Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Nieuwe microscopietechnieken vereisen de ontwikkeling van adequate instrumenten voor het juiste begrip van de onderzochte biologische processen. Dit protocol beschrijft de beeldverwerkingsstappen die nodig zijn voor het bijhouden van één molecuul, inclusief schatting van laterale diffusieparameters en kwantificering van de spotgrootte over de gehele baan bij het celmembraan. Dit protocol combineert het gebruik van verschillende softwarestukken, waaronder ImageJ, MATLAB en uTrack, evenals enkele eiwitten die speciaal voor dit protocol zijn ontwikkeld.

Deze methode wordt geïllustreerd met het volgen van membraanreceptoren onder lichtmicroscopie, maar het kan worden toegepast op elke deeltjesachtige structuur waarvan de trajecten in de loop van de tijd in een videosequentie kunnen worden gevolgd. Deze techniek heeft betrekking op fundamenteel onderzoek en heeft geen directe toepassing in een klinische setting. Het kan echter worden gebruikt om te helpen bij de karakterisering van biologische gebeurtenissen bij zowel verschillende ziekten als dus bij de identificatie van nieuwe therapeutische doelen.

Dit protocol is relevant voor het volgen van deeltjes in cellulaire membranen, zoals getoond in deze video, maar het kan ook worden toegepast voor het volgen van volledige cellen, bacteriën, nanodeeltjes in een vloeistof, of welk ander object waarvan het centrum goed kan worden bepaald. Dit protocol is gebruiksvriendelijk en vereist alleen kennis van celcultuur en microscopietechnieken. De verschillende technieken en informatica tools die worden gebruikt in dit protocol kan intimideren een nieuwe gebruiker.

De visuele demonstratie helpt om deze techniek met vertrouwen te gebruiken. Om te beginnen groeien Jurkat cellen, transfect ze met een monomerische GFP-gelabelde chemokine receptor vector, en selecteer cellen met lage expressieniveaus van de gelabelde vector, zoals beschreven in de bijbehorende tekst protocol. Voeg media met de CXCL12 ligand of controlemedia toe aan elke met fibronectine gecoate microwell met glazen bodem die zijn bekleed met fibronectine en een uur lang uitbroeden bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens gesorteerde cellen toe aan elk gerecht en broed gedurende 20 minuten voordat de cellen worden weergegeven. Na incubatie breng je de eerste schotel van cellen over naar een TIRF-microscoopstadium en ga je naar de 100x olieonderdompelingsdoelstelling. Zoek en concentreer u op de cellen met behulp van helder veld om fotobleaching effecten te minimaliseren.

Schakel vervolgens over naar de TIRF-modus en voer een fijne scherpstelling uit met een lage laserintensiteit. Verwerf films van ongeveer 50 seconden lang, waardoor het tijdsinterval tussen frames wordt geminimaliseerd. Maak voor elk videobestand met experimentele conditie een nieuwe map volgens de routebeschrijvingen van de bestandsstructuur die in het tekstprotocol van deze video worden beschreven.

Open de video met Fiji of ImageJ door het bestand op de menubalk van Fiji te slepen en te laten vallen en klik op OK om het LIF-bestand te importeren met behulp van bioformaten. Als u een masker wilt ontwerpen, importeert u ook de bijbehorende afbeelding met meerdere kanalen. Maak vervolgens een masker door eerst één afbeelding te maken met de kanalen die handig zijn voor het ontwerp van het masker.

Selecteer Afbeelding in het balkmenu en klik op Kleur gevolgd door Gesplitste kanalen om de verschillende kanalen als afzonderlijke afbeeldingen weer te geven. Voeg de drie kanalen opnieuw in één afbeelding samen door Afbeelding in het balkmenu te selecteren, naar Kleur te gaan en Kanalen samenvoegen te selecteren. Zorg ervoor dat u de juiste kanalen selecteert en druk op OK om een nieuwe niet-gestapelde afbeelding te genereren.

Synchroniseer de twee vensters door naar het balkmenu te gaan, Analyseren te selecteren en vervolgens naar Extra te gaan en Windows synchroniseren te selecteren. Er wordt een nieuw venster met de gesynchroniseerde beeldmogelijkheden weergegeven. Nu, met de twee vensters gesynchroniseerd, kan hetzelfde gebied in beide vensters worden bijgesneden.

Ga naar Afbeelding in het balkmenu en selecteer Bijsnijden. Teken met het rechthoekige selectiegereedschap het interessegebied. De twee bijgesneden afbeeldingen worden afzonderlijk weergegeven.

Vervolgens kunnen beide vensters worden ongesynchroniseerd. Als er geen masker is gemaakt, tekent u het interessegebied met het selectiegereedschap en bijsnijden. Sla de video daarna op als een beeldreeks in de map Videosec.

Selecteer vervolgens de afbeelding met meerdere kanalen, ga naar Plug-ins in het menu en selecteer Segmentatieeditor om de plug-in voor segmentatieeditor te openen. Kies het gereedschap keuze uit de vrije hand en gebruik het om een groen label te selecteren en het buitenste masker te ontwerpen. Druk na het ontwerp op de Plus-knop in de selectieoptie van samengesteld venster en wordt het geselecteerde masker weergegeven op de viewer.

Herhaal deze stap voor alle labels. Zodra alle maskers zijn ontworpen, slaat u het masker op met dezelfde bestandsnaam als de video, met de naam:masker.tif. Open MATLAB en voeg de uTrack-map toe aan het pad door pad instellen te gaan en selecteer Toevoegen met.

