Kwantificering van monocyten Chemotactische activiteit in vivo en karakterisering van bloed monocyten afgeleide macrofagen

Deze methodologie stelt ons in staat om de chemotactische activiteit van bloedmonocyt bij levende dieren te kwantificeren en het effect van slechte diëten op monocytenfunctie en hun onderliggende mechanismen te bestuderen. Monocyten-afgeleide macrofagen kunnen worden geïsoleerd en geanalyseerd met behulp van verschillende benaderingen, waaronder eencellige, en omics technieken die een momentopname van de gezondheid van de bloed monocyt site in muismodellen. De procedure van vandaag zal worden uitgevoerd door Dr. Young Joo Ahn, een assistent-professor in mijn lab, en Dr Luxi Wang, een postdoc in mijn lab.

Reinig de celkweekkap met ontsmettingsmiddel en ontdooi de groeifactor-verminderde keldermembraan-afgeleide oplossing op ijs volledig. Rust individuele steriele een milliliter spuiten met 26 meter naalden en plaats de naalden op ijs. Zodra de oplossing ontdooid is, veeg de bovenkant van de kelder membraan-afgeleide oplossing flacon met een alcoholuitstrijkje voor het laden van 500 micro liter oplossing aangevuld met of zonder chemo attractant in elke een milliliter spuit.

Verwijder vervolgens eventuele luchtbellen uit de kelder membraan-afgeleide oplossing geladen spuit om een uniforme plug formatie te garanderen. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen, langzaam injecteren van een volledig volume van de kelder membraan-afgeleide oplossing zonder MCP-1 toegevoegd op ongeveer 100 micro liter per seconde onderhuids in de rechterflank van de verdoofde muis. En de volledige 500 micro liter van kelder membraan-afgeleide oplossing aangevuld met MCP-1 in de linkerflank van het dier.

Houd de spuit 20 tot 30 seconden na de injectie op zijn plaats om lekkage van de oplossing te voorkomen en om een enkele, gladde gelplug te laten vormen voordat u de muis op een warmverwarmpad plaatst met controle tot volledig herstel. Drie dagen na de injectie, verwijder het dorsale haar van een plug-geïnjecteerd dier en gebruik tangen om de huid te grijpen rond de onderste thoracale en bovenste lendenwervel. Maak een twee millimeter lange incisie in de huid en snijd langs de middellijn van de achterkant van de muis van de halswervels tot een centimeter boven de vertroddlee kruising.

Scheid de huid van de spierlaag en pin de huid op een polystyreen schuim platform. Vervolgens, onder een ontledenmicroscoop, zorgvuldig grijpen de vezelige capsule die de kelder membraan-afgeleide gel plug bevat en gebruik fijne tangen om de vezelige capsule te verwijderen. Gebruik vervolgens een fijne schaar om de stekker schoon te maken.

Breng vervolgens de gereinigde gelplug met de op het membraan afgeleide keldermembras in een op de juiste manier gelabelde en gewogen 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Reweigh de buis om het gewicht van de kelder membraan-afgeleide gel plug te berekenen. Voor keldermembraan-afgeleide gel plug spijsvertering, gebruik schone fijne schaar om de kelder membraan-afgeleide gel plug gehakt in elke micro centrifuge buis en voeg 800 micro liter verplaatsing aan de stekkers.

Vortex op de maximale snelheid gedurende 10 seconden om de stekkers te verstoren en plaats de microcentrifuge buizen op 37 graden Celsius gedurende twee uur in een thermo mixer op 1400 rotaties per minuut om volledig op te lossen de kelder membraan-afgeleide gel pluggen. Aan het einde van de incubatie, sediment de stekker fragmenten door centrifugatie twee keer en resuspend de pellets in 300 microliters van PBS. Breng 50 microliter van elke celsuspensie over in nieuwe microcentrifugebuizen en label de cellen in de nieuwe buizen met 0,5 microliter calcine.

Na een incubatie van 10 minuten bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator, tel het aantal levende groene fluorescerende positieve en dode niet-fluorescerende cellen op een geautomatiseerde cel teller. Voor een enkele cel westerse vlek analyse, voeg een milliliter van verdunde eencellige suspensie aan een gehydrateerde eencellige westelijke vlek chip in de bodem van een 10 centimeter petrischaal. Na vijf tot 15 minuten, onderzoek de chip onder brightfield microscopie.

