Karakteriseren single-molecule conformatieveranderingen onder schuifstroom met fluorescentiemicroscopie

Het kwantificeren van de conformatieveranderingen in enkele biomoleculen onder schuifstroom is nuttig voor het begrijpen van de functie en biofysica van macromoleculen zoals eiwitten en DNA. Fluorescentiemicroscopie maakt real-time in-situ visualisatie van enkele moleculen in fysiologische stroomomgevingen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie mogelijk. Dit is ongeëvenaard door andere technieken zoals AFM.

Door het karakteriseren van de afschuifkracht waaronder eiwitten ons DNA globale conformatieveranderingen hebben, kan men geneesmiddelen die deze biofysische eigenschappen nabootsen beter ontwerpen. Dit protocol kan op grote schaal worden toegepast om het gedrag of andere polymeren, met name biopolymeren, in verschillende stromingsomstandigheden te bestuderen en de reologie van complexe vloeistoffen te onderzoeken. De timing van stappen is van cruciaal belang voor succes.

We raden het beoefenen van de microfluïde apparaat oppervlaktebehandeling en fluorescentie microscopie stappen vele malen uit te voeren op een efficiënte manier. Het vastleggen van conformatieveranderingen in biomoleculen is een visueel en dynamisch fenomeen dat het best op film te zien is. Wetenschappers zullen deze methode beter begrijpen na het zien van de real-time eiwit- en DNA-microscopie gepresenteerd in deze video.

Om het microfluidic apparaat voor te bereiden, voegt u vijf delen siliconene elastomeerbasis toe aan een deel uithardingsmiddel in een weegboot. en roer de inhoud grondig gedurende een minuut om een voorharde PDMS-oplossing te creëren. Plaats de master siliconen wafer in een plastic petrischaal en giet de PDMS-oplossing over de wafer om een vijf millimeter laag te creëren.

Bedek de schotel en laat het in een desiccator onder vacuüm voor een uur om luchtbellen te verwijderen. Dan incubeer de overdekte Petri schotel op 60 graden Celsius 's nachts om de PDMS te genezen in een flexibele vaste stof, die zal resulteren in microfluïde kanalen worden gegoten in de PDMS op de PDMS wafer interface. Gebruik de volgende dag een scheermes om rechthoeken van 20 bij 10 millimeter rond elk microfluïdisch kanaal in het PDMS te snijden en de rechthoekige blokken met een pincet te verwijderen.

Gebruik een 25-gauge stompe eindnaald met geslepen randen om een gat met een diameter van 0,5 millimeter aan de ene kant van het kanaal te slaan, om ervoor te zorgen dat het gat volledig door het PDMS-blok gaat. Gebruik een dunne naald om de PDMS uit het gat te slaan en herhaal het proces aan de andere kant van het kanaal. Plaats het PDMS-blok met de kanaalzijde omhoog en de coverslip in de kamer van een plasmabindmachine en start de behandeling.

Wanneer de behandeling is voltooid, plaats het PDMS-blok snel op een coverslip, zodat het kanaal in contact komt met de slip. Druk uitoefenen op de randen van het blok, plaats dan de coverslip PDMS assemblage op een hete plaat op 115 graden Celsius gedurende 15 minuten om de permanente binding te versterken. Tot slot, steek een 10-centimeter lang.

0,25 millimeter binnendiameter buis in het uitlaatgat aan de bovenkant van het PDMS blok om vloeistof gemakkelijk uit het kanaal te laten stromen. Voor von Willebrand factor of VWF experimenten injecteren tot 10 microliter van 10 microgram per milliliter BSA-Biotine opgelost in steriele 1X PBS in de inlaat van het microfluïde apparaat. Steek een paar microliter BSA-Biotine in de pipetpunt na injectie en laat de punt in de inlaat blijven zitten.

Laat de BSA-Biotine twee uur in het apparaat uitbroeden, wat ertoe leidt dat BSA niet specifiek aan het dekselvlak bindt. Verwijder vervolgens de pipetpunt en injecteer tot 10 microliter caseïneblokkeringsoplossing in het kanaal. Laat de caseïneoplossing 30 minuten uitbroeden, zodat het alle vrije plaatsen kan blokkeren en niet-specifieke binding van de biomoleculen aan het oppervlak kan verminderen.

