Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Hier gebruikten we fret met één molecuul en sitespecifieke eiwitetikettering via een natuurlijke aminozuurincorporatie om de conformatiedynamiek van mGluR2 te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de eiwitdynamiek te bestuderen zonder de eiwitstructuur te verstoren. Atomaire structuur geeft een statisch beeld van een eiwit.

Single-molecule FRET stelt ons echter in staat om het volledige bereik van eiwitbewegingen in realtime en oplossing te visualiseren. Deze methode kan worden toegepast om de dynamiek van elk eiwit te bestuderen. Bovendien kan een natuurlijke aminozuurincorporatie worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties en de engineering van synthetische receptoren te bestuderen.

Het laden van monsters en het optimaliseren van beeldvorming vereist geduld en oefening. Markeer om te beginnen gaten die op de glazen glijbaan moeten worden geboord met een marker. Gebruik een Dremel om kleine gaatjes op de glijbaan te boren terwijl de glijbaan in water wordt gedompeld.

Soniceer de dia's en bedek slips in aceton gedurende 30 minuten in een bad sonicator bij 23 graden Celsius. Gooi aceton van de glijbaan en dek slippotten af. Spoel grondig af met water en soniceer gedurende 30 minuten in kaliumhydroxide van vijf kiezen.

Spoel vervolgens de dia's af en dek de slip af met water en soniceer gedurende twee minuten in methanol. Laat de potten gevuld met methanol tot de aminoverziltingsstap. Giet vers bereid aminoverziltingsmengsel in de dia en dek slippotten af.

Incubeer, soniceer en incubeer opnieuw de dia's en dek slips af in een aminoverziltingsmengsel voordat u de oplossing weggooit. Was vervolgens de potten met methanol voordat je ze met water vult. Spoel vervolgens de dia's af met water.

Droog ze met luchtblazen en plaats ze in de montagedozen. Breng 60 milliliter PEGylation-oplossing aan op de dia en plaats er een afdekslip op. Markeer de niet-PEGylated kant voor opslag.

Na incubatie voorzichtig demonteren en de dia's afspoelen en slippen afdekken met water. Droog ze vervolgens door lucht te blazen en plaats ze in een steriele buis van 50 milliliter met het PEGylated oppervlak van elkaar af gericht. Na het passeren van HEK 293T-cellen met 0,05% trypsine-EDTA, zaait u de cellen op poly-L / D-lysine cover slips.

Plaats de standaardmedia met AZP-aangevulde media voor groeiende cellen en metabotrope glutamaatreceptor 2 of mGluR2-expressie. Transfecteer vervolgens de cellen met een transfectiereagens en incubeer gedurende 24 uur voordat het medium wordt vervangen met verse AZP-aangevulde media. Was de coverslips 20 minuten voor het etiketteren met alkyncyyaninekleurstoffen twee keer met warme Opnamebuffer of RB en plaats ze in een warm standaardmedium zonder AZP.

Verwijder vervolgens de standaardmedia en was de cellen met RB voordat u de vers bereide etiketteringsoplossing toevoegt. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius in het donker. Verwijder na incubatie de etiketteringsoplossing.

Was de afdekslip met getransfecteerde cellen tweemaal met de RB en hang opnieuw in hetzelfde medium. Pelleteer vervolgens de cellen door gedurende vijf minuten op 1.000 g bij vier graden Celsius te draaien en verwijder het supernatant voordat de pellet opnieuw wordt gesuspendeerd in 80 tot 130 microliter van de lysisoplossing. Breek de pellet door te pipetteren.

Wikkel het vervolgens in folie en plaats het op de rocker op vier graden Celsius gedurende 30 minuten tot een uur om de cellen te lyseren. Pelleteer de onoplosbare fractie door centrifugering bij 20.000 g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Breng het supernatant vervolgens over in een verse koude buis en bewaar het op ijs.

