Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

Dit protocol wordt gebruikt voor het in kaart brengen en discrimineren van de primaire en verwerkte transcripties in maïsmitochondriën. Deze techniek omvat een RNA normalisatie stap en het minimaliseren van de invloed van onstabiele vijf prime triphosfate dat een duidelijke discriminatie tussen de primaire en de verwerkte transcripties belemmert. Naast maïsmitochondriën kan deze methode worden toegepast op plastiden en andere plantaardige mitochondriën.

Begin met het verzamelen van 20 gram ontwikkelende pitten in een buis van 50 milliliter op ijs. Breng de pitten over op een voorgekoelde mortel en voeg 10 tot 20 milliliter ijskoude extractiebuffer toe. Maal de pitten volledig, voeg meer extractiebuffer toe en filter het grondweefsel door twee lagen filterdoek.

Centrifuge het filtraat op 8.000 keer G gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe buis en gooi het filtraat weg. Centrifuge de buis op 20.000 keer G gedurende 10 minuten.

Giet de supernatant af en hang de pellet opnieuw op in zes milliliter wasbuffer. Aliquot de schorsing in vijf 1,5 milliliter RNase-vrije buizen en centrifugeren ze op 14,000 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en bevries de mitochondriale pellet in vloeibare stikstof.

Extraheeren mitochondriaal RNA met behulp van commerciële reagentia volgens de instructies van de fabrikant en het opzetten van een RNA vijf prime polyfosfaatase behandeling. Herstel vervolgens het RNA met een RNA-zuiveringskit. Het reagens dat wordt gebruikt voor RNA-extractie is gevaarlijk.

Werk er altijd mee in een rookkap en draag altijd een labjas en handschoenen. Bereid twee circularisatiereacties voor met dezelfde hoeveelheden van vijf behandelde primaire polyfosfatase en niet-behandelde mitochondriale RNA's. Incubeer beide reacties op 16 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur en herstel vervolgens de zelf-ligated RNA's met een eerder gebruikte RNA zuivering kit.

Begin met het voorbereiden van een primer mengsel met een gelijke verhouding van 26 SCRT en maximaal zeven andere omgekeerde transcriptie primers. Monteer twee omgekeerde transcriptiereactiesystemen volgens de handschriftaanwijzing en broed ze gedurende 50 minuten uit op 42 graden Celsius. Om de cDNA te normaliseren, bereidt u twee PCR-reacties voor met hetzelfde volume cDNA's uit de vijf eerstgefosfatase behandelde of niet-behandelde RNA's en voert u de reactie uit onder thermocyclingomstandigheden die in het manuscript worden beschreven.

Normalisatie door 26S volwassen rRNA is een belangrijke stap om onderscheid te maken tussen de primaire en de verwerkte transcripties. Vergelijk de overvloed van de twee PCR-producten en optimaliseer indien nodig de normalisatie door de hoeveelheden sjabloon-cDNA's aan te passen. Bereid paren van PCR reacties met de juiste volumes van genormaliseerde cDNA's en een paar divergerende primers zoals in de vijf prime tot drie prime junction van de doeltranscripties en voer PCR volgens het manuscript richtingen.

Gebruik vervolgens een gel DNA recovery kit om de prominente banden te isoleren die worden versterkt door geneste PCR. Kloon de gel gezuiverde PCR-producten in een vector met behulp van standaardtechnieken en voer kolonie PCR uit om positieve klonen te selecteren die de doelinserts bevatten. Sequentie van de PCR-producten en lijn de sequencing gegevens met de maïs mitochondriaal genoom met behulp van de fundamentele lokale uitlijning search tool of BLAST.

Kies de organismemaïs en zoek database nucleotide collectie. Zoek de vijf prime tot drie prime junction van de gecirculeerde transcript en bepalen van de posities van de vijf prime en drie prime transcript termini. Versterk het DNA-fragment dat wordt gebruikt om de RNA-sonde voor te bereiden en te klonen aan de eerder gebruikte vector die een T7-promotor bevat, 17 basisparen stroomopwaarts van de invoegplaats.

Label de RNA-sondes met dig-11-UTP en voer RNA-hybridisatie uit met commerciële kits. Onderscheid de primaire en verwerkte vijf priemeinden door de circulaire RT-PCR-producten te vergelijken die zijn verkregen uit de genormaliseerde vijf hoofdpolyfotase die behandeld wordt en niet-behandelde RNA's. Ontwerp vervolgens kwantitatieve RT-PCR primers op basis van de kaartresultaten en controleer de discriminatieresultaten met RT-PCR.

Het COX-2 gen werd gebruikt als voorbeeld om de mapping en discriminatie van maïs mitochondriale transcripties aan te tonen met de circulaire RT-PCR gebaseerde strategie. De genormaliseerde cDNA's werden gebruikt als sjablonen voor PCR, wat resulteerde in twee prominente banden versterkt uit de vijf prime polyfosfatase behandeld monster. De twee bands kregen de naam COX-2 een en twee hersteld van de gel en gekloond in vectoren.

Kolonie PCR resultaten toonden aan dat de positieve klonen inserts met variabele grootte bevatten, wat impliceert dat de termini heterogene vijf prime of drie prime termini hebben. De sequencing resultaten toonden aan dat COX-2 een en twee hebben dezelfde drie priemgeste eindigt op 39 nucleotiden stroomafwaarts van de stop codon, terwijl hun vijf prime termini bevinden zich op 992 tot 1, 030 en 1, 276 tot 1, 283 nucleotides upstream van de start codon, respectievelijk. RNA gel blot hybridisatie werd uitgevoerd om de circulaire RT-PCR mapping resultaten te verifiëren en twee grote banden met maten vergelijkbaar met COX-2 een en twee werden gedetecteerd.

Een ander paar divergerende primers werden ontworpen om de COX-2 drie en vier banden gedetecteerd met de RNA gel vlek te versterken, maar niet met de eerste keer circulaire RT-PCR. De kwantitatieve RT-PCR resultaten bevestigden dat COX-2 een, twee, drie en vier gevoelig waren voor vijf prime polyfosfatase en dat ze primaire vijf prime termini hadden. Primer-extensieanalyse kan worden uitgevoerd om de vijf prime mapping-resultaten te verifiëren, hoewel deze niet in dit protocol is opgenomen.