Name: Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer CRISPR-Cas9 genoombewerking in menselijke pluripotente stamcellen voor het genereren van heterozygote en homozygote mutaties. Deze methode verbetert de efficiëntie en minimaliseert ongewenste indel-mutaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de financiering van het nationaal hart, het Long-en het bloed Instituut (NHLBI), de National Institutes of Health via subsidies U01HL099656 (P.G. en D.L.F.) en U01HL134696 (P.G. en D.L.F.).

1. ontwerp en constructie van gids RNA (gRNA)
Opmerking: elke gRNA bestaat uit 2 60 base pair (BP) oligonucleotiden die zijn gegloeid om een 100 BP dubbel strandde (DS) oligonucleotide (Figuur 1a-C) te genereren. De tijdlijn voor gRNA ontwerp, generatie en testen snijefficiëntie is ongeveer 2 weken (Figuur 2).
<ol><li>Selecteer het DNA-gebied van belang om genoom te worden bewerkt en Identificeer 3-4 23 BP-sequenties die passen bij het formaat, 5 '-G (N19) NGG-3 '. Deze sequenties moeten binnen 20 BP van het interessegebied liggen. Opmerking: targeting kan worden uitgevoerd op de Sense-of anti-Sense-streng.</li>
	<li>Evalueer de gRNA-sequenties voor genomische redundantie en niet-doel waarschijnlijkheid met behulp van een resource zoals CRISPOR (http://crispor.tefor.net).</li>
	<li>Neem de 20 BP doel sequentie (met uitzondering van het protospacer aangrenzend motief of PAM) op in 2 60-Mer oligonucleotiden zoals afgebeeld (sequenties zijn 5 ' tot 3 ' en rood en groen zijn omgekeerde aanvullingen zoals weergegeven in Figuur 1C).</li>
	<li>Bestel de 2 60 BP oligonucleotiden van de leverancier naar keuze. Als de oligonucleotiden eenmaal zijn ontvangen, hervat u elk tot een eindconcentratie van 100 μM in ddH2O. Maak een werkende voorraad van 10 μM.</li>
	<li>Anneal de twee oligonucleotiden en het genereren van een 100 BP dsDNA fragment met behulp van DNA-polymerase (tabel van materialen). Combineer 5 μL van 10 μM voorwaarts oligonucleotide en 5 μL 10 μM reverse oligonucleotide in een polymerase kettingreactie (PCR) strip buis en inincuberen bij 95 °C gedurende 5 min. laat de reactie gedurende 10 minuten afkoelen bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Stel de PCR in zoals beschreven in tabel 1. Voer PCR-versterking uit in een thermische cycler met behulp van de parameters die worden beschreven in tabel 2.</li>
	<li>Visualiseer de PCR-producten op een 1,5% (w/v) ethidiumbromide bromide (etbr) agarose gel elektroforesed bij 80-100 V voor 40 min. accijnzen de 100 BP band (Figuur 3a), GEVISUALISEERD op een LED lichtbak, van de gel met een scheermesje en zuivert met een gel extractie Kit (tabel van materialen).</li>
</ol>2. ontwerp van PCR-primers voor screening
<ol><li>Voer screening van het bewerkte DNA uit met behulp van voorwaartse en omgekeerde PCR-primers die specifiek zijn ontworpen om een 400-500 BP-regio van het gen van belang te versterken (tabel 2). Gebruik DNA geïsoleerd van elke controle-iPSC-lijn om een schone ampliconlengte voor Temp te bevestigen bij het uitvoeren van de screening-PCR.</li>
	<li>Visualiseer PCR-producten op een 1,5% (w/v) gel na Elektroforese bij 80-100 V gedurende 1 uur. Opmerking: Sequentiëren van bewerkte klonen wordt uitgevoerd met behulp van een geneste primer die is ontworpen na bevestiging van de screening primer set. Monsters worden verzonden naar een commerciële bron voor sequentiëren.</li>
</ol>3. bereiding van gRNA_cloning vector plasmide
<ol><li>Om de kloon vector te linealiseren, neemt u een centrifugebuis van 1,5 mL en voegt u 1-5 μg DNA van de gRNA_cloning vector toe, samen met 4 μL van de AFLII-beperkings enzym buffer en 1,5 μl AFLII-restrictie-enzym. Breng de reactie op 24 μL ddH2O. Meng de reactie door Pipetteer op en neer. Incuberen bij 37 °C 's nachts (O/N).</li>
	<li>Electrophorese op een 1% agarose gel bij 80-100 V voor 1 h en accijnzen banden (verwachte band grootte is ~ 3519 BP).</li>
	<li>Extract en zuiveren zoals in stap 1,6.</li>
</ol>4. assemblage van gRNA vector
<ol><li>Reacties instellen en DNA-fragmenten samenstellen met behulp van de montagekit (tabel met materialen) bij 1:5 ratio's van AFLII verteerd grna klonen vector naar 100 BP gel gezuiverde wisselplaat, zoals beschreven in tabel 3.</li>
	<li>Incuberen de reactie bij 50 °C gedurende 15 min. Verdun de reactie 1:3 in ddH2O en gebruik 3 μL voor bacteriële transformatie volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen). Plaat cellen op kanamycine LB/agar platen.</li>
	<li>Kies 3-5 kolonies per gRNA. Inoculeren elke kolonie in 4 mL LB en groeien O/N bij 37 ° c in een orbitaal schudden incubator.</li>
	<li>Reinig plasmide DNA met behulp van een miniprep plasmide isolatiekit en volg elke gRNA met behulp van de volgende primers om een succesvol klonen te garanderen: doorsturen: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Omgekeerde: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.</li>
</ol>5. test de snijefficiëntie van gRNA
<ol><li>Plaat hESCs op bestraalde muriene embryonale fibroblasten (Mef's) in een 6-put plaat, zoals eerder beschreven21. Wanneer de cellen 70-80% confluency bereiken, bereidt u de transfectie Master mix voor in tabel 4.</li>
	<li>Meng door pipetteren en inbroed bij RT gedurende 15 min. Voeg druppelsgewijs toe aan de cellen en inincuberen bij 37 °c gedurende 48 uur (met een media verandering na 24 uur).</li>
	<li>Oogst cellen voor sortering na 48 h.<ol>
<li>Verwijder MEFs enzymatisch (tabel met materialen) met een incubatie van 3 min RT.</li>
		<li>Spoel cellen 1x met hesc medium (tabel 5) en schraap in hesc medium + 10 μM Y-27632 dihydrochloride (tabel van materialen).</li>
