Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Deze methode biedt een efficiënte strategie voor het voorbereiden van functionele steigers voor bottumoronderzoek. Decellularized het bot extracelullar matrix, toonde variabele serocompatibility voor de overleving en activiteiten van osteosarcoom cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat osteosarcoom cellen cultuur in bot-afgeleide matrix tonen zeer heterogene morfologie vergelijkbaar met een klinische osteosarcoom histopathologie.

De methode biedt ideaal model voor het onderzoeken van de ontwikkeling, progressie van de gevoeligheid van geneesmiddelen van bottumoren, zoals osteosarcoom, Ewing sarcoom, en de andere kwaadaardige tumoren metastase tot bot. Om te beginnen, verkrijg vier tot zes weken oude BALB / c muizen, na euthanasering een muis met behulp van steriele chirurgische schaar, afgesneden verse kuitbeen, scheenbeen, en dijbeen uit een achterste ledemaat. Met behulp van pincet, schil het epitheelweefsel, en verwijder dan zo veel van het zachte weefsel mogelijk.

Spoel de beenbeenderen met steriele PBS-oplossing van 10 mM twee maal om bloed te verwijderen in een schaal van zes centimeter. Dompel de botten in een schaal met 75% ethanol gedurende drie minuten dan spoelen met PBS tweemaal. Bewaar de schone botten in een steriele 50 milliliter centrifugebuis met steriele PBS buis op 80 graden Celsius.

Ontdooi de bevroren botten bij kamertemperatuur en vries dan weer op 80 graden Celsius gedurende een uur. Onderwerp de botten aan meer dan twee vries-dooi cycli voor cellyse en weefselafbraak. Plaats vervolgens de botten in een steriele 50 milliliter centrifugebuis gevuld met 0,5 normale HCl en broed 's nachts bij kamertemperatuur op een orbitale shaker met zacht schudden om volledige en gelijkmatige dekking van de botten te garanderen.

Na ontkalking decanteer de zoutzuuroplossing volledig en spoelt u de botten een uur onder stromend water. Gebruik vervolgens gedestilleerd water om de botten twee keer gedurende 15 minuten per wasbeurt te wassen op een orbitale shaker. De oplossing volledig decanteren.

Om de lipiden in een gedemineraliseerde botten te extraheren, plaatst u de botten in een 50 milliliter centrifugebuis met een 1:1 mengsel van methanol en chloroform. Wikkel de buis met aluminiumfolie om licht te voorkomen voor het voorkomen van chloroforme afbraak. En zet de buis een uur op een orbitale shaker.

Gebruik vervolgens een pincet om de botten gedurende 30 minuten over te brengen in een andere buis methanol met aluminiumfolie. Verwijder de methanol volledig en was met gedestilleerd water twee keer gedurende 15 minuten op een orbitale shaker. Decanteer het laatste waswater en ga onder steriele staat verder.

Spoel de botten in een schaal van zes centimeter met steriele PBS gedurende drie minuten. Voeg 40 milliliter steriele 0,05% TE-oplossing toe aan een 50 milliliter centrifugebuis en incubaatbotten gedurende 23 uur in een koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Gooi de TE-oplossing weg en spoel twee maal met steriele PBS aangevuld met 90 g/mL ampicilline en 90 g/mL kanamycine gedurende 15 minuten op de orbitale shaker.

Na het volledig decanteren van de laatste wasbeurt, vul opnieuw aan met 40 milliliter steriele PBS met antibiotica. Was grondig gedurende 24 uur bij kamertemperatuur met zachte schudden om effectieve sterilisatie van poreuze ruimtes te bereiken. Breng de botten vervolgens over in een 50 milliliter centrifugebuis gevuld met steriele PBS met antibiotica.

De bereide Bone Extracellular Matrix kan twee maanden lang op vier graden Celsius worden bewaard. Dompel BEM onder in 75% ethanol in een schaal en schud de schotel voorzichtig 30 seconden met de hand. Spoel vervolgens 30 seconden met PBS, twee maal.

Breng de BEM over op een schone celkweekplaat met zes putjes. Voeg twee milliliter van volledige cultuur medium aan elke put. Incubeer de BEM 's nachts in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius.

Verkrijg menselijke OS-cellijnen in 100 microliter van voorverwarmde PBS met indicatorfenolrood. Gebruik een pipet om OS cellen op te schorten met de geschatte concentratie van 1 keer 10 tot de 5e. Nadat de BEM volledig is gedrenkt in het medium, van proximale of distale epifyses, doorboort de naald naar de medullaire holte van BEM en injecteer OS-cellen in BEM.

Broed het OS-BEM-model minimaal twee uur in een bevochtigde 5%-koolstofdioxideatmosfeer bij 37 graden Celsius om ervoor te zorgen dat de geïnjecteerde cellen zich stevig aan BEM hechten. Haal vervolgens de plaat uit de couveuse. Voeg een milliliter kweekmedium toe aan de plaat en bewaar het 's nachts in de couveuse om het oppervlak van de BEM-cultuur volledig te coaten.

Breng het OS-BEM model voorzichtig over in een nieuwe put van een zes-put plaat met een steriel pincet, en voer een milliliter vers kweekmedium. Cultuur het model voor 14 dagen in de couveuse. Houd tijdens de 14-daagse incubatie de gemiddelde kleur in de gaten.

Als het medium in oranje of zelfs geel verandert, verfris het medium onmiddellijk door de helft van het oude medium weg te gooien en een nieuw medium toe te voegen om een gezonde omgeving voor OS-cellen te behouden. Houd de celstatus onder de omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Wanneer OS cellen uit te breiden tot plaat, voorzichtig overbrengen van de OS-BEM model naar een andere nieuwe put met steriele pincet.

Na de 14-daagse cultuur, voorzichtig spoelen van de OS-BEM model met PBS om de cultuur medium te verwijderen. Breng vervolgens over in een 15 milliliter centrifugebuis en voeg 10% gebufferd formaline toe om te fixeren voor histologische identificatie. Na demineralisatie en decellularisatie lijkt BEM doorschijnend te zijn met een sterkere veerkracht en vasthoudendheid in vergelijking met inheemse muizenbot.

Een beetje spierresidu in de ruimte van medullary holte kan duidelijk worden waargenomen. Helder-veld beeldvorming van het inheemse bot en de gedecellulariseerde BEM, toont de grondige verwijdering van celkernen. De natuurlijke poreuze structuur in collageen netwerk regeling is goed onderhouden in gedecellulariseerde BEM.

Bovendien, immunohistochemische kleuring voor collageen I en Collagen IV toont de belangrijkste componenten van extracellulaire matrix worden bewaard in muis scheenbeen na decellularisatie. Tijdens de 14-daagse cultuur worden zowel periosteum als endosteum geïnfiltreerd door de uitbreiding van OS-cellen. OS-cellen op de gedecellulariseerde BEM vertonen een zeer heterogene morfologie die vergelijkbaar is met de cytopathologische kenmerken van een OS-sectie.

Immunohistochemische analyse na 14 dagen kweken in BEM-model toont grote voordelen in lange termijn culturen. Ook OS cellen en BEM cultuur, zeer express bone matrix glycoprotein, die specifiek is voor osteoid matrix. Dit driedimensionale model van deze in vitro is gebruikt om een fenotypische heterogeniteit en een regelgevend mechanisme van osteosarcoom dedifferentiatie met succes aan te tonen.