Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

Ons geautomatiseerde cPILOT-protocol maakt het voor onderzoekers gemakkelijker om monsters op een hoge doorvoerwijze te analyseren. Dit is belangrijk omdat het ons in staat stelt om sneller bij biologische informatie over ziekten of verschillende aandoeningen te komen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het helpt om meerdere monsters parallel te verwerken, waardoor bruikbare fouten worden verminderd tijdens het gebruik van hoge doorvoermonsters.

Ons laboratorium is geïnteresseerd in toepassingen met betrekking tot veroudering en de ziekte van Alzheimer. Deze techniek kan echter ook worden gebruikt om elke ziekte of uitdaging te bestuderen voor waar biologische weefsels bij betrokken zijn. Begin met het inschakelen van het positieve drukapparaat, het verwarmings- en koelapparaat en de vacuümpompen.

Sluit alle accessoires aan met de vloeistofhandler, die een blauw licht laat zien zodra dat is aangesloten op de computer en klaar is om te werken. Aliquot 300 microliters van de lever homogenaat in een 500 microliter buis en plaats het op een twee milliliter diepe put plaat. Bewaar het monster op vier graden Celsius tot het begin van het protocol.

Open de methode in de software en plaats de benodigde tips en labware in hun posities. Schakel vervolgens met de laatste decklay-out en klik op Volgende om het protocol voort te zetten. Laad 230 microliter tips en aanzuigen 90 microliter van acht molaire ureum uit het reservoir.

Dan afzien aan rij een van de zwarte twee milliliter diepe put plaat. Ontlaad de uiteinden van TL1 en herhaal deze stap totdat ureum is toegevoegd aan alle putten. Na het toevoegen van de denaturatiebuffer gebruikt u 90 microlitertips om 10 microliter muisleverhomogeen over te brengen naar de diepe putplaat.

Ontlaad de uiteinden, laad vervolgens een rij van 90 microliter tips en aspirate drie microliters van DTT uit reagens plaat een. Geef DTT af aan rijen één en twee van de diepe putplaat. Verzegel de monsterplaat met aluminiumfolie en broed deze gedurende 600 seconden op 37 graden Celsius terwijl u draait bij 300 RPM.

Laad na de incubatie één op rij drie microliterpunten, haal zes microliter van IAM op reagensplaat één op rij drie en doseer deze aan een van de monsterplaat. Verzegel de monsterplaat en ontcubeer deze gedurende 30 minuten op vier graden Celsius terwijl u op 300 RPM draait op het koelapparaat. Maak vervolgens de monsterplaat los en laad een rij van 90 microliter tips.

Aspirate vijf microliter cystine uit reagens plaat een op rij twee en afzien van het aan rijen een en twee van de monsterplaat. Broed de plaat 30 minuten op kamertemperatuur. Na de incubatie voert u gedurende 30 minuten een getimede shake van 1800 RPM uit.

Voeg vervolgens 800 microliter van 20 millimolar Tris buffer met 10 millimolar calciumchloride toe aan elke put op de monsterplaat om de ureumconcentratie te verdunnen tot twee kies. Voeg 20 microliters trypsine toe aan de eerste rij van een 96 putplaat en plaats de plaat op een bepaalde locatie op het dek. Na het toevoegen van de trypsine aan de monsterplaat, verzegelen en uitbroeden voor 15 uur bij 37 graden Celsius en 600 RPM op de verwarming en koeling apparaat.

Stop de spijsvertering door 150 microliter van 5% mierenzuur uit rij drie van de mierenzuurplaat te aspireren en deze op de monsterplaat in rijen één en twee af te geven. Ga over tot desalt de peptiden. Gebruik 1070 microliter tips om 600 microliter acetonitril aan tezuilen.

Dan afzien in rijen een en twee van de vaste fase extractie, of SPE plaat, om C-18 te activeren. Laad vervolgens het verteerde monster in twee passen op de SPE-plaat. Laad twee rijen tips, aspirate 534 microliters van de verteerde monsters, en geef ze af aan rijen een en twee van de SPE-plaat.

Druk op de plaat en herhaal deze stap totdat alle monsters zijn geladen. Reinig de peptiden door te wassen met water en verdun de peptiden met 60 tot 40 acetonitril in 0,1%mierenzuur. Plaats vervolgens de plaat op een verzamelplaat om de peptiden te ontwijken met behulp van het positieve drukapparaat.