		<li>Pellet cellen bij 300 x g gedurende 3 minuten en respenderen in 0,5 ml hesc medium + 10 μM Y-27632 dihydrochloride.</li>
		<li>Filtreer in een 5 mL buis door een 35 μm celstrainer dop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), poort op levende cellen en sorteer de groene fluorescerende proteïne (GFP) positieve cellen.</li>
	<li>Breng maximaal 1,5 x 104 gesorteerde cellen rechtstreeks over in een schotel van 10 cm2 met 1:3 Basement membraan matrix (tabel met materialen) en bestraalde mef's in hesc-medium (tabel 5) met Y-27632 dihydrochloride.</li>
	<li>Verander medium dagelijks met behulp van de hESC medium (tabel 5) zonder Y-27632 dihydrochloride en handmatig te plukken klonen na 10-15 dagen, wanneer kolonies zijn ~ 1 mm in diameter.<ol>
<li>Met behulp van een P200 pipet en Microscoop, zorgvuldig schrait een enkele kloon en trek cellen in de pipet.</li>
		<li>Dispergeren de cellen door zachtjes pipetteren 3-4x in een 96 goed bord in het medium opgesteld met de kolonie.</li>
		<li>Afdoseren van PCR-strip buizen voor screening en pellet de cellen door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 min. Kies 20 kolonies per grna.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kloon screening
<ol><li>Isoleer DNA door celpellets te inbrokkelen in 20 μL proteïnase K-buffer (tabel 5) (1 uur bij 55 °c en 10 min bij 95 °c) en Vortex krachtig. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 minuten en vang het supernatant op.</li>
	<li>Voer screening-PCR (sectie 2) uit in een totaal volume van 20 μL met behulp van een Master-Mix, inclusief primers die zijn ontworpen om het gebied van belang te versterken en 5 μL van de proteïnase K Digest. Gebruik genomisch DNA geïsoleerd van de cellijn die genbewerkt was als een controle.</li>
	<li>Evalueer grootte wijzigingen van PCR-producten na 1 uur Elektroforese bij 70-90 V op een 2,5% (w/V) agarose-gel (Figuur 3B, C). Elke grootte verschil is indicatief voor decolleté.</li>
</ol>7. precieze genoom bewerking in pluripotente stamcellen met behulp van enkele streng oligo DNA (ssODNs)
<ol><li>Ontwerp 100 BP ssODNs gecentreerd rond de meest efficiënte gRNA-sequentie, vastbesloten om de beste snijefficiëntie te hebben.</li>
	<li>Voorkom opnieuw splijting van de hercombineerde ODN door het introduceren van stille mutaties in de gRNA-sequentie. Een enkele stille mutatie in de PAM-reeks volstaat, maar als dit niet mogelijk is, zullen 3-4 stille mutaties werken. Opmerking: om de screening van gerichte klonen te vergemakkelijken, is de introductie van een beperkings site binnen ~ 20 BP van de gRNA-reeks ideaal.</li>
	<li>Ontwerp een ODN met de gewenste basis wijziging (en) om de mutatie van belangstelling te creëren en een ODN zonder de basis wijziging (en). Opmerking: deze wijzigingen mogen niet meer dan ~ 20 BP van de voorspelde CRISPR/CAS9 cut site, als recombinatie daalt aanzienlijk op grotere afstanden.</li>
	<li>Bestel de twee ssODNs van de leverancier van keuze en respendeer in water om 1 μg/μL voorraden te maken. Winkelvoorraden bij-20 °C.</li>
</ol>8. transfection Setup
<ol><li>Voor het transfect van de ssodn en de crispr CAS9 plasmiden, plaat de doelcel lijn in een 6-well gerecht op bestraalde mefs om 70-80% confluentie te bereiken na een incubatie van O/N.</li>
	<li>De transfectie reactie instellen zoals beschreven in tabel 6. Meng de reactie door pipetteren en incuberen gedurende 15 minuten bij RT. Voeg het transfectie-reactiemengsel druppelsgewijs toe aan de cellen.</li>
	<li>Na 48 h, bereidt u de cellen voor op celsortering zoals beschreven in paragraaf 5,3.</li>
	<li>Kies kolonies ~ 10 dagen na het bekleden van enkele cellen met een pipet van 200 μL. Breng 100 μL cellen over naar een put van een 24-of 48-goed plaat die eerder is bekleed met gelatine en bestraalde Mef's in hESC-medium met Y-27632 dihydrochloride. Gebruik de resterende 100 μL voor DNA-isolatie zoals beschreven in rubriek 6.</li>
</ol>9. controle op mutaties in enkele kolonies
<ol><li>Om te controleren op een geslaagde integratie van de ssODN, neemt u 5 μL DNA geïsoleerd van elke kolonie om PCR uit te voeren met behulp van de screenings primers die zijn ontworpen in sectie 2. Reinig de PCR-producten (tabel met materialen) en bereid de vergisting van het restrictie enzym voor met behulp van de unieke enzym site die in de ssodn is gemaakt. Opmerking: deze spijsvertering omvat ook de restrictie-enzym buffer en de aanbevolen concentratie van het beperkings enzym van de fabrikant in een volume van 40 μL.</li>
	<li>Meng de reactie door pipetteren en inbroed op de aanbevolen temperatuur van de fabrikant voor 1-3 h.</li>
	<li>Visualiseer de verteerde PCR-producten op een 1,5% (w/v) EtBr agarose gel elektroforesed bij 80-100 V voor 40 min. Als er een succesvolle integratie van de ssODN heeft plaatsgevonden, volg dan specifieke mutaties met behulp van een geneste primer.</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations%3A+Lessons+from+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm%2C+Development+of+the+Pancreas%2C+and+Functionality+of+Pancreatic+%CE%B2+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li>
<li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol wordt het gebruik van CRISPR CAS9 samen met twee ssODN-reparatie sjablonen voor het genereren van specifieke heterozygoot-of homozygoot-genoom veranderingen aangetoond in menselijke pluripotente stamcellen. Deze methode resulteerde in de succesvolle generatie van isogene cellijnen die heterozygoot genomische veranderingen uitdrukken met een efficiëntie dicht bij 10%. Dit protocol is geoptimaliseerd voor zowel menselijke Esc's en iPSCs geteeld op bestraalde Mef's die celgroei en overleving ondersteunen na ...