Haal de schuif en de deksel slip uit de vriezer en laat ze in het donker op kamertemperatuur opwarmen. Monteer de kamer door de stroken dubbelzijdige tape tussen de schuif en de afdekslip te plaatsen, zodat de PEGylated oppervlakken de binnenkant van de stroomkamer vormen. Druk met behulp van een pipetpunt op de afdekslip om ervoor te zorgen dat de tape contact maakt met de afdekslip en schuif.

Breng epoxy aan op de randen van de dia. Breng 40 microliter 500 nanomolaire NeutrAvidin aan op elke baan en incubeer in een bevochtigde donkere doos. Was na twee minuten elke kamerstrook met 100 microliter T50-buffer.

Voeg vervolgens 20 nanomolaire gebiotinyleerde antilichaamoplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten voordat u wordt gewassen met 200 microliter T50-buffer per baan. Zet de computer en microscoop aan. Zet vervolgens de lasers aan om op te warmen.

Schakel vervolgens de EMCCD-camera in en open de software. Monteer de monsterkamer op de microscoopfase en voeg het eiwitmonster geleidelijk toe om ongeveer 400 moleculen per gezichtsveld te bereiken. Was de kamer met 100 microliter beeldbuffer aangevuld met 0,3 eenheden protocatechuaat 3, 4-dioxygenase.

Pas de versterking, acquisitiesnelheid en laservermogens aan om fluorescentiesignalen met één molecuul te detecteren in zowel het donor- als het acceptantenkanaal. Prikkel vervolgens de donor en verkrijg tijdsporen totdat 80% van de donormoleculen in het gezichtsveld zijn gefotobleacheerd. Schakel aan het einde van de film de 640-nanometer laser in om de acceptant direct te prikkelen totdat sommige moleculen zijn gefotobleacheerd.

Verander het gezichtsveld en herhaal de stappen voor excitatie van donor en acceptant om drie films per aandoening te verzamelen. Voor het selecteren van FRET-sporen van één molecuul van deeltjespluk, selecteert u de sporen waarbij de totale intensiteit van donor- en acceptantensporen in de loop van de tijd stabiel is. Selecteer vervolgens de sporen met anti-gecorreleerde veranderingen in donor- en acceptantenintensiteiten.

Selecteer de donor- en acceptantenmoleculen met eenstapsfotobleaching en sporen van meer dan vijf seconden lang. Bereken het FRET-tekort. Identificeer ten slotte de conformatietoestand door Hidden Markov Modeling of HMM door de stappen te volgen die in het manuscript worden beschreven.

De etikettering van AZP door cyaninekleurstoffen werd bereikt door een kopergekatalyseerde cycloadditionreactie en resulteerde in effectieve plasmamembraanetikettering van 548UAA met de celoppervlakpopulatie gelabeld met donor- en accepterfluorforen. Bij SDS-PAGE elektroforese werd een enkele band bij 250 kilodalton waargenomen in HEK 293T-cellen die 548UAA tot expressie brachten, wat samenviel met het dimerische mGluR2 over de volledige lengte. Representatieve selectieve sporen voor meerdere kortlevende en langlevende bleekgebeurtenissen voor donoren en acceptanten worden hier getoond.

Conformatietoestanden werden geïdentificeerd met behulp van HMM-analyse. Overgangen tussen discrete FRET-toestanden werden geëxtraheerd uit de geïdealiseerde pasvormen en uitgezet als een warmtekaart met overgangsdichtheid. De geïdealiseerde FRET-sporen leveren ook informatie op over de verblijftijd voor elke geïdentificeerde bevestiging.

De sporen van het enkele molecuul met donor- en acceptantenkanaal worden hier weergegeven. Verder onthult enkel molecuul FRET vier conformatietoestanden van het mGluR2 cysteïnerijke domein. Efficiënte piekconservering is essentieel voor het naar beneden trekken van één molecuul en tijdens dit proces moet voorzichtig worden omgegaan.

Bovendien moet het zuurstofopruimmiddel onmiddellijk voorafgaand aan de beeldvorming worden toegevoegd. Deze etiketteringsmethode en fret-experimenten met één molecuul zijn toegepast op meerdere receptoren en hebben nieuwe inzichten opgeleverd in het mechanisme van receptoractivering en modulatie van de receptorfunctie.