Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

De studie van genfunctie en ziekte wordt belemmerd door de outbred aard van de menselijke bevolking. De verschillende genetische achtergronden van patiëntspecifieke en controle-iPS-cellijnen kunnen de differentiatie-efficiëntie en fenotypes in een bepaalde functionele test beïnvloeden. Gebruik van genetisch identieke of isogene lijnen waarbij het enige verschil is dat de specifieke mutatie van belang van cruciaal belang is om deze problemen te overwinnen.

Veel menselijke ziekten worden veroorzaakt door heterozygootmutaties, die moeilijk te genereren zijn met het CRISPR-Cas9-systeem. Dit is te wijten aan de generatie van indel mutaties in het niet-gerichte allel dat kan optreden bij zeer hoge frequentie. Onze techniek overwint dit probleem door gebruik te maken van twee reparatiesjablonen waarvan er slechts één de mutatie van belang koestert.

Elke onderzoeker probeert deze techniek moet worden bedreven in de menselijke pluripotente stamcelcultuur. De video demonstratie van kolonie plukken zal nuttig zijn om de juiste grootte en morfologie te tonen, evenals de techniek die wordt gebruikt voor het plukken en screening. Het demonstreren van deze procedure zal Leo Cardenas zijn.

Om te beginnen, plaat menselijke ESCs op bestraalde MEF's in een 6-put plaat. Bereid de transfectie master mix. Meng door pipetting en incubeer op kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%samenvloeiing, voeg dan de transfectie master mix drop verstandig om elke put met cellen en uitbroeden op 37 graden Celsius gedurende 48 uur. Verander de media om de 24 uur. Om de cellen te oogsten, broedt eerst de cellen met Triple E gedurende drie minuten bij kamertemperatuur om MEF's enzymatisch te verwijderen.

Voeg 0,5 milliliter HESC medium toe met 10 micromolar ROCK remmer. Pelletcellen op 300 keer g gedurende drie minuten en opnieuw op te schorten in 0,5 milliliter menselijk ESC-medium met 10 micromolar ROCK-remmer. Filter de celsuspensie in een buis van vijf milliliter door een 35 micron cel zeefdop.

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsorde, poort op levende cellen en sorteren van de groene fluorescerende eiwit-positieve cellen. Breng vervolgens maximaal 1,5 keer 10 over naar de vier gesorteerde cellen rechtstreeks in een schaal van 10 centimeter bedekt met één tot drie keldermembraanmatrix en bestraalde MEF's en menselijk ESC-medium met ROCK-remmer. Verander medium dagelijks met behulp van de menselijke ESC medium zonder ROCK remmer.

Na 10 tot 15 dagen, kolonies zijn ongeveer een tot twee millimeter in diameter. Gebruik onder een microscoop een P200 pipet om een enkele kloon zorgvuldig te schrapen en cellen in de pipet te trekken. Verspreid de cellen in een put van een 96-put plaat door zachtjes drie tot vier keer pipetten in het medium opgesteld met de kolonie.

Kies vervolgens 20 kolonies voor elke gids RNA en afzien in PCR strip buizen voor screening. Pellet de cellen door centrifugatie op 10.000 keer G gedurende vijf minuten. Nu, incubeercelpellets in 20 microliter van Proteinase K buffer om DNA en vortex krachtig te isoleren.

Centrifuge op 10.000 keer G gedurende vijf minuten. Voer vervolgens screening PCR van het bewerkte DNA uit. Voeg in de buizen 20 microliters van een master mix, met inbegrip van voorwaartse en omgekeerde primers, ontworpen om het gebied van belang te versterken, evenals vijf microliters van de Proteinase K digest.

Gebruik genomisch DNA geïsoleerd van de controle iPSC lijn om een schone amplicon te bevestigen bij het uitvoeren van de screening PCR. Evalueer grootteveranderingen van PCR-producten na een uur elektroforese bij 70 tot 90 volt op een volume van 2,5% agarose gel. Elk verschil in grootte is indicatief voor decolleté.

Om de single streng oligo DNA en de CRISPR-Cas9 plasmiden transfecteren, plaat de doelcel lijn in een 6-well schotel op bestraalde MEF's te bereiken 70 tot 80%samenvloeiing na meer dan een nachtelijke incubatie. Stel de transfectiereactie in zoals beschreven. Meng de reactie door pipetting en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.

Voeg vervolgens de transfectiereactie mengsel drop verstandig aan de cellen. Bereid de cellen na 48 uur voor op celsordening zoals voorheen. Ongeveer 10 dagen na het plating van enkele cellen, gebruik maken van een 200 microliter pipet om kolonies te halen in PCR strip buizen en in een put van een 12-well plaat voorgecoat met gelatine en MEFs.

Breng 100 microliter van de cellen over naar elke put van een 24- of 48-putplaat, die eerder is bekleed met gelatine en bestraalde MEF's in menselijk ESC-medium met ROCK-remmer. Gebruik de resterende 100 microliter voor DNA-isolatie. Om te controleren op succesvolle integratie van de single streng oligo DNA, neem vijf microliter van DNA geïsoleerd van elke kolonie om PCR uit te voeren met behulp van de screening primers eerder ontworpen.

Zuiveren van de PCR-producten en bereid de 40 microliters van beperking enzym spijsvertering met behulp van de unieke enzym site gemaakt in de single streng oligo DNA. Meng de reactie door pipetting en incubbateren op de aanbevolen temperatuur van de fabrikant gedurende een tot drie uur. Visualiseer vervolgens de verteerde PCR-producten die worden toegevoegd met een ladingskleurstof met een volume van 1,5% ethidium bromide agarosegel, elektroforens op 80 tot 100 volt gedurende 40 minuten.

Als succesvolle integratie van de single streng oligo DNA heeft plaatsgevonden, sequentie specifieke mutaties met behulp van een geneste primer. In deze studie, voor gids RNA bouw, een 100 base paar band werd verwijderd uit een 1,5%agarose gel. Na celtransfectie werd de validatie van het snijden van gids RNA gevisualiseerd met behulp van een 2,5%agarose gel.

Een 180 base pair PCR product toonde een onbesneden controle en verschillende klonen met bandverschuivingen die indelvorming aangeven. Verschillende gids RNAs had verschillende snijden efficiëntie. Om te voorkomen dat CRISPR-Cas9 de bewerkte allelen opnieuw snijdt, werd de PAM-sequentie gewijzigd met behulp van een G tot A stille mutatie.

Een stille mutatie in de PAM-sequentie genereerde een unieke beperkingsplaats, die helpt om te screenen op succesvolle integratie in een of twee allelen. Genoom bewerkte stamcellijnen kunnen worden gebruikt in downstream differentiaties en functionele tests om het effect van een bepaalde mutatie op de menselijke ontwikkeling en ziekte te bestuderen. Deze methodologie maakt het mogelijk om isogene cellijnen te genereren met een specifieke heterozygoot of homozygoot mutaties, die betrokken zijn bij een breed scala aan menselijke ziekten.

Deze ziektemodellen maken de weg vrij voor de ontwikkeling van nieuwe cellulaire therapieën en bieden platforms voor het ontdekken van geneesmiddelen.