Menselijke embryonale stamcellen (hescs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) zijn waardevolle hulpmiddelen voor het modelleren van menselijke ziekten als gevolg van hun vernieuwings capaciteit, met behoud van de mogelijkheid om celtypen van verschillende lijn afstanden te genereren1,2 ,3,4. Deze modellen openen de mogelijkheid om de genfunctie te interromen en te begrijpen hoe specifieke mutaties en fenotypes gerelateerd zijn aan verschillende ziekten5,6. Echter, om te begrijpen hoe een specifieke wijziging is gekoppeld aan een bepaald fenotype, is het gebruik van een gepaarde isogene controle en Mutante cellijnen belangrijk om te controleren op lijn tot lijn variabiliteit7,8. Transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen (TALENs) en zink vinger nucleasen zijn gebruikt voor het genereren van inbrengen of verwijderen (indels) mutaties in diverse genetische modellen, met inbegrip van primaire cellen; maar deze nucleasen kunnen omslachtig te gebruiken en duur9,10,11,12,13,14. De ontdekking van de geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalings (CRISPR)-CAS9 Nuclease heeft het veld veranderd als gevolg van efficiëntie in Indel-vorming in vrijwel elke regio van het genoom, eenvoud van gebruik en reductie in kosten15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Een uitdaging bij het gebruik van de op crispr CAS9 gebaseerde genoom Editing-technologie is het genereren of corrigeren van specifieke mutaties in één allel zonder een Indel-mutatie te creëren in het tweede allel20. Het belangrijkste doel van dit protocol is om deze uitdaging te overwinnen door gebruik te maken van twee enkel-streng oligonucleotide (ssODN) reparatie templates om Indel vorming in het tweede allel te verminderen. Beide ssODNs zijn ontworpen om stille mutaties te bevatten om hersnijden door de CAS9 Nuclease te voorkomen, maar slechts één bevat de verandering van belang. Deze methode verhoogt de efficiëntie van het genereren van een specifieke heterozygoot genetische modificatie zonder het induceren van Indel vorming in het tweede allel. Met behulp van dit protocol tonen genbewerkingsexperimenten in zes onafhankelijke genomische locaties de precieze introductie van de gewenste genomische verandering in één allel zonder Indel-vorming in het tweede allel en treedt op met een totale efficiëntie van ~ 10%. Het beschreven protocol is aangepast van Maguire et al.21.