Teken de flow-through en het opzetten van de vereiste tips en labware in de software, crosscheck met het dek lay-out, en klik op Volgende om het protocol voor dimethylation voort te zetten. Reconstrueren van de peptiden in 1%azijnzuur. Om dimethylation labeling uit te voeren, laad 90 microliter tips en aspirate 16 microliter van 60 millimolar licht formaldehyde uit de tweede rij van reagens plaat twee.

Doe het af om een van de monsterplaat te roeien en los vervolgens de uiteinden uit. Laad een rij van 90 microliter tips en aanzuigen 16 microliters van 60 millimolar zware formaldehyde uit rij drie van reagens plaat twee. Doe rij twee van de monsterplaat af en ontlaad de uiteinden.

Laad twee rijen van 90 microliteruiteinden en aspiraat 16 microliter van 24 millimolar natriumcyanoborohydride en 24 millimolar natriumcyanoborodeuteride uit rijen één en twee van reagensplaat drie, dan delen de reagentia aan rijen een en twee van de monsterplaat om de dimethylation reactie te starten. Ontlaad de uiteinden en gebruik de orbitale shaker om een getimede shake gedurende 15 minuten uit te voeren bij 1800 RPM. Laad vervolgens twee rijen van 90 microliter tips en aspirate 32 microliters van 1%ammoniak uit rijen drie en vier van reagens plaat drie.

Doe het in rijen een en twee van monster plaat twee om de reactie te stoppen. Combineer gelijke volumes van licht en zware dimethylated peptiden in een nieuwe twee milliliter diepe put plaat voor desalting. Na het ontzilten van de gecombineerde lichte en zware peptiden, droog de peptiden af en voer isobarische tagging uit.

Reconstrueer de peptiden met 100 microliter van 100 millimolar triethylmonium bicarbonaat buffer op een orbitale shaker. Gebruik vervolgens 90 microlitertips om 25 microliter van de gecombineerde dimethylated peptiden op te halen en ze af te geven aan de eerste rij van de TMT-verwerkingsplaat. Laad een rij van 90 microliter tips en aspirate 10 microliter van TMT.

Doe het af in de eerste rij van de TMT-verwerkingsplaat, ontlaad de tips en voer vervolgens een getimede shake uit gedurende een uur bij 1800 RPM. Aspirate acht microliters hydroxylamine uit rij twee van de TEAB-plaat en doseer deze aan een van de TMT-verwerkingsplaat. Na een shake van 15 minuten bij 1800 RPM, breng je 30,5 microliter van de TMT gelabelde peptiden over naar een buis van 1,5 milliliter.

Ga dan verder met het verwerven en analyseren van gegevens volgens de handschriftaanwijzing. Representatieve MS-gegevens van een peptide geïdentificeerd in alle 22 reporter ion kanalen van een 22 Plex gecombineerde voorloper isopic etikettering en isobaric tagging experiment wordt hier getoond. De volgorde van het peptide komt overeen met betaïne-homocysteïne S-methyltransferase.

De meest intense fragmentionen voor zowel de lichte als de zware dimethylated pieken werden verder geïsoleerd voor MS3 fragmentatie. De reporter ion intensiteiten zijn direct evenredig aan de peptide overvloed in de steekproef. Over het algemeen verminderde dit gecombineerde isotopische etiketterings- en isobarische tagging-experiment de verwerkingstijden van het monster en kon de eiwitexpressie via meerdere kanalen of omstandigheden worden gevisualiseerd.

De box plot van log 10 overvloed versus totale reporter ion intensiteiten over alle 22 kanalen toont mindere inter-goed of inter-sample variabiliteit. Evaluatie van de totale automatisering werd gedaan door het onderzoeken van de fout in reporter ion overvloed over elk eiwit in de 22 monsters. Monsterverwerking met het robotplatform resulteerde in zeer lage variatiecoëfficiënten.

Over de 3098 peptiden, de gemiddelde coëfficiënt van variatie in reporter ion overvloed was 12,36 en 15,03%voor lichte en zware dimethylated peptiden respectievelijk. Bij het proberen van dit protocol, is het belangrijk om in gedachten te houden dat isotopen en isobarische niveaus worden gebruikt in een enkel experiment. Daarom moet een zorgvuldige planning worden uitgevoerd om elk monster aan te wijzen met de tags die bedoeld zijn om in het experiment te worden gebruikt.

Deze methode kan gemakkelijk worden geïntegreerd in andere robotsystemen, en het kan worden toegepast op een verscheidenheid van weefsels, zoals weefsel of cel lysates en andere biofluïden.