegebied in elke sectie te selecteren en de ED's te meten om te beginnen met het uitvoeren van kwantificering van de autoradiogrammen. Selecteer hetzelfde gebied in elke sectie door een sjabloon te maken voor het gebied van belang en kopieer en pas deze aan kleine variaties in de anatomie van de hersenen in elk autoradiogram. Klik hierna op 2D-regiorapport bestand exporteren om de STAAFwaarden en -grootte van geselecteerde gebieden naar een spreadsheet te exporteren.Bepaal de binding van de radioligen zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie, de anatomische verdeling van de hoge affiniteit GHB binding sites worden gevisualiseerd met de radiogelabelde GHB analoge radioactieve HOCPCA in een muis hersenen die werd gesneden in coronale, sagittale, en horizontale secties. Hoge bindingsniveaus worden gezien in de hippocampus en cortex, terwijl lagere bindingsniveaus worden gezien in het striatum en er geen binding wordt gedetecteerd in het cerebellum.Zoals hier getoond, kunnen de anatomische structuren worden gevisualiseerd met behulp van verschillende vlakken en anatomische integriteit kan worden ondersteund door cresyl violette kleuring. Representatieve autoradiogrammen van een rat, een muis en een varken illustreren het evolutionaire behoud van de hoge affiniteit GHB bindende sites in het zoogdierbrein. Radioactieve HOCPCA binding sites worden gedetecteerd in alle drie de soorten waardoor vergelijking van de bruto hersenen anatomie tussen hen.De hoge affiniteit GHB binding sites zijn onderzocht met GHB radioligands die verschillende affiniteiten voor de binding sites, maar vergelijkbare specifieke activiteiten weer te geven. Radioactieve HOCPCA is begiftigd met een hoge gevoeligheid en een uitstekende signaal-ruisverhouding. Vanwege de lagere gevoeligheid van radioactieve NCS-382 moeten hogere radioligen concentraties en concentraties worden gebruikt om vergelijkbare bindingsniveaus te verkrijgen.Nog hogere radioligen concentraties zijn nodig om radioactieve GHB vergelijkbare bindingsniveaus te bereiken. Hogere radioligies en concentraties verhogen echter ook het niveau van niet-specifieke binding met een bijgevolg lagere signaal-ruisverhouding. Het is belangrijk om de testomstandigheden zoals de radioligen concentratie, was- en belichtingstijd te optimaliseren om de beste signaal-ruisverhoudingen te krijgen en het is ook erg belangrijk om te onthouden om de plaat eerder te wissen.De procedure kan worden uitgebreid tot in vivo omstandigheden om een idee te krijgen over verbindingsbinding in een levend dier, wat nuttig kan zijn voor ontdekkingsprojecten. Vergeet niet om te werken in een laboratorium met gecertificeerd volledig radioactief materiaal en om beschermende kleding te dragen bij het hanteren van radioactiviteit of paraformaldehyde.

autoradiography-as-simple-powerful-method-for-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een workflow voor het snel analyseren en verkennen van collecties van fluorescentie microscopie beelden met behulp PhenoRipper, een recent ontwikkelde beeldanalyse platform.

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Een protocol voor screening van kleine moleculaire geneesmiddelen op basis van in-situ synthese van ultrakleine fluorescerende gouden nanoclusters (Au NC's) met behulp van een door geneesmiddelen geladen eiwit als sjabloon wordt gepresenteerd. Deze methode is eenvoudig om de bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan een doeleiwit te bepalen door een zichtbaar fluorescerend signaal dat wordt uitgezonden door de eiwit-gesjabloniseerde Au NC's.

Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole

Hier presenteren we een protocol om de lokalisatie van angiotensine II Type 1 receptoren in de hersenen van ratten te beschrijven door kwantitatieve, densitometrische, in vitro receptor autoradiografie met behulp van een jodium-125 gelabeld analoog van angiotensine II.

Receptor Autoradiografie Protocol voor de gelokaliseerde Visualisatie van Angiotensine II-receptoren

We beschreven hier, een hoge-inhoud beeldvorming methode om te kwantificeren van het vervoer van rodopsine mutanten retinitis pigmentosa is gekoppeld. Een meerdere-golflengte scoren analyse werd gebruikt voor het kwantificeren van rodopsine eiwitten op het celoppervlak of in de hele cel.

Een kwantitatieve analyse van rodopsine, vervoer door High-Content Imaging analyse

Hier vertegenwoordigen we een protocol voor de volautomatische radioactieve labeling van [11C] SNAP-7941 en de analyse van de real-time kinetiek van deze pet-Tracer op P-GP die cellen uitdrukt en niet uitdrukt.

Technisch aspect van de geautomatiseerde synthese en real-time kinetische evaluatie van [11C] SNAP-7941

We beschrijven protocollen voor het beoordelen van de mate van transductie door cel-penetrerende peptiden met behulp van ex vivo imaging systemen, gevolgd door paraffine inbedding, sectie, en confocale fluorescerende microscopie met behulp van cardiale targeting peptide als voorbeeld. In ons protocol kan één dier worden gebruikt om beide soorten beeldvormingsbeoordeling van dezelfde organen te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor studies met de helft wordt gehalveerd.

In Vivo Beeldvorming van transduction efficiëntie van cardiale targeting Peptide

Dit protocol presenteert een reeks experimenten die zijn aangenomen voor de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden, die kunnen worden gebruikt bij de preklinische screening van dergelijke verbindingen. Dit omvat cytotoxiciteitsbeoordeling in 2D- en 3D-celculturen, de evaluatie van  ex vivo (modelweefsel) foto-isomerisatie-efficiëntie en in vivo werkzaamheid.

In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

We presenteren een protocol om metabole activiteiten in cellen gereguleerd door aminozuren direct te visualiseren met behulp van deuteriumoxide (zwaar water D2O) gesondeerde gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) microscopie, die is geïntegreerd met twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF).

Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

Dit protocol bevat een gedetailleerde procedure voor de bereiding van vier koolstof-11 radiotracers door middel van de "lusmethode" [11C] methylering. We beschrijven de procedure om [11C]ER-176 te synthetiseren, met gegevens voor drie extra radiotracers: [11C]MRB, [11C]m HED en [11C]PiB. De lusmethode zorgt voor een efficiënte synthese met verhoogde radiochemische opbrengsten tegen traditionele methylering van reactievaten [11C].

Verbetering van de efficiëntie en radiolabelingopbrengsten van koolstof-11 radioliganden voor klinisch onderzoek met behulp van de lusmethode

Leer autoradiografie voor farmacologische doelwitvisualisatie met muizenweefsel. Deze methode biedt hoge ruimtelijke resolutie en is sneller dan traditionele beeldvormingstechnieken voor eiwitbindingsanalyse.

Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

Meer video's verkennen