<table><tbody><tr><td>5-ml polystyreen buis met ronde bodem en cel-strainer dop</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6-wells polystyreen weefselkweekschalen</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AflII restrictie-endonuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) apparaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel extractie kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB agar platen bevattende 50 &mu;g/ml kanamycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine Stem Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Murine embryonale fibroblasten (MEFs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel Extractie en PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Orbitaal schuddende incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCas9_GFP vector</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>PCR stripbuizen</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase en 5&times; Phusion buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen 19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM elektrocompetente Escherichia coli cellen</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van gedefinieerde genomische modificaties met crispr cas9 in menselijke pluripotente stamcellen

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Menselijke pluripotente stamcellen bieden een krachtig systeem om de genfunctie te bestuderen en specifieke mutaties te modelleren die relevant zijn voor de ziekte. Het genereren van precieze heterozygoot genetische modificaties is uitdagend als gevolg van CRISPR CAS9 gemedieerde Indel vorming in het tweede allel. Hier demonstreren we een protocol om deze moeilijkheid te helpen overwinnen door twee reparatie sjablonen te gebruiken waarin slechts één de gewenste sequentie wijziging tot uitdrukking brengt, terwijl beide templates stille mutaties bevatten om hersnijden en Indel vorming te voorkomen. Deze methodologie is het meest voordelig voor genbewerkings coderings gebieden van DNA om isogene controle en Mutant menselijke stamcellijnen te genereren voor het bestuderen van menselijke ziekten en biologie. Daarnaast is optimalisatie van transfectie-en screenings methodieken uitgevoerd om de arbeid en de kosten van een genbewerkingsexperiment te verminderen. Over het algemeen is dit protocol algemeen toepasbaar op vele genoom bewerkings projecten met gebruikmaking van het menselijke pluripotente stamcel model.

Generatie gRNAs en screening voor indels
Elke gRNA wordt gekloond in een plasmide vector en uitgedrukt met de promotor U6. Het AFLII restrictie-enzym wordt gebruikt voor het linealiseren van het plasmide (addgene #41824) en bevindt zich na de promotor U6. De 100 BP-band gegenereerd na het gloeien van de 2 60 BP oligos wordt gekloond in de gRNA expressie vector met behulp van de DNA-verzameling. Zodra de gRNA plasmiden worden gegenereerd, worden ze omgezet in hESCs of ...