Ongeveer 15 tot 20% van de microputten moet worden bezet door een enkele cel en minder dan twee procent van de putten moet twee of meer cellen bevatten. Als de chip goed is geladen, kantel de schotel 45 graden en was de chip drie keer met een ophangbuffer om niet-gevangen cellen te verwijderen. Na de laatste wasbeurt, zorgvuldig en laad de chip in de elektroforese cel van een enkele cel westers instrument, gel-side omhoog, en bedek de hele enkele cel westelijke vlek chip met lyse running buffer.

Start de cellyse en voer het instrument uit volgens de juiste experimentparameters. Aan het einde van de run, spoel de chip met twee 10-minuten wasbeurt met verse wasbuffer per wasbuffer per wasmachine op kamertemperatuur. Voeg na de tweede wasbeurt 80 microliter van de primaire antilichaamoplossing van belang toe aan de indringende antilichaamkamer en verlaag de chipgel-kant naar beneden, zodat de antilichaamoplossing over de chip lonkt.

Na twee uur bij kamertemperatuur, was de chip drie keer in wasbuffer en een keer in water op een shaker. Broed de chip een uur lang in met een passend secundair antilichaam bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie was je de chip drie keer met wasbuffer en draai je de chip op een schuifspinner om de resterende wasbuffer te verwijderen.

Om de enkele cel Western blot chip strippen, plaats een 15 milliliter buis rek in een 60 graden Celsius waterbad met het water slechts een centimeter boven het rek. Voeg in een rookkap 40 milliliter stripbuffer en 320 microliter bètamorcepta-ethanol toe aan een bus. Plaats de chip in een petrischaal van 10 centimeter in de bus en sluit de bus af met Parafilm.

Plaats vervolgens de bus in het buizenrek in het waterbad. Breng de chip na 90 minuten voorzichtig over in een nieuwe petrischaal en was de chip één keer kort met wasbuffer voordat u 15 milliliter verse wasbuffer aan de petrischaal toevoegt gedurende een wasbeurt van 15 minuten op de shaker. In dit representatieve experiment werden de cellen die in elke stekker werden aangeworven, geteld op één, drie en vijf dagen na de injectie.

Door het aantal cellen in de met voertuigen geladen stekkers af te trekken van het aantal cellen in de geladen pluggen van MCP-1, werd vervolgens het aantal cellen berekend dat specifiek werd aangeworven als reactie op de chemo attractant. Een versnelde MCP-1 specifieke rekrutering en accumulatie van cellen werd waargenomen over de periode van vijf dagen, met percentages die stegen van 31.000 cellen per dag na één dag injectie tot maximaal 136.000 cellen per dag, vijf dagen na injectie. Eencellige westerse vlek analyse werd vervolgens gebruikt om de verschillende celtypes aangeworven om de kelder membraan-afgeleide pluggen te identificeren, volgens hun expressie van specifieke immuuncel markers van belang.

Bijvoorbeeld, het percentage monocyten binnen de MCP-1 geladen kelder membraan-afgeleide gel pluggen was laag op dag een en piekte op dag drie voordat ze weer dalen op dag vijf, terwijl de macrofaag nummers gestaag toegenomen gedurende de studieperiode. Voor MCP-1 geladen stekkers was het percentage monocyten plus macrofagen binnen de geïsoleerde celpopulatie het hoogst op dag drie, wat aangeeft dat na drie dagen de overgrote meerderheid van de cellen die door MCP-1 afhankelijke chemotaxi's werden aangeworven, monocyten en macrofagen waren. Hoewel het totale aantal monocyten plus macrofagen op dag vijf doorgaans hoger is in vergelijking met dag drie, weerspiegelt het aantal cellen op dag drie nauwkeuriger perifeer bloed van monocyt chemotaxi's en rekrutering, en daarom wordt dag drie aanbevolen voor keldermembraan-directe plug-analyses.

Succesvolle verwerving van enkele cellen voor downstream analyse is afhankelijk van de nauwkeurigheid van de injectie en de volledige verwijdering van de stekkers. Flow cytometrie, eencellige westerse blotting, bulk, of eencellige RNA sequencing en andere omics procedures kunnen worden gebruikt om de karakteristieke en fenotypes van de aangeworven monocyt en monocyten afgeleide macrofagen te beoordelen.