Stepwise Dosing Protocol voor verhoogde doorvoer in label-vrije impedance-based GPCR-tests

Dit protocol maakt het mogelijk om een volledige functionele concentratieresponsrelatie van GPCR-agonist uit één celpopulatie op te nemen en biedt gedetailleerde agonistische karakterisering, zelfs voor lage celmonsternummers. Het belangrijkste voordeel van seriële dosering is de toename van de doorvoer, omdat een enkele put voldoende is voor een volledige concentratieresponsanalyse. Deze techniek is zeer geschikt om enkele transductie te bestuderen in zeldzame en complexe biologische modellen, zoals organ-on-chip formaten in gesloten microfluidic containers.

Het protocol is niet moeilijk uit te voeren, mits de juiste apparatuur beschikbaar is. Het voorbereiden van de verschillende GPCR ligand oplossingen op de juiste concentratie is de sleutel tot succes. Michael Skiba, een afgestudeerde student, en Anne Mildner, een student, van ons laboratorium zal de procedure aan te tonen.

Voor celzaaien op de elektrode arrays, voeg de juiste concentratie van cellen aan de putten van elke elektrode array, en laat de cellen homogeen te vestigen op de put bodems gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Na ten minste 36 uur in een standaard celkweek incubator op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, inspecteer de cellagen door fase-contrast microscopie om een volledige dekking van elke elektrode met cellen te garanderen. Vervang vervolgens het celkweekmedium in elke put door het juiste volume van voorverwarmd, serumvrij medium.

Om een impedantieopname te starten, plaatst u de elektrodearray in de verbindingsarrayhouder van de impedantieanalyzer en bevestigt u een goed contact met lage impedantie tussen de elektroden en de impedantieanalyzer. Selecteer het elektrodetype en/of multi-well formaat in de gebruikersinterface van de software. Als er één- en meervoudige frequentie gegevensverwervingsmodi beschikbaar zijn en het aantal te analyseren putten laag is of de tijdresolutie niet van cruciaal belang is, selecteert u meerdere frequentieopnamen.

Als u een maximale tijdsresolutie wilt garanderen, selecteert u één bewakingsfrequentie. Begin vervolgens met het verzamelen van de tijdscursusgegevens en selecteer de gegevensmap voor waar u de gegevens opslaan. De impedantiemetingen worden geregistreerd op het opgegeven aantal frequenties voor elke put Om het serie-toevoegingprotocol in de agonistische modus voor een acht-well array te starten, voeg 30 microliters van de laagste concentratie van de agonist van belang toe aan de cellen.

Laat de cellen vervolgens reageren en equilibrate voor de vooraf bepaalde periode voordat u 30 microliter van de op een na hoogste concentratie toevoegt totdat elke seriële verdunning van de agonist is toegevoegd. Als u de gegevens wilt analyseren, trekt u de impedantie van het laatste gegevenspunt vóór de eerste toevoeging van agonistische oplossing af en stelt u de tijd van bijtellingsn nul in om de impedantiewaarden te normaliseren. Plot de tijdsloop van genormaliseerde impedantie en plot de individuele tijdcursussen om de maxima in impedantie na elke toevoegingsstap te identificeren.

Stel een gegevensblad samen met deze waarden en plot de waarden van maximale impedantieverandering als functie van de agonistische concentratie. Gebruik vervolgens een data-fitting routine om de half-maximale effectieve concentraties en maximale respons te bepalen met behulp van de vier-parameter logistieke model. In dit representatieve experiment werden 10 oplossingen met toenemende histamineconcentraties om de 15 minuten achtereenvolgens aan de cellen toegevoegd en werd de verandering in impedantie op elk moment gemeten.

De impedantieveranderingen kunnen dan worden uitgezet als functie van de histamineconcentratie en de overdrachtsfunctie van een logistiek model met vier parameters dat is gemonteerd op de experimentele gegevenspunten uit zeven putten. Om rekening te houden met mogelijke histamine receptor downregulation, cel desensibilisatie, of overstimulatie, kan het gegevensbereik voor de analyse worden verminderd, zoals getoond voor dit enkele seriële doseren experiment. Optimalisatie met drie parameters kan vervolgens worden toegepast op de gegevens, wat een half-maximale effectieve concentratie van 0,75 plus of min 0,12 micromolar biedt voor deze analyse.

De toevoeging van de histamine receptor antagonistische difenhydramine 20 minuten voor de eerste histamine resulteert in een vertraagde toename van impedantie binnen de seriële dosering regeling, wat overeenkomt met de noodzaak van een hogere agonist om een celrespons uit te lokken. In de dosisresponsrelatie wordt het effect van de antagonist uitgedrukt als een rechtse verschuiving van de krommen, wat overeenkomt met een toename van de half-maximale effectieve concentratie, mits de antagonist een concurrerende ligand is ten opzichte van de agonist. Succesvolle toepassing van de seriële doseerschema is technisch eenvoudig, maar vereist doordachte planning, omdat het een uitdaging is om alle stappen met de juiste timing uit te voeren.

Seriële doseren heeft de weg vrijgemaakt voor het uitvoeren van concentratieresponsstudies met andere uitleessystemen die beperkt zijn met betrekking tot het aantal parallel gevolgde monsters. De bijzondere voordelen van seriële doseren maken de studie van receptor-gemedieerde signaaltransductie mogelijk met volledig nieuwe uitlezingen die gevoelig zijn voor andere fenotypische veranderingen, zoals cytomechanica. Draag handschoenen en veiligheidsbrillen bij het voorbereiden van de voorraadoplossingen van de receptoradester, omdat ze gevaarlijk kunnen zijn bij inademing of ingeslikt.