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

De studie van genfunctie en ziekte wordt belemmerd door de outbred aard van de menselijke bevolking. De verschillende genetische achtergronden van patiëntspecifieke en controle-iPS-cellijnen kunnen de differentiatie-efficiëntie en fenotypes in een bepaalde functionele test beïnvloeden. Gebruik van genetisch identieke of isogene lijnen waarbij het enige verschil is dat de specifieke mutatie van belang van cruciaal belang is om deze problemen te overwinnen.Veel menselijke ziekten worden veroorzaakt door heterozygootmutaties, die moeilijk te genereren zijn met het CRISPR-Cas9-systeem. Dit is te wijten aan de generatie van indel mutaties in het niet-gerichte allel dat kan optreden bij zeer hoge frequentie. Onze techniek overwint dit probleem door gebruik te maken van twee reparatiesjablonen waarvan er slechts één de mutatie van belang koestert.Elke onderzoeker probeert deze techniek moet worden bedreven in de menselijke pluripotente stamcelcultuur. De video demonstratie van kolonie plukken zal nuttig zijn om de juiste grootte en morfologie te tonen, evenals de techniek die wordt gebruikt voor het plukken en screening. Het demonstreren van deze procedure zal Leo Cardenas zijn.Om te beginnen, plaat menselijke ESCs op bestraalde MEF's in een 6-put plaat. Bereid de transfectie master mix. Meng door pipetting en incubeer op kamertemperatuur gedurende 15 minuten.Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%samenvloeiing, voeg dan de transfectie master mix drop verstandig om elke put met cellen en uitbroeden op 37 graden Celsius gedurende 48 uur. Verander de media om de 24 uur. Om de cellen te oogsten, broedt eerst de cellen met Triple E gedurende drie minuten bij kamertemperatuur om MEF's enzymatisch te verwijderen.Voeg 0,5 milliliter HESC medium toe met 10 micromolar ROCK remmer. Pelletcellen op 300 keer g gedurende drie minuten en opnieuw op te schorten in 0,5 milliliter menselijk ESC-medium met 10 micromolar ROCK-remmer. Filter de celsuspensie in een buis van vijf milliliter door een 35 micron cel zeefdop.Met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsorde, poort op levende cellen en sorteren van de groene fluorescerende eiwit-positieve cellen. Breng vervolgens maximaal 1,5 keer 10 over naar de vier gesorteerde cellen rechtstreeks in een schaal van 10 centimeter bedekt met één tot drie keldermembraanmatrix en bestraalde MEF's en menselijk ESC-medium met ROCK-remmer. Verander medium dagelijks met behulp van de menselijke ESC medium zonder ROCK remmer.Na 10 tot 15 dagen, kolonies zijn ongeveer een tot twee millimeter in diameter. Gebruik onder een microscoop een P200 pipet om een enkele kloon zorgvuldig te schrapen en cellen in de pipet te trekken. Verspreid de cellen in een put van een 96-put plaat door zachtjes drie tot vier keer pipetten in het medium opgesteld met de kolonie.Kies vervolgens 20 kolonies voor elke gids RNA en afzien in PCR strip buizen voor screening. Pellet de cellen door centrifugatie op 10.000 keer G gedurende vijf minuten. Nu, incubeercelpellets in 20 microliter van Proteinase K buffer om DNA en vortex krachtig te isoleren.Centrifuge op 10.000 keer G gedurende vijf minuten. Voer vervolgens screening PCR van het bewerkte DNA uit. Voeg in de buizen 20 microliters van een master mix, met inbegrip van voorwaartse en omgekeerde primers, ontworpen om het gebied van belang te versterken, evenals vijf microliters van de Proteinase K digest.Gebruik genomisch DNA geïsoleerd van de controle iPSC lijn om een schone amplicon te bevestigen bij het uitvoeren van de screening PCR. Evalueer grootteveranderingen van PCR-producten na een uur elektroforese bij 70 tot 90 volt op een volume van 2,5% agarose gel. Elk verschil in grootte is indicatief voor decolleté.Om de single streng oligo DNA en de CRISPR-Cas9 plasmiden transfecteren, plaat de doelcel lijn in een 6-well schotel op bestraalde MEF's te bereiken 70 tot 80%samenvloeiing na meer dan een nachtelijke incubatie. Stel de transfectiereactie in zoals beschreven. Meng de reactie door pipetting en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.Voeg vervolgens de transfectiereactie mengsel drop verstandig aan de cellen. Bereid de cellen na 48 uur voor op celsordening zoals voorheen. Ongeveer 10 dagen na het plating van enkele cellen, gebruik maken van een 200 microliter pipet om kolonies te halen in PCR strip buizen en in een put van een 12-well plaat voorgecoat met gelatine en MEFs.Breng 100 microliter van de cellen over naar elke put van een 24- of 48-putplaat, die eerder is bekleed met gelatine en bestraalde MEF's in menselijk ESC-medium met ROCK-remmer. Gebruik de resterende 100 microliter voor DNA-isolatie. Om te controleren op succesvolle integratie van de single streng oligo DNA, neem vijf microliter van DNA geïsoleerd van elke kolonie om PCR uit te voeren met behulp van de screening primers eerder ontworpen.Zuiveren van de PCR-producten en bereid de 40 microliters van beperking enzym spijsvertering met behulp van de unieke enzym site gemaakt in de single streng oligo DNA. Meng de reactie door pipetting en incubbateren op de aanbevolen temperatuur van de fabrikant gedurende een tot drie uur. Visualiseer vervolgens de verteerde PCR-producten die worden toegevoegd met een ladingskleurstof met een volume van 1,5% ethidium bromide agarosegel, elektroforens op 80 tot 100 volt gedurende 40 minuten.Als succesvolle integratie van de single streng oligo DNA heeft plaatsgevonden, sequentie specifieke mutaties met behulp van een geneste primer. In deze studie, voor gids RNA bouw, een 100 base paar band werd verwijderd uit een 1,5%agarose gel. Na celtransfectie werd de validatie van het snijden van gids RNA gevisualiseerd met behulp van een 2,5%agarose gel.Een 180 base pair PCR product toonde een onbesneden controle en verschillende klonen met bandverschuivingen die indelvorming aangeven. Verschillende gids RNAs had verschillende snijden efficiëntie. Om te voorkomen dat CRISPR-Cas9 de bewerkte allelen opnieuw snijdt, werd de PAM-sequentie gewijzigd met behulp van een G tot A stille mutatie.Een stille mutatie in de PAM-sequentie genereerde een unieke beperkingsplaats, die helpt om te screenen op succesvolle integratie in een of twee allelen. Genoom bewerkte stamcellijnen kunnen worden gebruikt in downstream differentiaties en functionele tests om het effect van een bepaalde mutatie op de menselijke ontwikkeling en ziekte te bestuderen. Deze methodologie maakt het mogelijk om isogene cellijnen te genereren met een specifieke heterozygoot of homozygoot mutaties, die betrokken zijn bij een breed scala aan menselijke ziekten.Deze ziektemodellen maken de weg vrij voor de ontwikkeling van nieuwe cellulaire therapieën en bieden platforms voor het ontdekken van geneesmiddelen.