Verwijder de tip en injecteer tot 10 microliter streptavidin in steriele PBS in het kanaal, dat zich bindt aan de biotinegroepen van de BSA-Biotine. Vervolgens injecteren tot 10 microliter wasmiddel oplossing weg te wassen overtollige streptavidin. Verwijder de tip en injecteer vwf in caseïne oplossing of lambda DNA.

Incubbate VWF gedurende drie minuten of lambda DNA gedurende 45 minuten. Injecteer vervolgens vijf millimolar vrije biotine om de overtollige streptavidin bindingsplaatsen te blokkeren. Laad een milliliter caseïneblokkerende oplossing in een spuit en zet deze vast in een spuitpomp.

Bevestig vervolgens een uiteinde van de slang aan de spuitnaald en stroom in de oplossing om luchtbellen te verwijderen. Ongeveer drie minuten na de vrije biotine-injectie bevestigt u het andere uiteinde van de buis aan de inlaat van het microfluïde apparaat. Selecteer de hoogste vergrotingsdoelstelling van de TIRF- of confocale fluorescentiemicroscoop.

Voeg indien nodig een druppel onderdompelingsolie toe aan het doel. Plaats het microfluïde apparaat op het microscooppodium, zodat de coverslip gelijk is met het doel. Start helder-veld microscopie en pas de focus, zodat functies zoals puin en bellen zichtbaar zijn.

Pas vervolgens het stadium in de X- en Y-richtingen aan totdat de rand van het microfluïde kanaal zichtbaar is en het frame doorsnijdt. Schakel over naar het FITC-kanaal en pas de Z-hoek en de TIRF-hoek zo nodig aan totdat de afzonderlijke groene bolvormige moleculen kunnen worden onderscheiden. Pas laserintensiteit en belichtingstijd aan om fluorescerende moleculen te visualiseren zonder ze te snel te fotobleachen.

Pas vervolgens het contrast aan om de moleculen beter te visualiseren. Precies vijf minuten na de vrije biotine injectie start en stop stroom van de spuitpomp om de veranderingen in moleculaire conformatie met behulp van stroomsnelheden tussen 5000 en 30.000 microliter per uur te observeren. Met VWF is het van cruciaal belang om ten minste een kleine hoeveelheid stroom toe te passen, zoals 30 seconden van 10.000 microliter per uur stroom precies vijf minuten na de vrije biotine injectie.

Herhaal dit in verschillende gebieden van het microfluïde apparaat en lokaliseren moleculen die kunnen uitbreiden en ontspannen op meerdere cycli van het starten en stoppen van de stroom. Merk op hoe lang het duurt voordat moleculen een maximale uitbreiding bereiken en volledige ontspanning en video's opnemen van het continue gedrag van moleculen onder schuifstroom. De flexibiliteit van een molecuul om bevestiging te veranderen wordt vaak aangetoond door zijn vermogen om te verlengen als hogere schuifsnelheden worden toegepast als gevolg van toenemende stroom.

De uitbreiding versus afschuifsnelheid curve van een von Willebrand factor molecuul is nuttig voor het karakteriseren van de biomechanische eigenschappen van het eiwit. Fluorescentie microscopie beelden van lambda DNA tonen eveneens verhoogde uitbreiding op hogere afschuifsnelheden bij 30 seconden en geleidelijke ontspanning meer dan twee minuten na stroom wordt gestopt. Bij het werken met VWF, vergeet niet om het uit te broeden slechts voor drie minuten en gratis biotine gedurende vijf minuten voor het starten van de stroom.

Dit is van cruciaal belang voor het vormen van het optimale getal of biotine-streptavidin koppelingen die nodig zijn voor omkeerbare ontrafeling. Deze methode kan worden aangepast om real-time interacties tussen meerdere biomoleculen te visualiseren en hun functies te karakteriseren. Zo zou men de vorming van bloedplaatjesplug's beter kunnen begrijpen door vwf te visualiseren die met hoge afschuif en de binding ervan met het bloedplaatjesathesiemolecuul GPIb-alpha met deze methode wordt gevisualiseerd.