Een nieuwe toolkit voor het evalueren van genfuncties met behulp van voorwaardelijke Cas9-stabilisatie

Deze methode biedt snelle, temperatuurgecontroleerde CRISPR-Cas9 genbewerking onder een klein molecuul, Shield-1. Het biedt ook minder off-target effecten, lagere celtoxiciteit, en ook hogere intern gecontroleerde genbewerking bij het vergelijken met constitutieve activering van Cas9. Het belangrijkste voordeel van dit deeltje is dat het kan worden gebruikt voor karakterisering van essentiële genen, evenals tumoroverlevingsgenen.

Destabilisatie van DD-Cas9 is onafhankelijk van de expressie ervan, en dit maakt het mogelijk om het gen van belang mede-uitgedrukt onder dezelfde promotor. Deze methode kan eenvoudig worden toegepast op in vivo en in vitro studies. Shield-1 kan ook doordringen door de bloed - hersenbarrière, waardoor het ook gemakkelijk is om genen te bestuderen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de hersenen.

Gelijkmatig zaai gezonde HEK293T cellen met een dichtheid van één tot twee miljoen cellen per 10 centimeter weefselkweekplaat met behulp van 10 milliliter glucose DMEM met 10% gefilterde FBS. Incubeer de cellen in de weefselkweek incubator bij 5%kooldioxide en 37 graden Celsius gedurende 20 uur. Bevestig de volgende dag dat de cellen 70% samenvloeiing bereikten door brightfield-microscopie en dat ze gelijkmatig over de plaat zijn verspreid.

Verander de media een uur voor de transfectie met een eindvolume van 10 milliliter. Bereid twee buizen voor met 500 microliter warme media. Voeg 25 microliter transfectiereagens toe aan buis één en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Voeg aan de andere buis een mengsel van plasmiden toe. Meng buis één met buis twee om een transfectiemengsel te vormen en incubeer gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Voeg het transfectiemengsel druppelgewijs toe aan de HEK293T-cellen en incubeer de plaat in de weefselkweek-incubator.

Verander na 18 uur het medium voorzichtig in 10 milliliter verse DMEM met 10%FBS om het transfectiereagens te verwijderen. Incubeer de cellen de komende 48 uur. Verzamel na 48 uur het supernatant met een spuit van 10 milliliter en passeer het door een filter van 0,45 micrometer.

Aliquot het virus supernatant en bewaar het op min 80 graden Celsius. Voor het bepalen van virustiter, zaad 5 miljoen HEK293T cellen per put in twee zes-put platen. Incubeer beide platen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide 's nachts om 50 tot 60% samenvloeiing te bereiken.

Gebruik de volgende dag een van de zesputplaten om de cellen in de zes putten te tellen. Ontdooi het virus aliquot dat zal worden gebruikt om de seriële verdunning uit te voeren en voeg acht microgram per milliliter polybreenreagens toe, bereid DMEM met 10% FBS voor seriële verdunning van het virus en voeg het polybreenreagens toe. Bereid twee milliliter tienvoudige seriële verdunningen van het lentivirus van 0,1 tot 0,0001 in polybreen bevattende media.

Verwijder media van de zes-put plaat en voeg een milliliter virale verdunningen toe aan de putten, waardoor een put met media alleen als een negatieve controle en een goed met 100% virus. Incubeer de cellen gedurende 24 uur. Verwijder de volgende dag de media met het virus van de zes-put platen en verander het in twee milliliter verse DMEM met 10%FBS.

Incubeer de cellen gedurende 48 tot 72 uur en observeer GFP elke dag met een fluorescerende microscoop. Maak na 48 tot 72 uur de cellen los en resuspend ze in maximale buffer. Gebruik een flowcytometer om het percentage GFP-expressie te bepalen en de virustiter te berekenen met behulp van de formule in het teksthandschrift.

Plaat de cellijn van belang in een plaat van 10 centimeter en incubeer 's nachts om samenvloeiing van 50 tot 60% te bereiken En infecteer vervolgens de cellen met 500 tot 2.000 microliter virusdeeltjes in een totaal volume van 10 milliliter kweekmedium. Incubeer de virale media gedurende 24 uur. Verander de volgende dag de virale media in kweekmedia en bepaal het percentage GFP-positieve cellen met behulp van flowcytometrie.

Selecteer GFP-positieve cellen met BD FACSAria II voor celsortering. Vouw positief geselecteerde cellen uit en vries de voorraad in. Plaat de positief geselecteerde cellen en onverzonde cellen in 12-put platen afzonderlijk, 24 uur na infectie.

Wacht tot de cellen zich hechten en verander de media in celkweekmedia met 200 nanomolar Shield-1. Vervang de media in de platen door getransduceerde en niet-vertaalde cellen, waardoor twee putten per plaat met gewone media als negatieve controle achterblijven. Incubeer en extract eiwitten uit elke put op nul, twee, zes, 12, 24, 48 en 72 uur na het toevoegen van Shield-1 aan de putten.

Verwijder vervolgens de media met Shield-1 uit de rest van de putten en vervang deze voor gewone celmedia. Verzamel de eiwitten uit die putten op twee, zes en 12 uur na het veranderen van de media. De inductie van Cas9-eiwit werd bevestigd doordat de expressieniveaus vergelijkbaar waren tussen de transduceerde cellen en het voertuig, ondanks de aan- of afwezigheid van Shield-1.

Er is voldoende inductie van Cas9-expressie in de getransduceerde A549-cellijn twee uur na behandeling met Shield-1, die verwaarloosbaar wordt binnen zes tot 12 uur na intrekking van Shield-1. Shield-1 behandelde getransduceerde A549-cellen daalden in aantal na 48 uur zonder het Rinella-monster aan te tasten, dat werd gevalideerd door immunoblotting met behulp van een antilichaam tegen het uitgeputte RPA3-eiwit. Genbewerkingsinversie- of indelmutaties werden bevestigd met behulp van nucleasetesten van landmeters.

De lentivirus vector construct ontworpen was een bicistronic systeem met een ander gen van belang onder dezelfde EF-1a promotor. Een gemodificeerd fluorescerend eiwit, P2A, werd toegevoegd om geïnfecteerde cellen op te sporen. De expressie van het mVenus-eiwit werd waargenomen in het voertuig en de A549-transduceerde cellen, onafhankelijk van DD-Cas9-expressie en Shield-1-behandeling.

De efficiënte transductie van de cellijn met DD-Cas9 vector is een van de snelheidsbeperkende stappen, voor het hebben van gezonde HEK293T-cellen en het gebruik van hun lage passagenummer is cruciaal. De optimalisatie van de verhouding tussen DD-Cas9 plasmide, verpakking plasmide en envelop plasmide is erg belangrijk voor een optimale transfectie. Maar daarnaast is ook de hoeveelheid Shield-1 die nodig is om DD-Cas9 doelcellen te stabiliseren iets waar je voorzichtig mee moet zijn.

De DD-Cas9 met de Cre plasmide is ook beschikbaar, en het kan worden gebruikt om de genetische interacties te bestuderen in in vivo studies op basis van cre-lox systeem.