generation-defined-genomic-modifications-using-crispr-cas9-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

This video demonstrates a technique of zinc-finger nuclease-based genome editing in human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs can potentially be differentiated into various cell types, this technology is helpful for in vitro pathological and pharmacological studies in a patient-specific manner.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: A Technique for Modifying Genome in Human Pluripotent Stem Cells by Double-Stranded Homology Dependant Repair Mechanism

Genoombewerkingstools zoals het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem hebben de efficiëntie van gentargeting in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) aanzienlijk verbeterd. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van een lijnspecifiek hiPSC-reporter met behulp van CRISPR/Cas systeem-ondersteunde homologe recombinatie.

Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Hier wordt beschreven, is een protocol voor tagging endogeen uitgedrukt eiwitten met fluorescerende codes in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9. Vermoedelijk bewerkte cellen zijn verrijkt door fluorescentie geactiveerd cel Sorteren en klonen cellijnen worden gegenereerd.

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

Het protocol beschrijft methoden voor geclusterde, regelmatig tussenliggende korte palindromale herhalingen (CRISPR)-gebaseerde epigenoombewerking in menselijke cellijnen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectie.

CRISPR-epigenoombewerking in menselijke cellen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectieafgifte

Leer CRISPR-Cas9 genoombewerking in menselijke pluripotente stamcellen voor het genereren van heterozygote en homozygote mutaties. Deze methode verbetert de efficiëntie en minimaliseert ongewenste indel-mutaties.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen