Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van fundamentele vragen over de dynamiek van neurale voorloper cellen en hun nakomelingen die ten grondslag liggen aan gewervelde ontwikkeling van de hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om meerdere clusters van clonally gerelateerde cellen in de levende hersenen gedurende vele uren van ontwikkeling direct te visualiseren. Het protocol kan ook worden toegepast op het bestuderen van kloon- en voorloperdynamiek in andere ontwikkelende systemen van het zebravisembryo.

Visualisatie met behulp van deze methode is vooral handig voor het direct observeren van fundamentele processen die optreden tijdens neurale ontwikkeling. Op de middag voorafgaand aan het uitvoeren van micro-injecties, het opzetten van wilde type volwassen zebravissen in geslacht gescheiden paringstanks. Bereid de volgende ochtend de DNA-oplossing volgens de handschriftaanwijzing voor en injecteer ongeveer 4,2 nanoliter van deze oplossing in één cel zebravisembryo's binnen 45 minuten na bevruchting.

Houd de geïnjecteerde embryo's in E drie medium en een 28 graden Celsius incubator voor 24 uur, bel dan de dode en misvormde embryo's uit de groep. Breng tot 20 gezonde embryo's over in een buis van 50 milliliter, vul het met 10 milliliter E drie en plaats een dop op elke buis. Plaats een rek met de 50 milliliter buizen rechtop in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 80 tot 90 minuten, ervoor te zorgen dat het waterniveau in het bad hoger is dan de E drie in de buis.

Haal het buisrek uit het waterbad en plaats het in de 28 graden Celsius incubator. Laat maximaal een uur voor de E drie afkoelen en de embryo's te reacclimate aan de temperatuur. Breng ze vervolgens over naar petrischaaltjes met 0,2 millimolar PTU en E drie warm gehouden in de 28 graden Celsius incubator.

Bestudeer de embryo's twee tot vier uur na de hitteschok onder een standaard fluorescentiedissectiemicroscoop op expressie van GVB of YFP, wat duidt op succesvolle Brainbow recombinatie. Selecteer embryo's met een robuuste FP-expressie en breng ze over naar een aparte schotel met PTU. Beeld ze een, twee of drie dagen na de bevruchting.

Expressie die lijkt zwak onder een fluorescentie microscoop kan eigenlijk goed worden gevisualiseerd in confocale time-lapse beeldvorming. Bereid voorafgaand aan de dag van het experiment de beeldkamer en het embryomanipulatiegereedschap voor. Om de beeldkamer voor te bereiden, moet u voorzichtig een plastic ring naar het midden van een petrischaal van 60 millimeter plaatsen.

Bouw de manipulator door super lijmen een kleine lengte van nylon vislijn aan het einde van een vier inch houten wattenstaafje stok. Indien nodig, dechorioneren van de embryo's onder een dissectie microscoop voorafgaand aan de montage. Om de embryo's te monteren, breng de vis naar het midden van de plastic ring in de beeldkamer en verwijder zo veel overtollige E drie mogelijk met een fijne getipte overdracht pipet.

Gebruik een schone overdracht pipet om de vis te bedekken met een procent lage smelt agarose en E drie, het vullen van de hele plastic ring met een laag van agarose. Trek vervolgens voorzichtig het embryo omhoog in de pipetpunt en terug in de agarose zonder luchtbellen te introduceren. Gebruik een embryo manipulator om snel oriënteren van de vis en de agarose voordat het verhardt.

Als beeldvorming met een rechte microscoop, plaats het embryo zo dicht mogelijk bij het bovenste oppervlak van de agarose mogelijk, ervoor te zorgen dat ze parallel aan de onderkant van de beeldkamer met hun staart recht. Wacht tot de agarose uithardt, vul vervolgens de beeldkamer met E drie, en voeg zoveel mogelijk toe om rekening te houden met verdamping in de loop van de beeldvorming. Plaats de beeldkamer met de vis en E drie op de confocale microscoop.

Selecteer vervolgens het doel met een hoog numeriek diafragma en een lange werkafstand. Zoek een gebied met de juiste dichte en heldere etikettering van cellen en stel de acquisitieparameters in. Dit is een voorbeeld met Behulp van Zen-software, maar de instellingen variëren afhankelijk van de microscoop en laserlijnen beschikbaar.

Bereid drie tracks voor om elk FP-kanaal achtereenvolgens te beelden. Gebruik een argonlaser om GVB op te wekken op 458 nanometer en YFP op 514 nanometer en gebruik een DPSS 561 nanometer laser om dTomato op te wekken. Verzamel de missies voor de drie op de juiste golflengten.

Selecteer het Z-stackbereik naar de afbeelding en een tijdsinterval tussen 10 en 30 minuten om mitotische en apoptotische gebeurtenissen bij te houden. Selecteer ten slotte de lengte van de beeldsessie en voer het experiment uit. Nadat de beeldvorming is voltooid, slaat u de ruwe gegevens in CZI-formaat op als u Zen of een ander formaat gebruikt dat compatibel is met Fiji en importeert u de afbeeldingen vervolgens in Fiji met behulp van de importeur van bioformaten.

In vivo multicolor time-lapse imaging werd gebruikt om Brainbow kleur gecodeerde klonen van cellen in de proliferative ventriculaire zone van de zich ontwikkelende zebravis hindbrain te tonen. Brainbow gelabelde cellen gerangschikt langs een bepaalde radiale vezel gedeeld dezelfde kleur. Die kan worden gekwantificeerd als de relatieve RGB kanaal gewichten.

Dit suggereert dat deze radiogroepen waren klonen van delende cellen en dat hun soortgelijke kleur kan worden gebruikt om ze te identificeren als zijnde clonally gerelateerd. Een kwantitatieve kleuranalyse toonde aan dat dochtercellen dezelfde kleur uitdrukken als de cel van hun moeder. Maar dat naburige radioclusters van cellen van elkaar kunnen worden onderscheiden.

Talrijke klonen van verwante cellen kunnen gelijktijdig over uren in vivo worden gevolgd, toestaand voor een multiplexlijnanalyse en vergelijking. Kwantificering van kleurexpressie in klonen op twee en dan weer op drie dagen na de bevruchting bleek dat Brainbow expressie bleef relatief constant van twee tot drie dagen. Time-lapse imaging bleek tal van cellen ondergaan interkinetische nucleaire migratie en celdeling van een tot twee dagen na de bevruchting, waardoor het mogelijk is om de celcyclus te bestuderen.

Er werd een gemiddelde celcyclus van 8,4 uur berekend die vergelijkbaar is met eerdere metingen bij zebravissen. Bovendien werd deze beeldvormingstechniek gebruikt om individuele cellen te observeren die de stereotiepe morfologische veranderingen ondergingen die gepaard gaan met apoptose, zoals membraanbleken en celfragmentatie. Omdat deze methode in vivo wordt uitgevoerd, kunnen zebravissen uit de beeldkamer worden gered en op latere punten voor beeldvorming of andere experimenten worden onderhouden.

Het gebruik van deze techniek stelt ons in staat om nieuwe vragen over de rol van clonally gerelateerde cellen te verkennen tijdens neurale ontwikkeling.