Monster voorbereiding methode van scannen en transmissie elektronenmicroscoop voor de aanhangsels van woodboring Kever

Woodboring kever hun lichaamsoppervlak zijn altijd hard in SEM. De Tween-20 wordt toegevoegd aan fixatieve en wasoplossing. Het lichaamsoppervlak van houtborenkever In TEM kan de Tween-20 de fixatieve penetratie in de lichaamswand verbeteren en weefsel en orgaan in het lichaam beter fixeren.

De fluorescentie microscoop is nuttig voor het verbeteren van snijden nauwkeurigheid. De techniek is nuttig voor het wassen van het lichaamsoppervlak en penetreren in de lichaamswand in de houtboring kever. Zo zou het sem en TEM visie duidelijk.

Fluorescentie microscoop is nuttig voor het verbeteren van snijden nauwkeurigheid in TEM. Het aantonen van de procedure zal Zhang Yanru zijn, een afgestudeerde student van ons laboratorium. In een gebied waar Chlorophorus caragana wonen, plaats veld vallen aas met planten attractanten zoals isoforone op een trechter val.

Aantrekken houtboring kever volwassenen in de vallen. Bewaar de schone lichamen van volwassen Chlorophorus caragana in 0,1 mol per liter PBS bij pH 7.2, 2,5% volume glutaraldehyde en 0,06% volume volume tween-20. Bevestig het monster drie dagen op vier graden Celsius.

Verwijder de lichamen uit de conserveringsvloeistof en spoel in PBS. Gebruik onder een stereomicroscoop tangen om de aanhangsels te verwijderen en ultrasoon te reinigen op 40 kilohertz in PBST. Breng het monster na 100 seconden schoonmaken over naar de microscoop om te controleren of het schoon is.

Maak niet langer dan 400 seconden schoon om schade te voorkomen. Dompelen vervolgens de monsters onder in ethanol in een reeks concentraties gedurende 20 minuten elk uitdroging uit te voeren. Na de uitdroging, onder een stereomicroscoop, gebruik koolstof dubbelzijdige plakband om afzonderlijk vast te stellen drie observatieoppervlakken, dorsale, ventrale, en laterale, op stompen.

Zorg ervoor dat alle kijkoppervlakken schoon en vrij van verontreiniging worden gehouden. Plaats het monster stadium in een petrischaal met een silica gel desiccant voor 48 uur. Draai vervolgens op een ionenputterend instrument de hoofdklep naar de open positie, verwijder de deksel van de monsterkamer en plaats het monster in de kamer.

Zet de aan/uit-schakelaar aan en zorg ervoor dat het klaarlicht aan staat. Stel de sputtertijd in op 45 seconden en de coatingdikte op 70.875 angstrom. Zodra de mechanische pomp vacuüm wijzerplaat index daalt tot onder de zeven, druk op ontlading en beginnen met het spuiten platina.

Schakel aan het einde van de procedure de voeding uit en haal het monster uit de kamer. Bereken de spray film dikte D in angstrom gelijk aan K keer I keer V keer T.K is een constante bepaald door de sputtered metaal en gas. Ik is de plasmastroom in milliampères terwijl V de spanning is die in kilovolts wordt toegepast en T is de tijd in seconden.

Plaats de stomp met het monster in het stadium van de SEM. Zorg ervoor dat de monsterfase met de monsterstub voldoende hoogte heeft om een goede afbeelding mogelijk te maken. Open de SEM-software en selecteer de gewenste bedrijfsspanning vanaf 20 kilovolts.

Na het verkrijgen van de aanhangsels van volwassen Chlorophorus caragana, was de monsters in PBST in een ultrasoon bad gedurende drie uur en dan post-fix ze in 1%gewicht door volume osmium tetroxide in PBS gedurende een uur op 25 graden Celsius. Dehydrateer de monsters met behulp van opeenvolgende behandelingen van 20 minuten in 50%60%70%80%85%90%95%100%en 100% volume ethanol bij kamertemperatuur. Breng met tangen verwarmde hars aan in een platte inbeddingsmal en sluit de monsters in de hars in.

Zorg ervoor dat het monster zich aan de onderkant van de plaat bevindt en zo dicht mogelijk bij de rand van de verzonken groef wordt geplaatst. Etiketteren en vervolgens de plaat met het monster 72 uur lang bij 60 graden Celsius uitbroeden. Verwijder na incubatie de plaat uit de couveuse en controleer of de hars gepolymeriseerd is.

Zodra het monster is gestold, plaats elk hars blok onder een fluorescentie microscoop, verplaats de microscoop fluorescerende lichtbron om het monster te bestralen met blauw licht van bovenaf en fotografeer ze. Zorg ervoor dat de sensilla in het harsblok duidelijk zichtbaar zijn. Meet de afstand tussen de rand van het harsblok en de doelsensor om de sensilla te targeten.

Raadpleeg de SEM-afbeelding van de palps en snijd het harsblok ruwweg door met een scheermesje dicht bij de doelreceptor. Pas vervolgens onder een blauw licht fluorescentiemicroscopie de lichtbron van bovenaf aan, zodat de sensilla duidelijk worden waargenomen. Voeg de objectieve micrometer toe aan de fluorescentiemicroscoopfase.

Fotografeer het ruwweg gesneden harsblok en meet vervolgens de afstand tussen het doel en de rand van de hars. Plaats het harsmonster op een ultramicrotome en snijd 50 tot 60 nanometer dikke secties totdat de doelpositie is bereikt. Monteer de secties op formvar-gecoate 100 mesh koperen roosters in petrischaaltjes.

Bevlek de roosters met een verzadigde gefilterde oplossing van uranylacetaat bij kamertemperatuur. Bedek de secties tijdens het bekladden om licht-geïnduceerde neerslag te blokkeren. Vlek gedurende 10 minuten.

In een rookkap spoel je twee keer in 50% methanol en vervolgens twee keer in gefilterd ontgast water. Plaats druppels van voorbereide lood citraat vlek op de pleinen van de plastic petrischaaltjes en laat ze zitten voor acht minuten. Spoel in ontgast gefilterd water en droog.

Monteer de rasters op een voorbeeldfase in de TEM-machine. Stel de spanning in op 80 kilovolt en onderzoek de secties. In dit protocol, met behulp van reinigings- en fixatieve oplossing met Tween-20, werd een duidelijk SEM-beeld waargenomen dan dat zonder Tween-20.

Met de Tween-20 bevestigingsoplossing waardoor de glutaraldehydebevestigingsoplossing het weefsel kon binnendringen, werden microtubbulestructuren duidelijk gezien in het TEM-beeld, terwijl de interne structuur van het monster bereid zonder Tween-20 wazig was. Continue dwarsdoorsnede weergaven van de pin van het type een sensilla twig basiconica op de maxillaire palps bleek dat de dendritische schede omgeven de buitenste dendritische segmenten en uitgebreid tot de tip porie. In de binnenste receptorlymfeholte, die omgeven was door een buitenste holte, bestonden zeven ongebranchede buitenste dendritische segmenten.

Het buisvormige lichaam werd gescheiden door een dendritische schede van andere buitenste dendritische segmenten op elke sensillar socket basis. In het ciliarygebied werden acht dendrieten van verschillende diameters geïdentificeerd die de aanwezigheid van acht bipolaire neuronen aangeven. De techniek kan worden gebruikt om de functie van zenuwen verder te bestuderen, zoals eencellige opname of in situ hybridisatie.