Wijzig vervolgens de werkmap in de map met de reeks die moet worden geanalyseerd. Roep uTrack aan door Movie Selector GUI in de console te typen en op Enter te drukken. Hierdoor wordt het venster voor filmselectie geopend.

Druk op de knop Nieuwe film en wacht tot het venster Filmtoevoever wordt weergegeven. Druk op Kanaal toevoegen om de map met de video te kiezen en vul de filminformatieparameters in. Stel de uitvoermap voor de resultaten van uTrack in op Resultaten en druk vervolgens op de geavanceerde kanaalinstellingen, vul de parameters met betrekking tot de acquisitie en sla deze op.

Nadat u de film hebt gemaakt, drukt u op Doorgaan in het venster voor filmselectie. Hier vraagt uTrack naar het type object dat moet worden geanalyseerd. Kies Enkele deeltjes en vervolgens verschijnt het venster van het configuratiescherm.

Selecteer vervolgens de eerste stap, Stap 1:Detectie, en klik op Instellen. Het venster Instelling Gaussian Mixture Model Fitting verschijnt. Voer de instellingen in zoals hier wordt weergegeven en druk op Toepassen.

Klik in het configuratiescherm op Uitvoeren om de detectiestap uit te voeren. Controleer na enkele minuten de resultaten door op de knop Resultaat te drukken. De film toont rode cirkels op de gedetecteerde deeltjes.

Als er geen rode cirkel wordt weergegeven, dan heeft deze stap niet correct gewerkt en moet u het opnieuw proberen. Voeg nu de deeltjes die net zijn gedetecteerd samen in tracks die meerdere frames omvatten door eerst de parameters in te stellen zoals hier wordt weergegeven. Druk vervolgens op Uitvoeren in het bedieningspaneel.

Voer vervolgens Track Analysis uit. Definieer de instellingen, zoals hier wordt weergegeven, en druk op Toepassen en Uitvoeren. Controleer de resultaten door eerst op de knop Resultaat te drukken en klik vervolgens op Track Number van het venster Filmopties weergeven en controleer frame-voor-frame dat elk spoor correct is geïdentificeerd, waardoor deeltjes die geen echte deeltjes zijn handmatig markeren.

Voer in MATLAB de opdracht in zoals hier wordt weergegeven. Deze opdracht zorgt ervoor dat het programma alle trajecten leest en de diffusiecoëfficiënten berekent. Sluit vervolgens trajecten uit die overeenkomen met onjuist geïdentificeerde vlekken of trajecten door de lijst met plekken uit te sluiten.

Bereken de momentane diffusiecoëfficiënten voor elk van de sporen van deze cel door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol. Bereken in dit geval de diffusiecoëfficiënt voor een vertraging gelijk aan 4 d1 tot en met 4. Wanneer u klaar bent, ontbindt u de trajecten in korte en lange trajecten.

Als u lange trajecten wilt analyseren, typt u de opdracht zoals hier wordt weergegeven om het type beweging door hun momentschalingspectrum te classificeren. Analyseer de intensiteit van elk deeltje langs hun baan. Configureer dit basisgedrag op veel verschillende manieren door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol.

Verzamel vervolgens de diffusie- en intensiteitsinformatie voor alle trajecten. Verzamel alleen de diffusie- en intensiteitsinformatie voor korte trajecten. Ten slotte, verzamelen van het moment spectrum schalen en de intensiteit informatie door het typen van de volgende, waar lang is het achtervoegsel eerder gebruikt.

Het gebruik van de technieken beschreven in dit protocol zorgt voor het geautomatiseerd volgen van deeltjes gedetecteerd in fluorescentie microscopie films en de analyse van hun dynamische kenmerken. Uit deze analyse kan men verschillende kenmerken verkrijgen op basis van variaties in stimuli. Dit omvat het percentage onbeweeglijke vlekken op basis van vier verschillende stimuli, het percentage lange trajecten van meer dan 50 frames en de soorten bewegingen langs de trajecten zoals opgesplitst door gerichte, vrije of beperkte bewegingen.

Bovendien kunnen de diffusiecoëfficiënt, gemiddelde steunintensiteiten en het aantal receptoren per deeltje worden bepaald. Dit toont de verdeling van de korte diffusiecoëfficiënt waarden voor elke plek in reactie op verschillende stimuli. De rode lijn vertegenwoordigt de mediaan waarde, deze vergelijkbare grafiek toont de gemiddelde spot intensiteiten voor elke plek langs de eerste 20 frames in reactie op dezelfde stimuli.

Nogmaals, de rode lijn vertegenwoordigt de gemiddelde intensiteitswaarde. Omdat de gemiddelde gecorrigeerde intensiteit van een spot gerelateerd is aan het aantal fluorescerende eiwitten dat op deze plek aanwezig is, kan men direct het aantal receptoren per deeltje berekenen, zoals hier wordt weergegeven. MATLAB is een casegevoelige programmeertaal.

U de variabele namen variëren met betrekking tot de namen die in dit protocol worden beschreven, maar zorg ervoor dat u consistent bent in uw naamgeving. De namen van de functies kunnen niet worden gewijzigd en komma's, dubbele punten en puntkomma's zijn belangrijk voor een juiste syntaxis. Single-molecule microscopie zorgt voor de visualisatie van individuele membraaneiwitten met een ongekende spatio-temporele resolutie en biedt unieke mogelijkheden om onverwachte aspecten van celbiologie te onthullen.

Deze protocollen openen nieuwe deuren voor de kwantitatieve analyse van microscopievideo's in cellen en moleculaire biologie.