Hemocompatibiliteittesten van bloedcontactimplantaten in een Flow Loop-model dat menselijke bloedstroom nabootst

Dit protocol presenteert een model voor het hemocompatibiliteitsonderzoek van bloedcontactapparaten volgens de richtlijnen van de International Standard Organization. Het model is ideaal voor het nabootsen van de fysiologische omstandigheden die overeenkomen met het implantaat, omdat de lage achtergrond voor trombotische gebeurtenissen en de lage concentratie van antistollingsmiddelen een brede analyse van de bloedparameter mogelijk maken. Deze methode is ideaal voor biomaterieel onderzoek, omdat het een eenvoudige manier biedt om hemocompatibiliteit te evalueren.

Bovendien kan het worden gebruikt voor preklinische studies. Voor heparinebelasting mengt u eerst 5.000 internationale eenheden onverdunde heparine met 0,9% natriumchloride om een 15 internationale eenheden per milliliter heparineconcentratie te verkrijgen. Voeg vervolgens 900 microliter van de verdunde heparineoplossing toe aan drie neutrale monovettes en drie gereserveerde monovetten per donor en bewaar de met heparine geladen monovettes op vier graden Celsius.

30 minuten voor de bloedmonsterverzameling, plaats de monovettes op kamertemperatuur. Wanneer de monovetten zijn opgewarmd, verzamel dan negen milliliter bloed in elk van de drie monovetten per donor voordat ze alle 27 milliliter bloed van elke donor in één plastic container bundelen. Om de stroomlus voor te bereiden, laadt ten minste één buis per aandoening met het neurovasculaire lasergesneden implantaat van belang en plaatst u één uiteinde van elke buis in een reservoir gevuld met 0,9% natriumchloride.

Plaats een ongeladen buis in het reservoir en sluit alle buizen aan op de pompkop. Steek vervolgens het andere uiteinde van elke buis in een meetcilinder en pas de instellingen van de peristaltische pomp aan op een stroomsnelheid van 150 milliliter per minuut met behulp van een timer tijdens het controleren van het vulniveau in de meetcilinder. Voor hemocompatibiliteitstests gebruikt u een spuit van 12 milliliter om elke buis te vullen met zes milliliter bloed.

Na het vormen van een circuit, gebruik maken van een 0,5 centimeter lengte van siliconen verbinden buizen om de buizen goed te sluiten en plaats de buizen in een 37 graden Celsius waterbad. Start dan de 60 minuten buis. Voor de analyse van het gehele bloedtelling voegt u 1,2 milliliter niet-geperfundeerd bloed of 1,2 milliliter bloed van elke buis na de perfusie toe in afzonderlijke monovetten die EDTA bevatten.

Draai de monovettes vijf keer voorzichtig om en laad de flesjes in een bloedanalyse voor een bloedtellingsanalyse van elk monster. Aan het einde van de analyse, plaats de monovettes op ijs voor 15-60 minuten. Voor citraat plasma verzameling, vul citraat-bevattende monovettes met 1,4 milliliter niet-geperfundeerd of geperfuseerd bloed en zorgvuldig omkeren elke monovette vijf keer.

Scheid het plasma door centrifugatie en breng drie 250 microliter aliquots van de plasmafractie over in individuele 1,5 milliliter reactiebuizen. Bevries vervolgens de plasmamonsters in vloeibare stikstof en bewaar ze op min 20 graden Celsius tot hun analyse. Voor EDTA plasma verzameling, na de vier graden Celsius incubatie na de bloedtelling meting, scheiden het plasma door centrifugatie en breng drie 250 microliter aliquots van de plasmafractie in individuele 1,5 milliliter reactiebuizen.

Bevries vervolgens de plasmamonsters in vloeibare stikstof voor min 20 graden Celsius opslag. Voor CTAD plasma collectie, vul CTAD-bevattende monovettes met 2,7 milliliter vers getrokken of geperfundeerd bloed en zorgvuldig omkeren de buizen vijf keer. Leg de monovetten 15-60 minuten op ijs voordat u het plasma door centrifugatie verzamelt.

Breng 700 microliter van elke middelste plasmafractie over in individuele 1,5 milliliter reactiebuizen en centrifugeer de gevulde reactiebuizen opnieuw. Breng vervolgens twee 100 microliter aliquots van de middelste fractie over in individuele 1,5 milliliter reactiebuizen en vries de buizen in vloeibare stikstof voor hun opslag bij min 20 graden Celsius. Om de TAT-niveaus in de citraatplasmamonsters te meten, voeg u 50 microliter ELISA-monsterbuffer toe in elke put van een 96-bron vlakke bodemplaat en 50 microliters plasmanorm, plasmacontrole en onverdunde plasmamonsters in duplicaten aan de juiste putten van de plaat.

Na het afdichten van de plaat, incubeer de monsters op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten met zachte schudden. Aan het einde van de incubatie, was de plaat drie keer met 300 microliters wasoplossing per goed voordat u 100 microliters peroxidase geconjugateerd anti-menselijke TAT-antilichaam aan elke put toevoegt. Na een incubatie van 15 minuten bij 37 graden Celsius met schudden, was de plaat drie keer met 300 microliters verse wasoplossing per put.

Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliter vers bereide chromogene-oplossing per put toe voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie 100 microliters stopoplossing toe aan elke put en lees de optische dichtheid op een fotometer op 490 tot 500 nanometer met behulp van de standaardcurvegegevens als trendlijn voor het berekenen van de TAT-concentratie van elk monster. Om de implantaten voor te bereiden op het scannen van elektronenmicroscopie, gebruikt u tangen om de implantaten uit de buizen te verwijderen en elk implantaat kort drie keer te spoelen in verse 0,9% natriumchloride per wasbeurt.

Bewaar na de laatste wasbeurt de implantaten in afzonderlijke containers van 2%glutaraldehyde in PBS zonder calcium en magnesium 's nachts bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, incubeer de implantaten in individuele containers van PBS gedurende 10 minuten voor het dehydrateren van de implantaten in opgaande concentraties van ethanol gedurende 10 minuten per concentratie zoals aangegeven. Direct na bloedafname en perfusie worden geen veranderingen gedetecteerd in het aantal witte of rode bloedcellen of in de hematocrietwaarden.

Er wordt echter een afname van het hemoglobinegehalte gedetecteerd na perfusie in het stroomlussysteem. Er wordt ook een afname van bloedplaatjes waargenomen, die wordt verhoogd wanneer er een ongecoate stent aanwezig is in de slang. Met name wordt dit verlies verminderd wanneer het bloed wordt geïncubeerd met een fibrin-heparine-gecoate stent.

De TAT-complexe concentratie wordt licht verhoogd in reactie op de perfusie. Wanneer een kale metalen stent wordt toegevoegd, echter, een aanzienlijke toename van de TAT wordt gedetecteerd die wijst op een diepgaande activering van het stollingssysteem. Het gebruik van een fibrin-heparine-gecoate stent voorkomt deze activering.

Perfusie leidt tot een verhoogde activering van de complimentcascade die niet wordt beïnvloed door de aanwezigheid van ongecoate of fibrin-heparine-gecoate stents. Op dezelfde manier worden neutrofiele granulocyten geactiveerd, zoals blijkt uit de kwantificering van polymorfucleaire neutrofiele elastaseniveaus. Visualisatie door het scannen van elektronenmicroscopie blijkt dat de aanwezigheid van een dicht netwerk van bloedcellen en eiwitten op het oppervlak van de ongecoate stent na perfusie die niet wordt waargenomen op de fibrin-heparine-gecoate stents.

Het is van het grootste belang om te bevestigen dat het bloed voldoet aan de inclusiecriteria voor het verkrijgen van monsters en om vers getrokken bloed zo snel mogelijk te gebruiken. Menselijk bloed kan bloedoren virussen en andere middelen bevatten en draagt het risico van infectie, dus zorg ervoor dat u altijd de juiste BESCHERMINGsmiddelen draagt bij het hanteren van de monsters.